우리 모두는 콜드 웰 연구소 회원의 협력 정신을 인정하고 싶습니다. 천의 월, 국립 과학 재단에서 GAC에 직업 상부터 바질 오코너 학술 상뿐만 아니라, 하워드 휴즈 의학 연구소에서 앨러배마 대학 학사 연구 과학 프로그램 그랜트의 연결을 흥분과이 자금이 콜드웰 연구소의 간질 연구.

Aldicarb 노출 패러다임 <ol><li> 첫날, 각 유전자형의 각 복제의 적어도 30 젊은 성인 단계 웜은 두 번째 하루에 aldicarb assays에 대해 사용할 수 있는지 확인하십시오. 실험자들이 E.를 포함하는 신선한 NGM 플레이트에 오십 이상 L4 무대 웜을 (최고 nystatin 제외), 선택한다면 그것은 최고 식품 소스로 대장균 (선호 OP50), 그리고 일관성 있고 허용 온도 (20 ° 22 ° C 25 ° C 괜찮 있지만 C는 최고입니다.)에서 12-24시간 그들을 성장 </li><li> 두 번째 날, 70 % 에탄올 (EtOH) 30 % ddH 2 O.과 aldicarb의 100 MM 주식 솔루션을 원하는 aldicarb의 농도를 달성하기 위해 정의된 볼륨 NGM 마이너스 nystatin 접시에 aldicarb의 해당 금액을 확산. 우리는 지속적으로 7.5 ML의 NGM 플레이트에 도금 100 MM의 aldicarb의 37.5 μL를 0.5 MM의 aldicarb를 사용합니다. aldicarb 플레이트는 실온에서 약 30~60분에 대한 건조하실 수 있습니다. 그것은 피부를 깰 필요는 없습니다. 또는 aldicarb은 NGM에 추가하고 4 ° C 일주일 동안 저장할 수 있습니다. &nbsp;</li><li> E.의 건조, 접시 일관성있는 볼륨 후 각 aldicarb 판의 중심과 실온에서 다른 30-60분에 대한 건조에 대장균 (선호 OP50). 인구 과잉없이 작은 자리에 집중 벌레를 유지하기 위해 충분히 크기의 음식 론을 만들어 우리는 지속적으로 판 OP50 25 μL를. &nbsp;</li><li> 음식 잔디가 건조되면, 하나는 aldicarb의 assays 진행됩니다. aldicarb의 assays의 주관적 특성으로 인해, 그것은 매우 실험은 &quot;맹목적으로&quot;수행하는 것이 좋습니다. 기본 실험자의 동료 assayed 수 벌레와 함께 원래의 접시를 다시 레이블 수 있습니다. 마찬가지로, 동료는 타이머를 시작하기 전에 즉시 원래의 접시에서 계산된 aldicarb 플레이트로 웜을 전송 수 있습니다. 실험자 이러한 uncoordination 같은 특성 표현형와 벌레의 특정 긴장을 시금 예상한다면, 역시 편견을 줄이기 위해 유사한 표현형있는 컨트롤이 있어야합니다. 또한 실험자들이 assays 실험을 표준화 도움이 병렬로 야생 형 변형뿐만 아니라 저항 변형과 지나치게 긴장을하면 좋습니다. 실험자는 각 복제에 대한 웜의 일관된 번호를 분석하기 위해 노력한다. 우리는 지속적으로 각 복제에 대한 단일 유전자형 서른 벌레를 분석할 수 있습니다. 우리는 또한 적어도 세를 수행하면 각 실험에 대한 복제. 경험 실험자 한 번에 최소 6 계통을 분석 할 수 있어야합니다. &nbsp;</li><li> 백금 와이어 각 벌레 일관된 방식으로 괴롭히는 의해 마비 벌레의 수를 계산합니다. 우리는 지속적으로 두 번 머리에 두 번 꼬리 3 시간 총 30 분 간격에 우리의 벌레를 찌르다. pharyngeal 펌프의 정지 또한 실험자 모든 assays 이상 마비의 일관된 정의를 고용하는 경우에만 마비를 정의하는 데 사용하지만 수 있습니다. 또한, 특히 일부 웜, aldicarb에 강한하는 사람이 접시를 크롤 링을 시도할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 경우에는 실험자의 aldicarb 접시 주위에, 팔미트산, 웜 운동에 대한 물리적 장벽의 일관된 금액을 확산 수 있습니다. 우린 10 MG 팔미트산 / ML EtOH 25 μL를 확산. </li></ol> PTZ 노출 패러다임 <ol><li> 첫날, 각 유전자형의 각 복제의 적어도 30 젊은 성인 단계 웜은 두 번째 날에 PTZ의 assays에 대해 사용할 수 있는지 확인하십시오. 실험자들이 E.를 포함하는 신선한 NGM 플레이트에 오십 이상 L4 무대 웜을 (최고 nystatin 제외), 선택한다면 그것은 최고 식품 소스로 대장균 (선호 OP50), 그리고 일관성 있고 허용 온도 (20 ° 22 ° C 25 ° C 괜찮 있지만 C는 최고입니다.)에서 12-24시간 그들을 성장 </li><li> 둘째 날에는, PTZ의 0.5 g PTZ / ML ddH 2 O 주식 솔루션을합니다. 원하는 PTZ의 농도를 달성하기 위해 NGM 마이너스 정의된 볼륨 nystatin 플레이트에 PTZ의 해당 금액을 확산. 우리가 PTZ에 대한 선량 - 반응 assays을 선호하기 때문에, 우리는 플레이트 7.5 ML의 NGM 플레이트에 PTZ의 양의 변화. 예를 들어, 한 접시 7.5 ML의 NGM 판에 PTZ 주식 솔루션의 37.5 μL 수 있습니다 5 MG PTZ / ML 솔루션을 만들 수 있습니다. PTZ 플레이트는 실온에서 약 60~1백20분에 대한 건조하실 수 있습니다. 그것은 피부를 깰 필요는 없습니다. 또는, PTZ는 NGM에 직접 추가할 수 있지만, 그것은 바로 응고 후 assays 사용해야합니다. PTZ의 안정성 aldicarb보다 훨씬 적습니다. 따라서, 기존의 PTZ 번호판과 assays 덜 믿을 수 있습니다. PTZ는 사용하기 전에 건조 에이전트와 건조기에서 -20 ° C에서 저장해야합니다. 우리는 안정성을 보장하기 위해 여는 후 약 이개월 PTZ을 삭제하는 것을 선호합니다. </li><li> E.의 건조, 접시 일관성있는 볼륨 후 대장균 (선호 OP50)각 PTZ 플레이트와 실온에서 다른 30-60분에 대한 건조의 중심지로. 인구 과잉없이 작은 자리에 집중 벌레를 유지하기 위해 충분히 크기의 음식 론을 만들어 우리는 지속적으로 판 OP50 25 μL를. &nbsp;</li><li> 음식 잔디가 건조되면, 하나는 PTZ의 assays 진행됩니다. PTZ의 assays가 aldicarb의 assays보다 주관적이지만, 그것은 여전히​​ 매우 실험은 &quot;맹목적으로&quot;수행하는 것이 좋습니다. 기본 실험자의 동료 assayed 수 벌레와 함께 원래의 접시를 다시 레이블 수 있습니다. 마찬가지로, 동료는 타이머를 시작하기 전에 즉시 원래의 접시에서 계산된 PTZ 플레이트로 웜을 전송 수 있습니다. 실험자 이러한 uncoordination 같은 특성 표현형와 벌레의 특정 긴장을 시금 예상한다면, 역시 편견을 줄이기 위해 유사한 표현형있는 컨트롤이 있어야합니다. 또한, 그것은 실험자들이 assays 실험을 표준화 도움이 병렬로 앞쪽에 또는 전신 경련과 야생 타입 변형뿐만 아니라 종자를하면 좋습니다. 실험자는 각 복제에 대한 웜의 일관된 번호를 분석하기 위해 노력한다. 우리는 지속적으로 각 복제에 대한 단일 유전자형 서른 벌레를 분석할 수 있습니다. 우리는 또한 적어도 세를 수행하면 각 실험에 대한 복제. 경험 실험자 한 번에 적어도 세 계통을 분석 할 수 있어야합니다. 벌레가 약물에 적응을 마비되거나, 어떤 경우에, 아직은, 다음 PTZ - 유도된 노출 15-30분 사이에 일반적으로 정상 경련, 그리고 빈도와 강도가 감쇠. </li><li> 1 시간 총 &quot;간질 같은&quot;벌레를 경련을 30 분 간격의 개수를 계산합니다. 그것은 전신 경련, 전신 마비, 우리는 &quot;토닉&quot;전화 또는 조합 벌레의 수를 별도로, 우리는 &quot;머리 밥스&quot;이라고 앞쪽에 경련과 벌레의 수를 점수하는 것이 가장 좋은 방법입니다 우리가 &quot;토닉 - clonic&quot;이라고 BWM 마비와 앞쪽에 경련. 단일 유전자형 대부분의 벌레는 경련의 한 종류를 나타냅니다. 그러나, 토닉 - clonic 벌레들은 종종 완전히 토닉되기 때문에 모든 벌레가 이미 경련을 출품 경우에도 한 30 분 지난 분석을 계속해야합니다. 또한, 일부 웜은 접시를 크롤 링을 시도할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 경우에는 실험자의 PTZ 플레이트 주변 팔미트산의 일관된 금액을 확산 수 있습니다. 우린 10 MG 팔미트산 / ML EtOH 25 μL를 확산. </li></ol> Aldicarb 및 PTZ 선정 C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 행동 응답 <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> 돌연변이 이름 </th><th> 시냅스 역할 </th><th> 약물없는 행동 </th><th> Aldicarb하는 행동 응답 (야생 형에 비해 N2) </th><th> PTZ하는 행동 응답 </th></tr><tr><td> 톰 - 1 (ok188) </td><td> 시냅스 전달을 억제 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 향상된 속도 </td><td> 야생 형에서 분간 </td></tr><tr><td> UNC - 43 (n498n1186) </td><td> 복잡한 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 향상된 속도 </td><td> 전신 경련 </td></tr><tr><td> UNC - 25 (e156) </td><td> GABA 전송을 촉진 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 향상된 속도 </td><td> 앞쪽에 경련, 전신 마비 </td></tr><tr><td> snb - 1 (md247) </td><td> 시냅스 전송을 추진 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 감소 속도 </td><td> 앞쪽에 경련 </td></tr><tr><td> UNC - 4 (e120) </td><td> ACH 전송을 추진 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 감소 속도 </td><td> 야생 형에서 분간 </td></tr></tbody></table> pentylenetetrazole (PTZ)라는 두 개의 신경 자극, aldicarb라는 acetylcholinesterase 억제제, 그리고 GABA 수용체 길항제는, C. 엘레간스 시냅스 전송 돌연변이를 특성화 보완 방식으로 사용할 수 있습니다. 초과 흥분성의 아세틸콜린 (ACH)는 ACH 전송의 부정적인 규제에 해로운 돌연변이에서 웜 몸을 벽 신경근육학 분기점 (NMJs)에 축적 (예 : 톰 - 1과 UNC - 43) 또는 억제 GABA 전송 (예, UNC - 25)의 긍정적인 규제. 반대로, 웜 NMJs에서 흥분성의 ACH 수준은 일반적인 시냅스 전송 (예 : snb - 1) 또는 ACH 특정 전송 유전자 (예 : UNC - 4)의 긍정적인 규제에 해로운 돌연변이에 의해 감소​​됩니다. 인하 흥분성의 ACH 전송과 돌연변이 웜은 aldicarb 유발 마비의 감소 속도를 보여주는 반면에 야생 형 N2 벌레에 비해, NMJs에서 고가 흥분성의 ACH 전송과 돌연변이 벌레는 aldicarb 유발 마비의 향상된 속도를 나타냅니다. PTZ가 aldicarb 달리 C. 엘레간스 신체 벽 근육에의 연결을 synchrony하지 방해 있지만, PTZ는 C. 엘레간스 헤드 근육에서 억제 GABA를 antagonizes. 결과적으로, aldicarb 감도 정확하게 PTZ 민감도를 예측할 수 없습니다. 부정적 또는 긍정적인 regul의 특정 결함 돌연변이 웜ACH 전송 에이션은 PTZ의 존재에 야생 형 N2 벌레에서 구별할 수 있으며, 억제 GABA 전송 전시 강력한 PTZ - 유발 앞쪽에 경련 일반적으로 시냅스 전송 또는 특정 결함 긍정적인 규정에 결함 돌연변이 벌레 반면. 또한, UNC - 43 손실 기능 돌연변이 PTZ의 존재에 전신 경련을 표시하고 가능성이 독특한 약물 반응에 기여하는 추가적인 시냅스 전달 이상을 보유하고 있습니다.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

C.와 aldicarb 노출에 대한 현재 프로토콜 엘레간스는 돌연변이의 두 클래스가 aldicarb에 대한 저항력을 전시 같은 경험은 시냅스 전달의 일반적인 적자와 ACH 전송 및 돌연변이의 구체적인 결손과 돌연변이 사이의 구분을 허용하지 않습니다. 마찬가지로, aldicarb는 돌연변이의 두 클래스가 aldicarb에 과민성을 전시 등 돌연변이 부정적인 ACH 전송을 규제하는 GABA 전송 또는 일반 장애에서 특정 적자가 있는?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

선충류, Caenorhabditis의 엘레간스는 neurotransmission 공부를위한 편법 모델이되었다. 의 신경 계통의 해부와 연결이 전자 micrographs의 결정 및 약리 assays에 의해 정제되어로서 C. 엘레간스은 동물 모델 중 유일하다. 이 비디오에서는, 우리는 특별히 C. 엘레간스 신경근육학 분기점에서 신호 특성화 pentylenetetrazole (PTZ)라는 두 개의 상호 보완적인 신경 자극, aldicarb라는 acetylcholinesterase 억제제, 그리고 감마 aminobutyric 산 (GABA) 수용체 길항제가, 직업을 가지고있을 방법에 대해 설명합니다 (NMJs)과 대립 신경 회로의 우리의 이해를 용이하게합니다. 302 C. 엘레간스 뉴런, 열아홉 GABAergic D - 타입 모터 뉴런 신경을 분포시키다 바디 벽의 근육 (BWMs)의 동안 RMEs라는 네 GABAergic 뉴런, 신경을 분포시키다 머리 근육. 반대로, 서른아홉 모터 신경은 아세틸콜린을 흥분성의 신경 전달 물질을 표현 (ACH), 그리고 운동을 조정할 수 BWMs에서 GABA 전송을 반대. 바디 벽 NMJs에서 GABAergic 및 cholinergic 모터 뉴런의 대립 자연을 처음 레이저 절제에 의해 결정하고 나중에 aldicarb 노출에 의해 buttressed했다. 야생 형 웜의 시간 코스 또는 선량 - 반응 마비의 급성 aldicarb 노출 결과. 적은 ACH가 웜 NMJs에 축적으로하지만, 흥분성의 ACH 전송의 손실이 BWMs 적은 자극에 이르는, aldicarb에 대한 저항력을 수여. aldicarb에 저항이 ACH 특정 또는 일반 시냅스 기능 돌연변이로 관찰 수 있습니다. 대립 GABA와 ACH 전송, GABA 전송의 손실, 또는 부정적인 ACH 릴리스를 조절 실패와 일치, aldicarb에 과민성을 수여. aldicarb 노출이 neurotransmission의 유전자 수많은 웜 homologs의 고립을 주도하고 있지만, aldicarb 노출 혼자 효율적으로 특정 C. 엘레간스 모터 뉴런의 유전자 및 경로에 대한 일반적인 역할을 확인할 수 없습니다. 이러한 목적을 위해, 우리는 PTZ를 사용하는 보완 실험 방법을 도입했습니다. Neurotransmission의 돌연변이 PTZ에 대한 응답으로 aldicarb 유발 마비와는 분명 phenotypes을, 표시됩니다. 야생 형 웜뿐만 아니라, ACH를 해제받을 특정 inabilities과 돌연변이, PTZ에 명백한 감도를 표시하지 않습니다. 그러나, GABA의 돌연변이뿐만 아니라, 일반적인 신경 기능 돌연변이 시간 코스 또는 선량 - 반응 방식으로 앞쪽에 경련을 표시합니다. 부정적인 일반적인 신경 전달 물질 방출을 규제하고, 따라서 수없는 돌연변이 PTZ에 마비되고, BWMs에 ACH의 과도한 금액을 분비. 이산 돌연변이 클래스의 PTZ - 유발 phenotypes는 aldicarb과 C. 엘레간스에서 PTZ 노출 패러다임과 상호 보완적인 접근 방식이 neurotransmission 우리의 이해를 촉진 수 있음을 나타냅니다. 또한, 우리는 약리 assays을 수행하는 방법을 보여주는 동영상은 C. 엘레간스 연구 일관된 방법을 확립해야합니다.

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Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

이 동영상은 선충류, C. 엘레간스의 신경 기능을 연구 보완 방법의 두 신경 자극, aldicarb 및 pentylenetetrazole (PTZ)을 고용하는 방법을 보여줍니다. 이 상호 보완적인 접근 방법은 또한 modulating의 연결 synchrony에 대한 evolutionarily 보존 메커니즘에 대해 설명해 주실 사용 간질과 발작에 대한 의미를 가지고있을 수 있습니다.

C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K 조회수.  University of Alabama. 이 동영상은 선충류, C. 엘레간스의 신경 기능을 연구 보완 방법의 두 신경 자극, aldicarb 및 pentylenetetrazole (PTZ)을 고용하는 방법을 보여줍니다. 이 상호 보완적인 접근 방법은 또한 modulating의 연결 synchrony에 대한 evolutionarily 보존 메커니즘에 대해 설명해 주실 사용 간질과 발작에 대한 의미를 가지고있을 수 있습니다.

비디오: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

의 간질 발작의 돌연변이에 대한 Neurocircuit의 Assays Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해<em&gt; C. 엘레</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...