학습과 기억은 동물이 끊임없이 변화하는 환경을 효율적으로 탐색하여 생존하고 번식하는 데 필수적입니다. 또한 신경 과학에서 연구되는 주요 과목 중 하나입니다. Caenorhabditis elegans는 신경계의 단순성 때문에 학습과 기억 연구에 매력적인 유기체입니다.
화학 및 전기 배선도도 완전히 재구성되었습니다. Caenorhabditis elegans의 행동 분석은 매우 까다 롭고 화학적, 기계적 및 온도 스트레스와 같은 여러 매개 변수의 영향을받습니다. 시작하려면 0.2ml의 E.coli OP50 액체 배양액을 Luria-Bertani 배지에 뿌리고 실온에서 24 시간 이상 배양하지 않고 6cm 선충 성장 배지 또는 NGM 플레이트를 준비하십시오.
첫째 날, 백금 벌레 피커로 6cm NGM 플레이트에 잘 먹은 중력 동물 5마리를 골라 놓고 실온에서 3시간 동안 약 50개의 알을 낳게 하여 동기화된 성체 동물 개체군을 얻습니다. 알을 낳는 것을 멈추려면 백금 벌레 피커로 접시에서 부모 동물을 제거하십시오. 약 5 일 동안 실온에서 동물을 재배하여 젊은 성인 단계가 아닌 성숙한 성인 단계에 도달합니다.
5 일 후, 피펫 팁과 같은 플라스틱 표면에 동물이 부착되는 것을 방지하는 0.25 % 수성 젤라틴 1 밀리리터로 각 플레이트를 세척하여 동물 수집기에서 약 200 마리의 성체 동물을 수집합니다. 그런 다음 수집기를 10 밀리리터의 이중 증류수에서 두 번 위아래로 부드럽게 움직여 동물을 세척하십시오. 이 과정을 두 번 반복하십시오.
pH 4에서 1%1-프로판올과 염산의 혼합물 40ml에 약 200마리의 동물이 들어 있는 동물 수집기를 결정화 접시에 1초 동안 부드럽게 담그십시오. 10 밀리리터의 이중 증류수를 함유하는 그의 6-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 콜렉터를 매우 부드럽게 한번 침지시켜 콜렉터에서 동물을 세척한다. 그런 다음 수집기를 6cm NGM 플레이트의 E.coli OP50 잔디밭에 10 분 동안 놓아 동물이 휴식을 취하도록합니다.
다음으로, 수집기를 위아래로 부드럽게 움직여 10 밀리리터의 이중 증류수로 수집기의 동물을 씻으십시오. 이 세척을 세 번 반복하고 화학 주성 분석을 진행합니다. 앞에서 설명한 것처럼 프로판올 혼합물과 이중 증류수로 수집기에서 동물을 순차적으로 세척합니다.
다음으로 수집기를 NGM 한천의 E.coli OP50 잔디밭에 놓고 6cm 페트리 접시에 담아 10 분 동안 동물들이 휴식을 취하도록합니다. 다음으로, 박테리아 오염을 방지하기 위해 이중 증류수 10ml에 수집기를 2회 위아래로 부드럽게 움직여 동물을 세 번 세척하고 화학주성 분석을 진행합니다. 6 센티미터 플라스틱 페트리 접시에서 화학 주성 분석을위한 오거 플레이트를 준비하십시오.
그런 다음 1mm 이상의 개구부를 가진 톱질 된 피펫 팁을 사용하여 수집기에서 1 밀리리터의 0.25 % 수성 젤라틴을 포함하는 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 동물을 옮깁니다. 동물이 중력에 의해 튜브의 바닥에 침전 된 후, 튜브에서 상청액을 제거하십시오. 화학주성 분석 버퍼 1밀리리터에 동물을 재현탁시키고 중력에 의해 튜브 바닥에 약 1분 동안 가라앉힙니다.
그런 다음 피펫팅으로 가능한 한 많은 상청액을 제거합니다. 다음으로, 두 곳에서 4 마이크로 리터의 5 % 수성 1- 프로판올을 대각선으로 발견 한 다음 페트리 플레이트의 다른 두 곳에서 4 마이크로 리터의 이중 증류수를 발견합니다. 그런 다음 1mm 개구부가 있는 톱질된 피펫 팁을 사용하여 3개의 플레이트 중앙에 약 60마리의 동물이 포함된 화학주성 분석 버퍼에서 6마이크로리터의 동물 현탁액을 찾습니다.
동물을 만지지 않고 실험실 조직 심지로 가능한 한 액체를 제거하십시오. 접시에 뚜껑을 덮고 동물들이 실온에서 10 분 동안 접시 위에서 자유롭게 움직일 수 있도록하십시오. 화학 주성을 멈추려면이 접시를 얼음 위의 유리 페트리 접시에 3 분 동안 옮깁니다.
다음으로, 접시에있는 동물의 수를 셀 때까지 접시를 냉장고에 넣으십시오. 실체 현미경으로 중심 원에있는 동물을 제외한 4 개의 섹션에서 동물의 수를 세고 방정식을 사용하여 화학 주성 지수를 계산합니다. 화학주성 지수값으로부터, 학습지수값을 기준동물의 화학주성지수값과 조건화된 동물의 화학주성지수값 사이의 차이로서 계산한다.
화학주성 분석에서 1-프로판올과 염산의 혼합물로 조절된 동물은 한천 플레이트에서 발견된 5%1-프로판올에 끌리지 않는 반면, 순진한 동물과 기준 동물은 5%1-프로판올에 끌렸습니다. 수성 1-프로판올과 염산의 혼합물로 이격 훈련에 의해 조절된 동물은 1%1-프로판올 또는 염산 또는 이중 증류수로만 처리된 동물에 비해 더 이상 5%1-프로판올에 끌리지 않았습니다. 기억에 대한 돌연변이의 영향을 연구 한 결과, 단기 및 장기 기억 형성은 동물의 고전적 조건화에 필수적인 역할을하는 유전자에 의존한다는 것이 밝혀졌습니다.
각 컨디셔닝 후, 동물은 이중 증류수로 한 번만 부드럽게 씻어야합니다. 절차를 사용하여 장기 기억이 형성된 후 칼슘 영상과 전기 생리학은 기억을 담당하는 신경 회로를 식별 할 수 있습니다. 유전 및 단일 뉴런 분석을 통해 기억 저장 및 검색 과정을 분자 및 단일 세포 수준에서 해결할 수 있습니다.
