이것은 Chelicerata 종에 대한 최초의 배아 주입 프로토콜입니다. 진드기 배아를 주입하는 능력은 많은 연구 라인, 특히 진드기 유전자 기능과 진드기 병원체 상호 작용에 대한 연구를 열 것입니다. 이 기술은 진드기 유전자의 기능 연구에 대한 향후 작업을 허용하고 유전자 구동 시스템을 사용하여 진드기 개체군 제어의 기초를 제공합니다.
이 방법은 진드기와 진드기가 분자 수준에서 보유하고있는 병원체 사이의 상호 작용에 대한 이해를 용이하게합니다. 이를 통해 라임 병 및 기타 병원체에 대한 백신 개발에 사용할 수있는 단백질을 식별 할 수 있습니다. 진드기 병원체 상호 작용 및 먹이를 먹는 동안 진드기에 의한 숙주로의 병원체 전파와 같은 여러 연구 분야가이 연구의 이점을 누릴 것입니다.
진드기가 숙주의 면역 반응을 피하는 방법과 DNA 복구 메커니즘의 차이와 같은보다 근본적인 질문도 이제 이해할 수 있습니다. 이 절차를 수행하기 전에 이해해야 할 진드기 생물학의 몇 가지 측면이 있습니다. 배아의 높은 내부 압력은 바늘로 만질 때 파열로 이어집니다.
주사를 위해 배아를 준비하는 것은 매우 중요합니다. 시작하려면 암컷을 섭씨 4도에서 섭씨 27도 인큐베이터로 옮겨 주사 일주일 전에 알을 낳습니다. 암컷이 알을 낳기 시작하는 3-4 일 후, Gene의 장기 절제를 위해 암컷을 준비하는 동안 끝이 가늘고 붓을 사용하여 알을 제거하십시오.
글 랜드를 비우려면 입 부분이 복부와 등쪽 모두에서 보이도록 현미경으로 유리 슬라이드에 중력 진드기를 배열하십시오. 그런 다음 등 쪽의 입 부분 뒤의 영역을 조심스럽게 뚫고 집게를 사용하여 복부 쪽에 압력을가하십시오. 보푸라기가없는 물티슈의 가장자리를 놓고 펑크 부위에서 나오는 액체 왁스를 제거하십시오.
또는 해부로 글 랜드를 비우는 대신 진드기 입 부분 주위에 조직 접착제와 같은 접착제를 사용할 수 있습니다. 암컷이 다시 알을 낳기 시작하면 가는 붓을 사용하여 갓 퇴적된 알을 모아 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 0-18시간 된 계란이 들어 있는 튜브에 약 200마이크로리터의 5% 벤잘코늄 클로라이드 물을 추가합니다.
계란이 튜브 바닥에 가라앉지 않도록 붓으로 계란을 5분 동안 부드럽게 휘젓고 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 계란을 튜브에 남겨둡니다. 계란이 들어있는 튜브에 약 200 마이크로 리터의 증류수를 첨가하십시오. 붓으로 소용돌이치며 마이크로 피펫을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에서 물을 제거합니다.
증류수로 세척 한 후 약 200 마이크로 리터의 5 % 염화나트륨을 넣고 붓으로 5 분 동안 부드럽게 소용돌이 치십시오. 그런 다음 5 분 후에 튜브에서 용액을 제거하고 계란을 증류수로 두 번 씻으십시오. 다음으로, 계란이 들어있는 마이크로 원심 분리기 튜브에 약 100 마이크로 리터의 1 % 염화나트륨 용액을 첨가하십시오.
먼저 양면 테이프를 사용하여 계란 정렬을 지원하기 위해 약 0.5cm의 간격을 두고 두 개의 유리 현미경 슬라이드를 함께 접착하고 슬라이드 사이의 간격에 있는 양면 테이프에 투명 필름 드레싱 조각을 적용합니다. 그런 다음 붓을 사용하여 슬라이드 설정에서 한 번에 8-10개의 계란을 정렬합니다. 그런 다음 정렬된 계란이 있는 슬라이드를 복합 현미경 스테이지에 놓고 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 1% 염화나트륨 용액을 제거합니다.
채워진 주사 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 연결된 마이크로 인젝터에 부착합니다. 다음으로, 마이크로 인젝터의 고압 설정을 사용하여 계란 표면에 부드럽게 문질러 바늘을 엽니다. 바늘을 연 후 바늘의 열림에 따라 마이크로 인젝터의 압력을 줄이십시오.
그런 다음 슬라이드의 모든 계란을 가능한 한 빨리 10-15도 각도로 주입하고 풋 페달을 빠르게 밟은 다음 젖은 종이 타월로 페트리 접시에 슬라이드를 습도가 높은 조건으로 즉시 옮깁니다. 주입된 배아가 들어 있는 슬라이드를 축축한 여과지가 깔린 큰 페트리 접시에 5-6시간 동안 넣은 후, 주입된 배아가 부착된 투명 필름 드레싱에 증류수 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 붓을 사용하여 계란을 부드럽게 옮깁니다.
다음으로 계란을 작은 페트리 접시에 옮기고 증류수에 담그십시오. 계란을 물에 담그고 페트리 접시를 6쿼트 플라스틱 상자에 담아 섭씨 27도 이상의 인큐베이터에 넣고 상대 습도 90% 이상에서 놓습니다. 유충이 주사 후 21 일에서 25 일 사이에 주입 된 배아에서 부화하기 시작하면 매일 확인하고 부화 한 유충을 스크린이있는 유리 병으로 옮깁니다.
결과는 12 시간에서 18 시간 사이의 배아 발생 초기에 난자를 주입하고 난자의 긴 축을 슬라이드 가장자리에 수직으로 정렬하면 주입 된 난자의 생존율이 높아진다는 것을 입증했습니다. 주입 된 모든 알 중 최대 8.5 %생존하고 유충이 부화했습니다. 이 절차를 시작하기 전에 2.4단계, 어미 진드기에서 왁스 제거, 3.1-3.4단계, 염화벤잘코늄으로 배아 융모막을 연화하고 염화나트륨 용액으로 배아를 건조시켜 성공적인 배아 주입을 가능하게 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 방법은 주로 진드기 유전자 편집을 위해 개발되었으며,이를 통해 진드기 유전자 기능을 이해하는 데 도움이되는 녹아웃 및 녹인을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 진드기 연구에 적용될 수있는 다른 많은 유기체에 사용할 수있는 유전자 편집 도구의 사용을 허용합니다. 그리고 이것은 진드기 분자 생물학 연구를 가속화 할 것입니다.
