최근 몇 년 동안, 세포 크기의 지질 이중층 소포 내 캡슐화는 시험관내 재구성 실험에 유용한 방법임이 입증되었다. 우리가 제시하는 방법은 합성 세포 연구에서 세포 골격 재구성에 크게 도움이 될 것입니다. 이 방법을 사용하면 이질적으로 크기가 큰 거대한 unilamellar 소포를 높은 수율로 생성 할 수 있습니다.
베시클 생성 시간은 종래의 cDICE 기술에 비해 현저히 감소하였다. 우리는 분자 경로를 검사하기 위해 복잡하고 동시에 발생하는 세포 과정에서 분리 된 무세포 전사 번역 시스템을 캡슐화 할 수 있습니다. 이 방법은 기능적 합성 세포를 만들기 위해 최소한의 프로토 세포를 조립하는 데 사용할 수 있습니다.
디올레오일포스포콜린, 콜레스테롤 및 로다민 PE를 15밀리리터 유리 바이알로 옮겨 오일-지질 혼합물 제조를 시작하십시오. 그런 다음 바이알에 클로로포름 0.5 밀리리터를 넣으십시오. 별도의 15 밀리리터 튜브에 7.2 밀리리터의 실리콘 오일과 1.8 밀리리터의 미네랄 오일을 피펫하고 10 초 동안 분당 3, 200 회전의 속도로 볼텍싱하여 오일을 혼합합니다.
이어서, 지질 및 클로로포름 혼합물을 함유하는 바이알에 오일 혼합물을 첨가하고, 지질이 오일에 완전히 용해되지 않기 때문에 생성된 지질-중-유내 혼합이 약간 흐려질 때까지 10 내지 15초 동안 분당 3, 200 회전의 속도로 혼합물을 와류시킨다. 다음으로, 실온에서 30 분 동안 80 와트의 초음파 전력과 40 킬로헤르츠의 작동 주파수를 갖는 욕조 초음파 처리기에서 오일 분산액의 지질을 초음파 처리하십시오. 즉시 사용하지 않으면 지질-오일 혼합물을 섭씨 4도에서 24시간 동안 보관한다.
소포를 생성하려면 벤치탑 교반판에 장착된 검은색 수지로 만든 3D 프린트 샤프트와 함께 조립품을 분당 1, 200회 회전하는 속도로 사용하십시오. 그런 다음, 투명 수지로 만든 3D 프린팅된 연속 액적 계면 교차 캡슐화 또는 cDICE 챔버를 블랙 수지 샤프트 상에 장착한다. 10%ATO 488 액틴을 포함하는 구상액틴 완충액 또는 G 완충액 중에 1-내지 10-마이크로몰 액틴 용액을 제조한다.
액틴 중합을 시작하려면, 얼음 위의 액틴 용액에 필라멘트성 액틴 중합 완충액 또는 F 완충제를 첨가한 다음, 용액을 얼음 위에 유지하여 가교제를 첨가하기 전에 액틴 중합을 늦추십시오. 액틴 결합 단백질 또는 ABPs를 제조하기 위해, 파신 스톡의 밀리리터 당 1.75 밀리그램에서, 분취량 1.57 마이크로리터의 파신을 별도의 마이크로튜브에 넣는다. 다음으로, 액틴 용액에 7.5%의 밀도 구배 매질을 첨가하여 외부와 내부 수성상 사이에 밀도 구배를 만들고 거대한 일라멜라 소포 또는 GUV, 침강을 촉진한다.
그런 다음 외부 용액으로 200 밀리몰 포도당 700 마이크로 리터를 챔버 내로 분배하십시오. 챔버의 60% 내지 80%가 채워질 때까지 챔버에 충분한 지질-오일 혼합물을 첨가한다. 지질-오일 혼합물과 외부 용액 사이에 계면이 형성될 것이다.
ABPs를 액틴 용액 내로 옮기어 액틴-ABP 혼합물을 준비한다. 이어서, 규칙적인 100-내지 1, 000-마이크로리터 피펫을 사용하여 700 마이크로리터의 지질-오일 혼합물을 액틴-ABP 혼합물 내로 옮긴다. 피펫을 8회 위아래로 피펫하여 직경 7 내지 100 미크론의 세포 크기의 지질 단층 에멀젼 액적을 생성한다.
동일한 100 ~ 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 전체 에멀젼을 회전 챔버에 분배하십시오. 액적은 오일-외부 용액 계면에서 지질 단일층을 횡단하여 지질의 두 번째 전단지를 획득하여 GUVs를 형성합니다. 완료되면, 교반 플레이트로부터 챔버를 제거하고, 챔버를 폐기물 용기 내의 틸팅함으로써 대부분의 지질-오일 혼합물을 버린다.
뚜껑이 안쪽을 향하도록 챔버를 잡고 챔버 뚜껑을 열고 챔버를 안쪽으로 약간 기울이십시오. GUVs를 함유하는 외부 용액과 지질-오일 혼합물 사이의 계면은 뚜껑이 위치한 챔버 개구부로부터 볼 수 있을 것이다. 피펫을 사용하여 GUV를 포함하는 충분한 외부 용액을 수집하고 50 ~ 300 마이크로리터의 외부 용액을 96-웰 플레이트에 분배하여 적절한 밀도의 GUV를 얻습니다.
GUV를 이미징하려면 오일 침지 60X 대물 렌즈가 장착된 반전 현미경 무대에 96웰 플레이트를 설치하십시오. 이미지 처리 소프트웨어인 ImageJ Fiji에서 관심 있는 이미지 시퀀스를 열고 가장 높은 강도의 이미지를 식별합니다. Control Shift C 키를 누른 채 밝기 및 대비 창을 열고 재설정 탭을 클릭합니다.
ImageJ 피지 메뉴에서 분석 및 배율 설정 탭으로 이동하여 각 이미지 픽셀에 대해 알려진 물리적 거리와 단위를 입력합니다. 완료되면 이미지, 스택 및 3D 프로젝트 버튼으로 이동하여 Z 스택에서 3D 이미지를 재구성하십시오. 투영 방법을 밝기 점으로 설정하고 슬라이스 간격을 0.5마이크로미터로 설정한 다음 보간 상자를 선택합니다.
나머지 설정에 대해 기본 옵션을 사용하고 이미지를 캡처합니다. 대표적인 이미지는 캡슐화된 파신-액틴 다발을 갖는 로다민 PE 표지된 GUVs의 공초점 이미지를 보여준다. 액틴 결합 단백질을 액틴 용액으로 옮긴 다음, 지질-오일 혼합물을 첨가하고 지질 단층 액적의 생성은 캡슐화 전에 액틴 네트워크의 형성을 피하기 위해 몇 초 안에 일어나야 한다.
우리는이 수정 된 cDICE 기술을 사용하여 액틴 네트워크를 구성하는 데 다른 액틴 넷 크로스 링커의 역할을 조사했습니다. 우리는이 방법이 다른 연구자들이 다른 세포 골격 단백질의 조절을 탐구하는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.
