이 프로토콜은 조직 세분화를 위해 AI 기반 이미지 분석을 통합합니다. 조직학으로 레이저 미세 해부에 의한 선택적 수확으로 우리를 병리학의 현실에 더 가깝게 만듭니다. AI를 사용하여 조직 ROI를 미리 정의하고, 주변 온도에서 조직 슬라이드의 체류 시간을 제한하고, 이러한 수확을 수행하기 위한 인력 노력을 줄이고, 작업자의 변동성을 감소시킵니다.
이 기술은 조직 표본으로부터 특정 세포 집단의 수집 또는 농축을 포함하는 모든 질병 또는 병리학 기반 연구에 광범위하게 적용 가능하다. 이 방법은 기본적인 조직 병리학 지식과 LMD 경험을 가진 사용자에게 간단합니다. 핵심은 셀에 대한 깨끗한 교정기를 절단하고 분류자를 잘 훈련시키는 것입니다.
시작하려면 기준 교정 신탁을 절단하기 전에 슬라이드가 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 레이저 미세 해부 소프트웨어를 열고 셰이프 가져오기 옵션에서 기본 교정 도트 sld 파일을 엽니다. 티슈가 아래쪽을 향하고 레이블 면이 작업자에게 더 가까이 있는 상태에서 슬라이드를 로드합니다.
레이저 미세 해부 단계의 슬라이드 홀더에 넣고 절단 전에 자동 초점을 선택합니다. 레이저 현미경 및 기본 교정 도트 sld 파일을 사용하여 교정 신탁을 PEN 멤브레인으로 자릅니다. 레이저 미세 해부 강화 컬렉션의 경우에만 이미지 분석 소프트웨어를 엽니다.
열려 있는 이미지를 선택하고 팝업 창에서 슬라이드 스캔에서 생성된 점 svs 이미지 파일을 선택합니다. 주석 탭으로 이동하여 사각형 주석 도구를 선택하고 사용하여 조직 주위에 상자를 그립니다. 상자 주석을 선택하고 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.
고급 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 분할 옵션을 클릭합니다. 타일 크기와 공간을 각각 500과 40 사이로 설정하고 [정상]을 선택하여 타일을 생성합니다. 타일을 생성하는 데 사용되는 경계 상자 주석을 선택하고 삭제합니다.
레이어 작업 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 내보내기를 클릭하여 타일로 배열된 주석을 점 주석 파일로 저장합니다. AI 분류 주석 레이어를 타일 주석 파일과 동일한 폴더에 병합하기 위해 개발된 Python dapa 알고리즘의 저장된 복사본을 배치합니다. 타일로 묶인 주석 파일의 이름을 복사합니다.
유휴 통합 개발 환경을 사용하여 Python 프로그램을 열고 프로그램 하단의 인용문 사이에 타일 주석 파일의 이름을 붙여 넣습니다. 실행 드롭다운 메뉴를 선택하고 모듈 실행을 클릭합니다. 모든 타일 주석이 단일 레이어 아래에 병합 될 몇 개의 파일이 생성 될 때까지 기다리십시오.
이미지 분석 소프트웨어를 열고 주석 탭으로 이동합니다. 레이어 작업 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 모든 레이어 삭제를 클릭하여 이미지에서 모든 주석을 제거합니다. 레이어 작업 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 로컬 주석 파일 가져오기를 클릭합니다.
팝업 창에서 스크립트에 의해 생성된 병합된 점 주석 파일을 선택합니다. 가져온 모든 타일이 동일한 주석 레이어 아래에 있는지 확인합니다. 분류기 탭에서 제조업체의 지침에 따라 종양, 스트로마 및 빈 유리 슬라이드 배경 ROI의 대표 영역을 강조 표시합니다.
분류자를 실행하기 전에 고급 분류자 옵션을 클릭하고, ROI 상자를 선택하여 원하는 주석 레이어를 선택하거나 주석 탭의 상자를 선택합니다. 분류자 작업 메뉴의 주석 레이어 옵션을 사용하여 분류자를 실행합니다. 분류자 분석이 완료되면 주석 탭으로 이동하여 분석에서 생성된 주석 레이어를 선택합니다.
레이어 작업 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 현재 레이어를 제외한 모든 레이어 삭제를 클릭하여 이미지에서 다른 모든 주석 레이어를 제거합니다. 그런 다음 레이어 작업 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 내보내기를 클릭하여 주석을 점 주석 파일로 저장합니다. 세션 또는 프로젝트에 대한 폴더를 만들고 점 주석 파일을 하위 폴더 안에 저장합니다.
슬라이드의 고유 식별자로 레이블이 지정됩니다. 주석 탭으로 이동하여 레이어 작업 드롭다운을 선택한 다음 모든 레이어 삭제를 클릭하여 이미지에서 모든 주석을 제거합니다. 펜 도구를 선택하고 각 교정 신탁에서 짧은 선을 그립니다.
다음 순서로 표시에서 선을 그립니다. 왼쪽 위, 오른쪽 위, 오른쪽 아래. 레이어 작업 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 내보내기를 클릭하여 타일로 배열된 주석을 do 주석 파일로 저장합니다.
파일 이름에 밑줄 보정을 추가하고 타일 모양의 좌표가 포함된 하위 폴더에 파일을 배치합니다. 기본 프로젝트의 주소를 복사합니다. 유휴 통합 개발 환경을 사용하여 XML 가져오기 생성 스크립트 수정자를 연 다음 스크립트 맨 아래에 있는 따옴표 사이에 프로젝트 폴더 주소를 붙여 넣습니다.
실행 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 모듈 실행을 클릭하여 스크립트를 실행합니다. 조직이 아래를 향하도록 표시된 멤브레인 슬라이드를 로드하고 라벨 측면이 작업자에게 더 가까이 있는 상태에서 레이저 현미경 스테이지의 슬라이드 홀더에 로드합니다. 파일 드롭다운 메뉴에서 셰이프 가져오기를 선택합니다.
슬라이드에 대해 생성된 도트 XML, LMD 가져오기 파일을 선택합니다. 팝업 창에서 파일에서 참조점이 로드되지 않도록 하려면 아니오를 선택하고, 두 번째 팝업 창에서 아니오를 선택하여 이전에 저장된 참조점을 보정에 사용하지 않도록 합니다. 레이저 마이크로 해부 적용의 프롬프트에 따라 교정 크로스를 슬라이드의 세 가지 교정 신탁 각각에 맞춥니다.
슬라이드 이미지의 왼쪽 위, 오른쪽 위 및 오른쪽 아래에 나타나는 보정 신탁을 찾습니다. 현미경 스테이지에서 반전된 레이저 미세 해부 슬라이드의 기준점에 대응하는 이미지 분석 소프트웨어에서. 5x 주관적 렌즈를 사용하여 위치를 찾고 63x 주관적 렌즈를 사용하여 각 보정 신탁을 정렬합니다.
팝업 창에서 아니오를 선택하여 참조 지점을 파일에 저장하지 않도록 하고, 두 번째 팝업 창에서 슬라이드가 삽입되었는지 확인합니다. 5x 주관적 렌즈를 위치로 이동하고 팝업 창에서 예를 선택하여 실제 배율을 사용합니다. 가져온 도형이 나타나면 카메라를 티슈에 초점을 맞춥니다.
셰이프 목록 창에서 모든 셰이프를 강조 표시하고 선택합니다. 시야각 내에서 하나 또는 두 개의 주석을 참조로 사용하여 제자리에 드래그하고 레이저로 절단하기 위해 수직 z축을 정렬합니다. PCT 마이크로튜브용으로 설계된 범용 튜브 홀더에 튜브를 로드합니다.
가져온 도형을 검토하고 수집을 위해 적절한 튜브 위치에 할당합니다. 시작 컷을 눌러 레이저를 시작합니다. LMD 조직으로 샘플 튜브를 언로드하고 닫은 다음 드라이 아이스를 착용하십시오.
열순환 및 원심분리 후, LMD는 조직 샘플을 수확하고, PCT 마이크로튜브로부터 마이크로캡을 제거하고 폐기하였다. 트립신을 추가하고 30 밀리미터 제곱 조직 당 하나의 마이크로 그램의 비율을 추가하십시오. 그리고 마이크로캡 툴을 이용하여 마이크로튜브에 마이크로페슬을 삽입한다.
마이크로튜브를 배럴 사이클 카트리지로 옮기고 전체 카트리지를 조립합니다. 카트리지를 배럴 사이클 압력 챔버에 넣고 뚜껑을 고정하십시오. 배럴 사이클은 45, 000 PSI에서 50 초 동안 그리고 대기압은 섭씨 50도에서 10 초 동안 60 사이클 동안 순환합니다.
LC-MS 분석을 위해, 자동 샘플러 바이알을 적절한 위치에 액체 크로마토그래피 자동 샘플러에 로딩하십시오. 자동 샘플러를 닫고 적절한 구배 및 질량 분광법으로 개별 분획을 분석합니다. 100 개의 가장 다양한 단백질을 사용하는 감독되지 않은 계층 적 클러스터링.
고등급 장액성 난소암 및 난소 맑은 세포 암종 히스토 유형을 레이저 미세해부 농축 및 전체 종양 샘플로부터 분리시키는 결과를 가져왔다. 대조적으로, 레이저 미세 해부는 고급 장액성 난소암과 난소 맑은 세포 암종 모두에서 스트로마 샘플을 풍부하게했습니다. 함께 그리고 레이저 미세해부로부터 독립적으로 클러스터링된 농축 종양 및 전체 종양 샘플.
5, 971개의 정량화된 단백질 중에서, 215개는 고급 장액성 난소암과 난소 맑은 세포 암종 표본으로부터의 전체 종양 수집 사이에서 유의하게 변화되었다. 휴즈에 의해 정량화된 76개의 시그니처 단백질 중 57개는 이 데이터세트에서 공동 정량화되었으며, 고도로 상관관계가 있었으며 분류자가 가장 어려운 부분이다. Indica Lab 소프트웨어 지침에 따라 분류기를 정제하면 가장 정확한 결과가 재현되었습니다.
다른 모든 것은 표준화되어 있습니다. 이 AI 기반 LMD 워크플로우를 사용하여 수확된 조직은 여기에 설명된 질량 분광법 기반 프로테오믹스 또는 게놈, 전사체 또는 기타 오믹 분석을 포함한 다양한 다운스트림 분석 애플리케이션과 호환됩니다.
