우리 모두는 콜드 웰 연구소 회원의 협력 정신을 인정하고 싶습니다. 천의 월, 국립 과학 재단에서 GAC에 직업 상부터 바질 오코너 학술 상뿐만 아니라, 하워드 휴즈 의학 연구소에서 앨러배마 대학 학사 연구 과학 프로그램 그랜트의 연결을 흥분과이 자금이 콜드웰 연구소의 간질 연구.

Aldicarb 노출 패러다임 <ol><li> 첫날, 각 유전자형의 각 복제의 적어도 30 젊은 성인 단계 웜은 두 번째 하루에 aldicarb assays에 대해 사용할 수 있는지 확인하십시오. 실험자들이 E.를 포함하는 신선한 NGM 플레이트에 오십 이상 L4 무대 웜을 (최고 nystatin 제외), 선택한다면 그것은 최고 식품 소스로 대장균 (선호 OP50), 그리고 일관성 있고 허용 온도 (20 ° 22 ° C 25 ° C 괜찮 있지만 C는 최고입니다.)에서 12-24시간 그들을 성장 </li><li> 두 번째 날, 70 % 에탄올 (EtOH) 30 % ddH 2 O.과 aldicarb의 100 MM 주식 솔루션을 원하는 aldicarb의 농도를 달성하기 위해 정의된 볼륨 NGM 마이너스 nystatin 접시에 aldicarb의 해당 금액을 확산. 우리는 지속적으로 7.5 ML의 NGM 플레이트에 도금 100 MM의 aldicarb의 37.5 μL를 0.5 MM의 aldicarb를 사용합니다. aldicarb 플레이트는 실온에서 약 30~60분에 대한 건조하실 수 있습니다. 그것은 피부를 깰 필요는 없습니다. 또는 aldicarb은 NGM에 추가하고 4 ° C 일주일 동안 저장할 수 있습니다. &nbsp;</li><li> E.의 건조, 접시 일관성있는 볼륨 후 각 aldicarb 판의 중심과 실온에서 다른 30-60분에 대한 건조에 대장균 (선호 OP50). 인구 과잉없이 작은 자리에 집중 벌레를 유지하기 위해 충분히 크기의 음식 론을 만들어 우리는 지속적으로 판 OP50 25 μL를. &nbsp;</li><li> 음식 잔디가 건조되면, 하나는 aldicarb의 assays 진행됩니다. aldicarb의 assays의 주관적 특성으로 인해, 그것은 매우 실험은 &quot;맹목적으로&quot;수행하는 것이 좋습니다. 기본 실험자의 동료 assayed 수 벌레와 함께 원래의 접시를 다시 레이블 수 있습니다. 마찬가지로, 동료는 타이머를 시작하기 전에 즉시 원래의 접시에서 계산된 aldicarb 플레이트로 웜을 전송 수 있습니다. 실험자 이러한 uncoordination 같은 특성 표현형와 벌레의 특정 긴장을 시금 예상한다면, 역시 편견을 줄이기 위해 유사한 표현형있는 컨트롤이 있어야합니다. 또한 실험자들이 assays 실험을 표준화 도움이 병렬로 야생 형 변형뿐만 아니라 저항 변형과 지나치게 긴장을하면 좋습니다. 실험자는 각 복제에 대한 웜의 일관된 번호를 분석하기 위해 노력한다. 우리는 지속적으로 각 복제에 대한 단일 유전자형 서른 벌레를 분석할 수 있습니다. 우리는 또한 적어도 세를 수행하면 각 실험에 대한 복제. 경험 실험자 한 번에 최소 6 계통을 분석 할 수 있어야합니다. &nbsp;</li><li> 백금 와이어 각 벌레 일관된 방식으로 괴롭히는 의해 마비 벌레의 수를 계산합니다. 우리는 지속적으로 두 번 머리에 두 번 꼬리 3 시간 총 30 분 간격에 우리의 벌레를 찌르다. pharyngeal 펌프의 정지 또한 실험자 모든 assays 이상 마비의 일관된 정의를 고용하는 경우에만 마비를 정의하는 데 사용하지만 수 있습니다. 또한, 특히 일부 웜, aldicarb에 강한하는 사람이 접시를 크롤 링을 시도할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 경우에는 실험자의 aldicarb 접시 주위에, 팔미트산, 웜 운동에 대한 물리적 장벽의 일관된 금액을 확산 수 있습니다. 우린 10 MG 팔미트산 / ML EtOH 25 μL를 확산. </li></ol> PTZ 노출 패러다임 <ol><li> 첫날, 각 유전자형의 각 복제의 적어도 30 젊은 성인 단계 웜은 두 번째 날에 PTZ의 assays에 대해 사용할 수 있는지 확인하십시오. 실험자들이 E.를 포함하는 신선한 NGM 플레이트에 오십 이상 L4 무대 웜을 (최고 nystatin 제외), 선택한다면 그것은 최고 식품 소스로 대장균 (선호 OP50), 그리고 일관성 있고 허용 온도 (20 ° 22 ° C 25 ° C 괜찮 있지만 C는 최고입니다.)에서 12-24시간 그들을 성장 </li><li> 둘째 날에는, PTZ의 0.5 g PTZ / ML ddH 2 O 주식 솔루션을합니다. 원하는 PTZ의 농도를 달성하기 위해 NGM 마이너스 정의된 볼륨 nystatin 플레이트에 PTZ의 해당 금액을 확산. 우리가 PTZ에 대한 선량 - 반응 assays을 선호하기 때문에, 우리는 플레이트 7.5 ML의 NGM 플레이트에 PTZ의 양의 변화. 예를 들어, 한 접시 7.5 ML의 NGM 판에 PTZ 주식 솔루션의 37.5 μL 수 있습니다 5 MG PTZ / ML 솔루션을 만들 수 있습니다. PTZ 플레이트는 실온에서 약 60~1백20분에 대한 건조하실 수 있습니다. 그것은 피부를 깰 필요는 없습니다. 또는, PTZ는 NGM에 직접 추가할 수 있지만, 그것은 바로 응고 후 assays 사용해야합니다. PTZ의 안정성 aldicarb보다 훨씬 적습니다. 따라서, 기존의 PTZ 번호판과 assays 덜 믿을 수 있습니다. PTZ는 사용하기 전에 건조 에이전트와 건조기에서 -20 ° C에서 저장해야합니다. 우리는 안정성을 보장하기 위해 여는 후 약 이개월 PTZ을 삭제하는 것을 선호합니다. </li><li> E.의 건조, 접시 일관성있는 볼륨 후 대장균 (선호 OP50)각 PTZ 플레이트와 실온에서 다른 30-60분에 대한 건조의 중심지로. 인구 과잉없이 작은 자리에 집중 벌레를 유지하기 위해 충분히 크기의 음식 론을 만들어 우리는 지속적으로 판 OP50 25 μL를. &nbsp;</li><li> 음식 잔디가 건조되면, 하나는 PTZ의 assays 진행됩니다. PTZ의 assays가 aldicarb의 assays보다 주관적이지만, 그것은 여전히​​ 매우 실험은 &quot;맹목적으로&quot;수행하는 것이 좋습니다. 기본 실험자의 동료 assayed 수 벌레와 함께 원래의 접시를 다시 레이블 수 있습니다. 마찬가지로, 동료는 타이머를 시작하기 전에 즉시 원래의 접시에서 계산된 PTZ 플레이트로 웜을 전송 수 있습니다. 실험자 이러한 uncoordination 같은 특성 표현형와 벌레의 특정 긴장을 시금 예상한다면, 역시 편견을 줄이기 위해 유사한 표현형있는 컨트롤이 있어야합니다. 또한, 그것은 실험자들이 assays 실험을 표준화 도움이 병렬로 앞쪽에 또는 전신 경련과 야생 타입 변형뿐만 아니라 종자를하면 좋습니다. 실험자는 각 복제에 대한 웜의 일관된 번호를 분석하기 위해 노력한다. 우리는 지속적으로 각 복제에 대한 단일 유전자형 서른 벌레를 분석할 수 있습니다. 우리는 또한 적어도 세를 수행하면 각 실험에 대한 복제. 경험 실험자 한 번에 적어도 세 계통을 분석 할 수 있어야합니다. 벌레가 약물에 적응을 마비되거나, 어떤 경우에, 아직은, 다음 PTZ - 유도된 노출 15-30분 사이에 일반적으로 정상 경련, 그리고 빈도와 강도가 감쇠. </li><li> 1 시간 총 &quot;간질 같은&quot;벌레를 경련을 30 분 간격의 개수를 계산합니다. 그것은 전신 경련, 전신 마비, 우리는 &quot;토닉&quot;전화 또는 조합 벌레의 수를 별도로, 우리는 &quot;머리 밥스&quot;이라고 앞쪽에 경련과 벌레의 수를 점수하는 것이 가장 좋은 방법입니다 우리가 &quot;토닉 - clonic&quot;이라고 BWM 마비와 앞쪽에 경련. 단일 유전자형 대부분의 벌레는 경련의 한 종류를 나타냅니다. 그러나, 토닉 - clonic 벌레들은 종종 완전히 토닉되기 때문에 모든 벌레가 이미 경련을 출품 경우에도 한 30 분 지난 분석을 계속해야합니다. 또한, 일부 웜은 접시를 크롤 링을 시도할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 경우에는 실험자의 PTZ 플레이트 주변 팔미트산의 일관된 금액을 확산 수 있습니다. 우린 10 MG 팔미트산 / ML EtOH 25 μL를 확산. </li></ol> Aldicarb 및 PTZ 선정 C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 행동 응답 <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> 돌연변이 이름 </th><th> 시냅스 역할 </th><th> 약물없는 행동 </th><th> Aldicarb하는 행동 응답 (야생 형에 비해 N2) </th><th> PTZ하는 행동 응답 </th></tr><tr><td> 톰 - 1 (ok188) </td><td> 시냅스 전달을 억제 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 향상된 속도 </td><td> 야생 형에서 분간 </td></tr><tr><td> UNC - 43 (n498n1186) </td><td> 복잡한 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 향상된 속도 </td><td> 전신 경련 </td></tr><tr><td> UNC - 25 (e156) </td><td> GABA 전송을 촉진 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 향상된 속도 </td><td> 앞쪽에 경련, 전신 마비 </td></tr><tr><td> snb - 1 (md247) </td><td> 시냅스 전송을 추진 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 감소 속도 </td><td> 앞쪽에 경련 </td></tr><tr><td> UNC - 4 (e120) </td><td> ACH 전송을 추진 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 감소 속도 </td><td> 야생 형에서 분간 </td></tr></tbody></table> pentylenetetrazole (PTZ)라는 두 개의 신경 자극, aldicarb라는 acetylcholinesterase 억제제, 그리고 GABA 수용체 길항제는, C. 엘레간스 시냅스 전송 돌연변이를 특성화 보완 방식으로 사용할 수 있습니다. 초과 흥분성의 아세틸콜린 (ACH)는 ACH 전송의 부정적인 규제에 해로운 돌연변이에서 웜 몸을 벽 신경근육학 분기점 (NMJs)에 축적 (예 : 톰 - 1과 UNC - 43) 또는 억제 GABA 전송 (예, UNC - 25)의 긍정적인 규제. 반대로, 웜 NMJs에서 흥분성의 ACH 수준은 일반적인 시냅스 전송 (예 : snb - 1) 또는 ACH 특정 전송 유전자 (예 : UNC - 4)의 긍정적인 규제에 해로운 돌연변이에 의해 감소​​됩니다. 인하 흥분성의 ACH 전송과 돌연변이 웜은 aldicarb 유발 마비의 감소 속도를 보여주는 반면에 야생 형 N2 벌레에 비해, NMJs에서 고가 흥분성의 ACH 전송과 돌연변이 벌레는 aldicarb 유발 마비의 향상된 속도를 나타냅니다. PTZ가 aldicarb 달리 C. 엘레간스 신체 벽 근육에의 연결을 synchrony하지 방해 있지만, PTZ는 C. 엘레간스 헤드 근육에서 억제 GABA를 antagonizes. 결과적으로, aldicarb 감도 정확하게 PTZ 민감도를 예측할 수 없습니다. 부정적 또는 긍정적인 regul의 특정 결함 돌연변이 웜ACH 전송 에이션은 PTZ의 존재에 야생 형 N2 벌레에서 구별할 수 있으며, 억제 GABA 전송 전시 강력한 PTZ - 유발 앞쪽에 경련 일반적으로 시냅스 전송 또는 특정 결함 긍정적인 규정에 결함 돌연변이 벌레 반면. 또한, UNC - 43 손실 기능 돌연변이 PTZ의 존재에 전신 경련을 표시하고 가능성이 독특한 약물 반응에 기여하는 추가적인 시냅스 전달 이상을 보유하고 있습니다.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

C.와 aldicarb 노출에 대한 현재 프로토콜 엘레간스는 돌연변이의 두 클래스가 aldicarb에 대한 저항력을 전시 같은 경험은 시냅스 전달의 일반적인 적자와 ACH 전송 및 돌연변이의 구체적인 결손과 돌연변이 사이의 구분을 허용하지 않습니다. 마찬가지로, aldicarb는 돌연변이의 두 클래스가 aldicarb에 과민성을 전시 등 돌연변이 부정적인 ACH 전송을 규제하는 GABA 전송 또는 일반 장애에서 특정 적자가 있는?...

<table><tbody><tr><td>Aldicarb</td><td>Reagent</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>PS734</td><td>Purchasable from Sigma</td></tr><tr><td>Pentylenetetrazole</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr></tbody></table>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

선충류, Caenorhabditis의 엘레간스는 neurotransmission 공부를위한 편법 모델이되었다. 의 신경 계통의 해부와 연결이 전자 micrographs의 결정 및 약리 assays에 의해 정제되어로서 C. 엘레간스은 동물 모델 중 유일하다. 이 비디오에서는, 우리는 특별히 C. 엘레간스 신경근육학 분기점에서 신호 특성화 pentylenetetrazole (PTZ)라는 두 개의 상호 보완적인 신경 자극, aldicarb라는 acetylcholinesterase 억제제, 그리고 감마 aminobutyric 산 (GABA) 수용체 길항제가, 직업을 가지고있을 방법에 대해 설명합니다 (NMJs)과 대립 신경 회로의 우리의 이해를 용이하게합니다. 302 C. 엘레간스 뉴런, 열아홉 GABAergic D - 타입 모터 뉴런 신경을 분포시키다 바디 벽의 근육 (BWMs)의 동안 RMEs라는 네 GABAergic 뉴런, 신경을 분포시키다 머리 근육. 반대로, 서른아홉 모터 신경은 아세틸콜린을 흥분성의 신경 전달 물질을 표현 (ACH), 그리고 운동을 조정할 수 BWMs에서 GABA 전송을 반대. 바디 벽 NMJs에서 GABAergic 및 cholinergic 모터 뉴런의 대립 자연을 처음 레이저 절제에 의해 결정하고 나중에 aldicarb 노출에 의해 buttressed했다. 야생 형 웜의 시간 코스 또는 선량 - 반응 마비의 급성 aldicarb 노출 결과. 적은 ACH가 웜 NMJs에 축적으로하지만, 흥분성의 ACH 전송의 손실이 BWMs 적은 자극에 이르는, aldicarb에 대한 저항력을 수여. aldicarb에 저항이 ACH 특정 또는 일반 시냅스 기능 돌연변이로 관찰 수 있습니다. 대립 GABA와 ACH 전송, GABA 전송의 손실, 또는 부정적인 ACH 릴리스를 조절 실패와 일치, aldicarb에 과민성을 수여. aldicarb 노출이 neurotransmission의 유전자 수많은 웜 homologs의 고립을 주도하고 있지만, aldicarb 노출 혼자 효율적으로 특정 C. 엘레간스 모터 뉴런의 유전자 및 경로에 대한 일반적인 역할을 확인할 수 없습니다. 이러한 목적을 위해, 우리는 PTZ를 사용하는 보완 실험 방법을 도입했습니다. Neurotransmission의 돌연변이 PTZ에 대한 응답으로 aldicarb 유발 마비와는 분명 phenotypes을, 표시됩니다. 야생 형 웜뿐만 아니라, ACH를 해제받을 특정 inabilities과 돌연변이, PTZ에 명백한 감도를 표시하지 않습니다. 그러나, GABA의 돌연변이뿐만 아니라, 일반적인 신경 기능 돌연변이 시간 코스 또는 선량 - 반응 방식으로 앞쪽에 경련을 표시합니다. 부정적인 일반적인 신경 전달 물질 방출을 규제하고, 따라서 수없는 돌연변이 PTZ에 마비되고, BWMs에 ACH의 과도한 금액을 분비. 이산 돌연변이 클래스의 PTZ - 유발 phenotypes는 aldicarb과 C. 엘레간스에서 PTZ 노출 패러다임과 상호 보완적인 접근 방식이 neurotransmission 우리의 이해를 촉진 수 있음을 나타냅니다. 또한, 우리는 약리 assays을 수행하는 방법을 보여주는 동영상은 C. 엘레간스 연구 일관된 방법을 확립해야합니다.

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Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

이 동영상은 선충류, C. 엘레간스의 신경 기능을 연구 보완 방법의 두 신경 자극, aldicarb 및 pentylenetetrazole (PTZ)을 고용하는 방법을 보여줍니다. 이 상호 보완적인 접근 방법은 또한 modulating의 연결 synchrony에 대한 evolutionarily 보존 메커니즘에 대해 설명해 주실 사용 간질과 발작에 대한 의미를 가지고있을 수 있습니다.

C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.1K 조회수.  University of Alabama. 이 동영상은 선충류, C. 엘레간스의 신경 기능을 연구 보완 방법의 두 신경 자극, aldicarb 및 pentylenetetrazole (PTZ)을 고용하는 방법을 보여줍니다. 이 상호 보완적인 접근 방법은 또한 modulating의 연결 synchrony에 대한 evolutionarily 보존 메커니즘에 대해 설명해 주실 사용 간질과 발작에 대한 의미를 가지고있을 수 있습니다.

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Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

연구

행동분석학

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

신경과학

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

해부 및 C. 엘레간스 신경근육학 융티온에서 레코딩

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

생물학

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) controls several functions in C. elegans including learning and motor activity. Conditions that stimulate DA release (e.g., amphetamine (AMPH) treatments) or that prevent DA clearance (e.g., animals lacking the DA transporter (dat-1) which are incapable of reaccumulating DA into the neurons) generate an excess of extracellular DA ultimately resulting in inhibited locomotion. This behavior is particularly evident when animals swim in water. In fact, while wild-type animals continue to swim for an extended period, dat-1 null mutants and wild-type treated with AMPH or inhibitors of the DA transporter sink to the bottom of the well and do not move. This behavior is termed "Swimming Induced Paralysis" (SWIP). Although the SWIP assay is well established, a detailed description of the method is lacking. Here, we describe a step-by-step guide to perform SWIP. To perform the assay, late larval stage-4 animals are placed in a glass spot plate containing control sucrose solution with or without AMPH. Animals are scored for their swimming behavior either manually by visualization under a stereoscope or automatically by recording with a camera mounted on the stereoscope. Videos are then analyzed using a tracking software, which yields a visual representation of thrashing frequency and paralysis in the form of heat maps. Both the manual and automated systems guarantee an easily quantifiable readout of the animals' swimming ability and thus facilitate screening for animals bearing mutations within the dopaminergic system or for auxiliary genes. In addition, SWIP can be used to elucidate the mechanism of action of drugs of abuse such as AMPH.

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming induced paralysis (SWIP) is a well-established behavioral assay used to study the underlying mechanisms of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans (C. elegans). However, a detailed method to perform the assay is lacking. Here, we describe a step-by-step protocol for SWIP.

꼬마 선 충 에서 도파민 신호 평가에 수영 유도 마비

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle contraction. As in vertebrate skeletal muscle, cholinergic signaling in the body wall muscles of the model organism Caenorhabditis elegans is required for locomotion. Exposure to levamisole, a pharmacological agonist of one class of ACh receptors on the body wall muscles, causes time-dependent paralysis of wild-type animals. Altered sensitivity to levamisole suggests defects in signaling at the NMJ or muscle function. Here, a protocol for a liquid levamisole assay performed on C. elegans grown in 24-well plates is presented. Vigorous swimming of the animals in liquid allows for the assessment and quantitation of levamisole-induced paralysis in hundreds of worms over a one-hour time period without requiring physical manipulation. This procedure can be used with both wild-type and mutants that have altered sensitivity to levamisole to demonstrate the functional consequences of altered signaling at the NMJ.

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

The present protocol describes an assay to determine response to levamisole, a pharmacological agonist of one class of Caenorhabditis elegans acetylcholine receptors. In this liquid levamisole swim assay, researchers visually observe and quantitate the time-dependent paralysis of animals cultivated in 24-well plates.

Caenorhabditis elegans 아세틸콜린 수용체 작용제 Levamisol에 대한 민감도 측정

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

유전학

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

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Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

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Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

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Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

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Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

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