연구는 건강의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램, 국립 암 연구소, 암 연구 센터에 의해 부분적으로 지원되었다.

기술 된 프로토콜은 인간 조직 샘플의 사용에 관한 NIH 규칙에 따라 사용 하였다. 1. 조직 준비 <ol><li> 이전 처음으로, 임상 시험 심사위원회 (IRB) 프로토콜에 따라 인간의 조직 표본을 구하십시오. </li><li> 조직 / 세포 블록의 유형 및 대응 처리 방법 [냉동 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 (FFPE), 또는 에탄올 고정 파라핀 (EFPE)]를 선택합니다. 포르말린 고정 에탄올 고정 및 플래시 냉동 한 다음, 최적의 조직학을 제공합니다. 그러나, 고정 조직 처리 방법은 DNA, RNA 및 단백질 양 및 하류 분자 분석을위한 품질에 영향을 미칠 수 있으며 고려되어야한다. </li><li> 선택의 슬라이드 타입 (유리, 막 유리, 금속 프레임 막) 상에 조직 / 셀 블록 섹션을 잘라. SIVQ 분석은 세 가지 슬라이드 타입에 동일하게 작동합니다. 주의하시기 바랍니다 의사의 coverslip 방법 크실렌과 에단 (아래에 설명)슬라이드가 무대에 반전해야하기 때문에 올 금속 프레임 막 슬라이드에 수행 할 수 없습니다. </li><li> 배경에서 관심의 세포를 식별하는 화학 물질 또는 IHC 기반 조직 얼룩을 선택합니다. 그 염색 방법은 또한 DNA, RNA 및 단백질 품질과 조직의 양에 영향을 미칠 수 있습니다. 프로토콜을 진행하기 전에 생체 분자의 초기 품질을 평가하기 위해 염색 후 조직을 테스트합니다. DAB (15), 면역, 빠른 빨강, 드 노보 빨강, 파랑 톨루이딘, 헤 마톡 실린과 에오신 (H &amp; E) (게시되지 않은 데이터)과 면역 조직 화학 (IHC) : SIVQ-LCM은 염색 조직 / 세포 검사 슬라이드에 수행되었습니다. </li></ol> 2. 표본 영상 <ol><li> 로드 미세 절제 장비의 자동화 단계에 슬라이드 및 관련 소프트웨어를 실행합니다. 로드 슬라이드의 위치를​​ 지정하고 캡처 한 이미지 파일을 JPEG 형식으로 저장 될 수 있도록 확인란을 선택합니다. </li><li> 메신저를 최적화연령 매뉴얼 포커스 휠 또는 절개를 통해 기기의 소프트웨어를 사용하여, 스크린에 이미지의 밝기와 초점을 조절함으로써 품질. <ol><li> 해부 기기의 소프트웨어 내에서 이미지 도구를 사용하여 적절하게 램프 밝기와 카메라 게인을 설정합니다. 값의 예는 확산기와, 휘도 = (60) 및 게인 = 220이다. </li><li> 수동으로 또는 소프트웨어의 자동 초점 기능으로 초점을 맞 춥니 다. </li></ol></li><li> 박리 과정에 대한 로드맵을 제공하는 슬라이드의 썸네일 개요 이미지를 캡처. <ol><li> uncoverslipped 슬라이드의 최적의 이미지 품질을 위해 악기의 콘덴서 아래의 확산을 이용하거나, 내화 지수 (의사 커버 슬립)을 개선하기 위해 에탄올, 자일 렌 하나의 작은 양 (~ 30 μL)를 추가합니다. 크실렌을 사용하는 경우, 흄 후드와 보호 실험실 코트, 보안경 및 장갑의 사용을 포함하여, 그들이 독성 및 적절한 안전 대책을 사용해야되어 인식. </li><li> 에탄올, 자일 렌 용액이 완전히 삭제되거나 캡의 중합체가 왜곡 될 때까지 슬라이드의 LCM 캡을 씌우지 마십시오. </li></ol></li><li> 10X, 20X, 또는 40 배 배율로 해부 할 영역의 슬라이드와 이미지를 캡처 이동합니다. 필요한 경우, 이전에 22 설명 등 (마이크로 소프트 오피스 이미지 관리자) 자동 고침과 같은 소프트웨어를 사용하여 이미지를 향상시킬 수 있습니다. 이미지들을 자동 선택 소프트웨어로 다시 가져올 수 있도록 JPEG 형식으로 캡처해야합니다. </li></ol> 이미지 3. 알고리즘 분석 <ol><li> 전송 SIVQ 폴더로 미세 절제 기기에서 이미지를 캡처. 설치 및 해부 기기에 연결된 컴퓨터에 ArcturusXT, 자동 스캔 및 SIVQ 소프트웨어 패키지를 엽니 다. SIVQ 소프트웨어에 액세스 할 경우, 박사 율리시스 Balis (ulysses@med.umich.edu)에 문의하시기 바랍니다. </li><li> 열기 SIVQ과 캡쳐 된 이미지의 관심 (JPEG)을로드합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 관심 영역으로 이동 및 / 또는 디스플레이 창 (뷰포트 5 &amp; 6)의 크기를 조정합니다. SIVQ 소프트웨어에서 뷰포트 5는 사전 처리 된 이미지를 도시하고 뷰포트 6은 후 처리 된 이미지 (16)를 나타낸다. </li><li> 반지 벡터와 사용하는 링의 수의 크기를 선택합니다. </li><li> 뷰포트 6에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 캡처 할 수있는 조건 이미지 기능을 선택합니다. </li><li> 이미지를 분석하는 &quot;검색&quot;을 클릭합니다. </li><li> 두 슬라이드 막대를 사용하여 이미지 일치의 통계적 확률을 조정합니다. 상단 표시 줄에 전체 벡터 특이성을 조정하고 (선택한 &quot;합계&quot;변수에 의해 정의 된 감도) 과도한 포함 영역을 나타낼 수가 초기 검사에서 영역을 제외하는 데 사용됩니다. 반대로, 낮은 슬라이더 스캔이 수행 된 후 매치 것으로 분류된다 증가 영역의 의도로, 감도를 증가시키기 위해 이용된다. 이러한 슬라이더 컨트롤은 모두 요로 감염초기 기준 감도 임계 값으로 LIZE &quot;합계&quot;변수. </li><li> 이미지를 저장하기 위해 (이미지는 현재 C :/ vq_test 폴더 / 갤러리에 저장됩니다) &quot;JPEG로 저장&quot;을 클릭합니다. </li><li> 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석합니다. 알고리즘 분석의 출력은 SIVQ-LCM에 사용하는 주석 화상 초래할 필요가있다. 현재, SIVQ 코어 엔진의 현재 버전은 전체 생산 판 (가능한 Q1 2014)의 단순화 된 통합 전체 소프트웨어 개발 키트 (SDK) 및 애플리케이션 프로그래밍 인터페이스 (API)를 통합 할 것이란 가정 베타 버전 테스트입니다 사용자 생성 공간 필터 및 코어 링 매칭 ​​엔진과 하류 플로 데이터 처리 단계. 이 SDK는 문서의 완전한 세트와 함께 배포됩니다. <ol><li> SIVQ의 히트 맵이 균일 한 붉은 색으로 변경되어 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 이미지를 내 보냅니다. 그것은 P의 위치 좌표를 다시 삽입하는 것이 필수적입니다원래 해부 악기 이미지에서 파일 헤더에 붙여 HEX 편집기를 사용하여 OST 분석의 JPEG 이미지. 해당 데이터는 &quot;영상의 시작&quot;마커 (를 0xFF, 0xD8)와 제 &quot;양자화 테이블을 정의&quot;마커 (를 0xFF, 0xDB) 사이에서 발견 할 수있다. </li></ol> 4. 미세 절제 <ol><li> 이미지가 SIVQ 분석에 캡처 된 관심 영역의 중심에 LCM 뚜껑을 놓습니다. </li><li> 보정 및 품질 관리 (QC) UV / IR 레이저와 전력, 기간, 레이저의 위치 및 (제조업체에서 권장하는) UV 절단 속도 등의 매개 변수를 최적화 할 수 있습니다. 분석 된 이미지를 다시 가져 오기 전에이 교정을 수행합니다. </li><li> 오픈 AutoScanXT (자동 선택 소프트웨어) 및 C :/ vq_test 폴더 / 갤러리에서 분석 된 이미지를 가져옵니다. </li><li> SIVQ 주석을 인식하고 해부지도를 만들 수있는 자동화 된 선택 소프트웨어를 교육합니다. <ol><li> TRAI를 만들려면닝 파일 SIVQ 분석 이미지의 &quot;빨간 페인트&quot;를 ( &quot;블루 원 &#39;으로 표시) 그 4 개의 영역을 선택합니다. </li><li> 해부 할 수 없습니다 ( &quot;빨간색 사각형&quot;로 표시) 배경 영역을 선택합니다. </li><li> 이후의 사용을 위해 저장 될 수있는 교육 파일을 생성하려면 &quot;분석&quot;버튼을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 적절한 적외선 (IR​​) 및 / 또는 자외선 (UV) 레이저를 이용하여 미세 절제를 수행합니다. <ol><li> &quot;라이브&quot;이미지에 선택된 영역을 복사합니다. </li><li> &quot;microdissect&quot;도구 상자에서 적절한 IR 캡처 또는 UV 커팅 버튼을 선택합니다. </li></ol></li><li> 박리가 완료되면, QC 역 LCM 캡을 이동하고 해부 조직 / 세포의 이미지를 캡처. 또 다른 방법은 이전의 QC 역으로 이동하는 슬라이드의 빈 영역에 뚜껑을 배치하는 것입니다, 이것은 사용자가 다양한 배율의 사진을 촬영 할 수 있습니다. </li><li>더 효율을 올려 평가하는 미세 절제 한 후 그 조직 영역의 이미지를 캡처합니다. </li><li> 원하는 세포가 성공적으로 해부 한 경우, ArcturusXT 소프트웨어의 &quot;현재 단계&quot;버튼을 클릭 스트림 분석을위한 분자 추출 과정을 시작하기 위해 LCM 캡을 제거합니다. </li></ol>

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

마이클 R. Emmert 벅 레이저 캡처 미세 절제를 포함하는 NIH 개최 특허에 발명자이며 NIH 기술 이전 프로그램을 통해 로열티 기반의 지불을받습니다.

우리는 FFPE 인간의 유방 조직에서 면역 염색 상피 세포를 microdissect하는 SIVQ-LCM의 응용 프로그램에 대한 프로토콜을 제시한다. 그러한 SIVQ 같은 이미지 분석 알고리즘의 사용은, 실습의 microdissection 처리에 요구되는 시간을 감소시킨다. 작업자의 시간과 노력은 일반적으로 그 세포의 정확한 해부 대한 속도 제한 단계이기 때문에이 필드에 대한 잠재적으로 중요한 발전이다. 그것은 가능성이 아니라...

원래 1990 년대 중반에 개발 된 레이저 캡처 미세 절제 (LCM)는 정밀 현미경 시각화 1, 2를 통해 조직 학적 조직 섹션에서 특정 셀 또는 셀 영역을 캡처 할 수 있도록합니다. 조직 부스러기 대 LCM의 분자량 분석을 비교하는 많은 연구 방법 3-12의 값을 나타낸다. 또한, 13, 14를 볼 사용할 수있는 기술에 대한 3 개의 비디오 프로토콜 출판물이있다. 관심의 대상이 이종 조직 절편 때, 또는 세포의 큰 숫자가 같은 단백질 체학과 같은 특정 다운 스트림 응용 프로그램에 필요한에있는 분산 된 세포 집단이다 그러나, 검증 된 값에도 불구하고, LCM은 지루하고 힘든 될 수 있습니다. 인간의 연산자에 배치 부담이 LCM 공정 (15)를 안내하는 강력한 이미지 분석 알고리즘을 결합하여 LCM을위한 반자동 절개 접근법을 개발하기 위해 우리를 안내했다. &lt;미시간 대학과 공동으로 P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;, NIH에서 우리 연구소 확장 이전에 개발에 고유의 조직 선택 과정을 반 자동화 할 수 있도록하는 방식으로 공간적으로 불변 벡터 양자화 (SIVQ) 알고리즘을보고 따라서 마음의 병리학 자 또는 생명 과학자와 함께 사용할 수있는 도구를 만들고, 미세 절제를 유도. 공간적으로 불변 벡터 양자화 (SIVQ) 사용자가 단순히 통계 임계 값을 조정, 전체 조직 학적 이미지를 검색하는 데 사용할 수있는 반지 벡터 (술어 이미지 기능)을 만들 관심의 조직 학적 특징에 &quot;클릭&quot;할 수있는 알고리즘 로 16-21했습니다. 결과 열 맵은 초기 조건의 이미지 기능에 경기의 질을 표시하고 이후 단일 색상 LCM 악기로 가져올 수 있습니다 (빨간색) 주석지도로 변환된다. 자동 선택 소프트웨어, AutoScanXT은 다음을 기준으로지도를 그리는 데 사용되는SIVQ의 주석이 조직 샘플에서 표적 세포의 포착을 안내하기에. 아래의 자세한 프로토콜은 미세 절제 워크 플로우에 SIVQ의 구현을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCM은 자동화하고 전통적인, 사용자에 의존하는 레이저 해부 과정을 간소화 새로운 방법론이다. 그것에는 진보, 신속하게 사용자 정의 레이저 해부 플랫폼 기술을 만드는 것을 목표로하고있다. 이보고에서는, ArcturusXT 기기에 이미지 분석 소프트웨어 공간적 불변 벡터 양자화 (SIVQ)의 통합을 설명한다. ArcturusXT 시스템은 특정 세포 또는 넓은 지역의 해부를 허용, 적외선 (IR​​) 및 자외선 (UV) 레이저 모두 포함되어 있습니다. 주된 목표는 속도, 정확도, 및 샘플 처리량을 증가시키는 레이저 절개의 재현성을 향상시키는 것이다. 이 새로운 접근 방식은 동물 연구와 임상 워크 플로우에있는 인체 조직 모두의 미세 절제를 용이하게한다.

FFPE 인간의 유방 조직 섹션은 표준 IHC 프로토콜 23을 사용 AE1/AE3를 아세포 면역 염색 하였다. 염색 후, 조직 슬라이드 ArcturusXT 스테이지 상에 배치하고, 전술 한 바와 같이 SIVQ-LCM 프로토콜이 개시되었다. 조직이 미세 절제를위한 coverslipped 할 수는 없으므로, IHC 염색 된 세포 + 외형 (도 1a)를 분별하기 어렵다. 따라서, 더 나은 인덱스 매칭 및 개선 된 이미지를 제공하기 위해, 크?...

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SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM은 레이저 캡처의 microdissection (LCM) 프로세스를 구동하는, 컴퓨터 알고리즘 공간적 불변 벡터 양자화 (SIVQ)를 마구 혁신적인 접근법이다. SIVQ-LCM의 흐름은 크게 연구와 임상 모두에서 응용 프로그램과 함께, 미세 절제의 속도와 정확성을 향상시킵니다.

ArcturusXT 악기 SIVQ-LCM 프로토콜

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Research

JoVE Journal

Biology

8.5K 조회수.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCM은 레이저 캡처의 microdissection (LCM) 프로세스를 구동하는, 컴퓨터 알고리즘 공간적 불변 벡터 양자화 (SIVQ)를 마구 혁신적인 접근법이다. SIVQ-LCM의 흐름은 크게 연구와 임상 모두에서 응용 프로그램과 함께, 미세 절제의 속도와 정확성을 향상시킵니다. 

비디오: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

연구

생물학

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

호중구 격리 프로토콜

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

KLRG1 Tetramer의 생산을위한 프로토콜

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

야생 유충에서 Hemocytes을 추출하기위한 간단한 프로토콜

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

실험실 주택의 청록색 송사리 (Nothobranchius furzeri)에 대 한 프로토콜

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called thigmomorphogenesis. In past decades, several signaling components have been identified and reported for being involved in the mechanotransduction (e.g., calcium ion binding proteins and jasmonic acid biosynthesis enzymes). However, the relatively slow pace of research in the study of force signaling or thigmomorphogenesis is largely attributed to two reasons: the requirement for laborious human hand-manipulated touch induction of thigmomorphogenesis and the force strength errors associated with people&#8217;s hand-touch. To enhance the efficiency of external force loading on a plant organism, an automatic touch-force loading machine was built. This robotic arm-driven hair brush touches provide a labor-saving and easily repeatable touch-force simulation, unlimited rounds of touch repetition and adjustable touch strength. This hair touch-force loading machine can be used for both large scale screening of touch-force signaling mutants and the phenomics study of plant thigmomorphogenesis. In addition, touch materials such as human hair, can be replaced with other natural materials like animal hair, silk threads and cotton fibers. The automated moving arms on the machine may be equipped with water sprinkling nozzles and air blowers to mimic the natural forces of rain drops and wind, respectively. By using this automatic hair touch-force loading machine in combination with the hand-performed cotton swab touching, we have investigated the touch response of two force signaling mutants, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) and MKK2 plants. The phenomes of the touch-force loaded wild type plants and two mutants were evaluated statistically. They have exhibited significant differences in touch response.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A gentle touch-force loading machine is built from human hair brushes, robotic arms and a controller. The hair brushes are driven by robotic arms installed on the machine and move periodically to apply touch-force on plants. The strength of machine-driven hair touches is comparable to that of manually applied touches.

모델 식물 애기장대 의 Thigmomorphogenesis의 연구를 위한 노동 절약 및 반복 가능한 터치 포스 신호 돌연변이 스크린 프로토콜

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

플랜트 루트 시스템 아키텍처 특성을 매핑하기 위한 간단한 프로토콜

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

예쁜꼬마선충(C. elegans)과 간암 세포주(Liver Cancer Cell line)의 유사분열(Mitophagy) 정량화

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

저자 스포트라이트: Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes(세포기관 특이적 염료를 사용한 예쁜꼬마선충 및 포유류 세포의 유사 분열 검출)  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...