Name: isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains
Uploaded: 2018-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains at JoVE.com

우리 초기 도움말 및 실험적인 접근 및 QMRI Flow Cytometry 셀 정렬 시설에 대 한 토론에 대 한 박사 클레어 데이비스와 닥터 베로 Miron (여왕의 의료 연구소, 에든버러, 유나이티드 Kingdome) 감사합니다. 이 작품은 박사 더크 Sieger에 암 연구 영국 경력 설립 수상에 의해 지원 되었다.

1. 샘플 및 미디어 준비
<ol><li>6.4 m KCl m, 0.22 m m NaCl, 0.33 m m CaCl2 2 H2O, 0.33 m m MgSO4 7 H2O H2o.에에서 용 해 하 여 배아 매체 (E3)를 준비</li>
	<li>수정 (0 dpf) 후 즉시 zebrafish 태아를 수집 합니다.<ol>
<li>Zebrafish 태아 90 mm 페 트리 접시 당 50 분할. 착 색을 억제 하는 실험의 기간에 대 한 개발 (0 dpf)의 첫번째 날의 끝에서 배아 매체 (E3) 200 µ M 1-페 닐 2-thiourea (PTU), 치료의 50 mL에 28.5 ° C에서 배아를 올립니다.</li>
		<li>변화는 E3 + 실험 기간 동안 매일 통해 매체.</li>
		<li>Mpeg1:eGFP 및 NBT:DsRed 애벌레 2 dpf 긍정적인 transgene 식, GFP+ 세포/microglia 및 DsRed+ 뉴런에 대 한 형광 stereomicroscope를 사용 하 여에서 화면.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 미디어, 오염을 피하기 위하여 조직 문화 후드 실험 전날 준비 다음 4 ° c.에서 그들을 저장합니다<ol>
<li>15 mM Hepes, HBSS 1에서에서 25 m m D-포도 당을 용 해 하 여 준비 하는 미디어 A x.</li>
		<li>HBSS 10의 1 볼륨에 밀도 그라데이션 매체의 9 볼륨을 혼합 하 여 밀도 그라데이션 매체 (100%)를 준비 x.</li>
		<li>밀도 그라데이션 매체 (22%)을 준비 하는 DPBS 1의 88 ml에서 밀도 그라데이션 매체 (100%)의 22 mL를 diluting 하 여 x.</li>
		<li>준비 하는 DPBS 1 x.</li>
		<li>E3 매체 + Tricaine 450 μ M으로 E3 매체를 혼합 하 여 준비 Tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 균질
참고: 모든 단계는 수행된 4 ° c.
<ol><li>90 mm 페 트리 요리 E3 배아 매체 200 µ M 말기 그들을 anesthetize를 통해 치료의 50 ml 50 애벌레를 1.5 mL Tricaine (15 m m)를 추가 합니다.<ol>
<li>3 mL 파스퇴르 대량 플라스틱 피 펫과 페 트리 디쉬에서 10 마 취 애벌레 빨 아.</li>
		<li>취 전송 애벌레 55 mm 페 트리 접시에 10 10 얼음 E3 배아 매체 + Tricaine로 가득합니다.</li>
		<li>Stereomicroscope, 아래 10 애벌레 페 트리 접시의 중앙에 맞춥니다. 다음 노 른 자-sac 수술 마이크로-가 위 (수영 방광을 피하기 위해 머리를 부동 제외)를 사용 하 여 위에 애벌레 머리 transect.</li>
		<li>3 mL 파스퇴르 대량 플라스틱 피 펫과 페 트리 디쉬에서 빨 아. 모든 머리 피 펫 팁 내에서 수집 하 고 다음 1 mL 차가운 미디어 A를 포함 하는 유리 균질 화기로 전송 될 때까지 기다립니다 (전송 미디어를 줄이기 위해 최소 볼륨에서 희석 e 3 + Tricaine). 얼음에 유리 균질 화기를 유지. 실험 조건 당 한 균질 화기를 사용 합니다.</li>
		<li>각 작은 페 트리 접시를 포함 하는 얼음 교체 차가운 E3 + Tricaine 새 것으로 그 transection 보장 하기 위해서 모든 30 분 차가운 E3 + Tricaine에서 수행 하는 매체.</li>
		<li>색상 페이딩 시작 유리 균질 화기에 얼음 처럼 차가운 미디어 A를 교체 합니다. 참고: 미디어 A 희석 온도 변화 머리 조직을 변경할 수 있습니다.</li>
		<li>모든 머리 수집 된 일단 (600 머리/조건), 유리 균질 화기에서 미디어의 최대 볼륨을 제거 하 고 신선한 얼음 처럼 차가운 미디어 a 1 mL와 함께 그것을 대체합니다</li>
		<li>얼음 꽉 유리 균질 화기와 뇌 조직 방해. 3-5 dpf 애벌레 및 7 및 8 dpf 애벌레에 대 한 50의 분쇄 40 라운드를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 현 탁 액에 미디어 A의 2 개 mL를 추가 (1 mL 미디어 A 200 / 머리), 세포를 희석 하 고 수 초 밀도 그라데이션 매체에서 원심 분리 하는 동안 그들의 분리를 촉진 하기 위하여와 그들의 덩어리를 줄이기 위해.<ol>
<li>세포 덩어리를 제거 하려면 얼음에 유지 찬 50 mL 팔 콘 튜브 위에 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 실행 합니다. 3 번이이 작업을 반복 합니다.</li>
		<li>차가운 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액 1 mL를 전송 및 4 ° c.에서 10 분 300 g에서 그들을 회전합니다</li>
		<li>10 mL 주사기를 사용 하 여 상쾌한 제거 + 바늘 23G x 1'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다시 1 mL의 얼음 처럼 차가운 22% 밀도 그라데이션 부드럽게 차가운 DPBS 1의 0.5 mL에 의해 중첩 된 셀 펠 릿을 일시 중단 (그들, 두 솔루션 사이의 interphase 나타납니다 혼합 하지 마십시오) x.<ol>
<li>4 ° c.에 30 분 동안 느린 가속 및 브레이크 없이 950 g에서 튜브를 회전 참고: 이 단계는 DPBS 1의 interphase에 격리 하 여 다른 셀에서 myelin를 분리 x와 22% 밀도 그라데이션 매체, 반면 셀 튜브의 하단에 작은 것입니다. 수 초 제거 세포 농도가 너무 높은 경우 더 효율적입니다.</li>
		<li>그들의 interphase 10 mL 주사기 + 바늘 23G x 1' 삭제 DPBS, 밀도 그라데이션 매체 및 myelin의 최대 갇혀 사용 하.</li>
		<li>미디어의 0.5 mL + 2% 정상 염소 혈 청 (NGS)의 세포를 씻어 다음 4 ° c.에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전</li>
		<li>상쾌한, 최대 삭제 다음 미디어 A + 2%의 동일한 실험 조건 함께 1 mL에서에서 모든 셀 펠 릿 풀 NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관심사의 세포 대 식 세포/microglia mpeg1:eGFP에서 처럼 형광 단백질 또는 NBT:DsRed 유전자 변형 물고기 (유전자 변형 물고기 1.1.3의 심사), 35 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 실행에서 뉴런 뚜껑과에 그들을 전송 하는 경우는 차가운 5 mL FACS 빛 으로부터 보호과 얼음, 튜브. 참고: Microglia의 면역 얼룩을 또는, 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>3. Microglia Immuno 얼룩이
참고: 4 ° c.에 모든 단계를 수행
<ol><li>다시 미디어 A + 2%의 0.3 mL와 함께 셀 펠 릿을 일시 중단 NGS. 3 x 1.5 mL 튜브에 그들을 분할: 흠 없는 세포 비 특정 바인딩 microglia 및 세 번째 시험으로 이차 항 체의 측정을 이차 항 체 (1/200)에 대 한 관심의 셀에서 자동 형광 두 번째 측정 한 (4C 4 마우스 단일 클로 널 (해당 microglia)는 항 체 (1/20) + 2 차 항 체 (1/200)).<ol>
<li>낮은, 아 지 드 무료 (잎) 세포 (모든 튜브)를 1%에서 면역 글로불린의 Fc 도메인 CD16/CD32 상호 작용을 차단 하를 추가 합니다. 부드러운 동요 매 5 분으로 10 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>4C 4 추가 항 체 (1/20) 셀 (관 3)와 품 어 부드러운 교 반으로 30 분 마다 10 분.</li>
		<li>4 ° C에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전 다음 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>일단 미디어 A + 2 %0.5 mL와 NGS, 다음 4 ° c.에서 10 분 300 g에서 튜브 회전 세척</li>
		<li>미디어 A + 2%의 0.5 ml와 함께 셀 펠 릿 다시 중단 NGS와 부드러운 동요 매 5 분으로 10 분에 대 한 1%에서 잎 세포를 품 어.</li>
		<li>셀 (튜브 2와 3)를 이차 항 체 (1/200)를 추가 합니다. 매 10 분 및 가벼운 보호 부드러운 동요와 30 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>4 ° C에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전 한 다음 상쾌한 삭제.</li>
		<li>미디어 A + 2%의 1 mL와 함께 미디어 A + 2%, NGS 다음 다시 일시 중지 셀 펠 릿의 0.5 mL로 두 번 세척 NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>35 µ m 셀 스 트레이너 모자를 통해 세포 현 탁 액을 실행 하 고 빛 으로부터 보호 하는 얼음에 차가운 5 mL FACS 튜브로 그들을 전송.</li>
</ol>4입니다. 셀 정렬 (FACS)
참고: 4 ° c.에 모든 단계를 수행
<ol><li>신경 세포, 대 식 세포/microglia 및 microglia를 FACS를 사용 하 여 정렬 합니다. 참고: 이 단계는 일반적으로 FACS 시설의 직원에 의해 수행 하 고 설정을 사용 하는 장비의 유형에 따라 다릅니다.<ol>
<li>죽은 세포를 각 FACS 튜브에 1 µ g/mL의 농도에서 DAPI를 추가 합니다.</li>
		<li>모든 뇌 세포에서 FACS 및 정렬 신경 세포, 대 식 세포/microglia 또는 microglia를 설정 합니다. 그들의 크기, 단위, 그리고 앞으로 분산형 및 사이드 분산형 게이트 단일 세포의 기능에 있는 파편에서 별도 셀. DAPI에서 라이브 셀 라벨에 의해 죽은 세포를 제외 합니다. 그들의 각각 긍정적인 얼룩에 의해 신경 세포, 대 식 세포/microglia 또는 microglia를 식별 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 미디어 A + 2%의 1 mL를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 NGS 얼음에. 다른 튜브를 사용 하 여 각 세포 유형에 대 한.<ol>
<li>4 ° C에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전 하 고는 상쾌한 다음 삭제.</li>
		<li>미디어의 0.5 mL로 한 다음 삭제 상쾌한 최대 한 번 씻는 다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA 추출
<ol><li>FACS를 구분 하는 다른 세포 유형에서 RNA를 추출 합니다. RNA 추출에 대 한 특정 키트를 사용 하 고 제조업체의 지침을 따릅니다. 청소 작업 영역 및 RNase 오염 제품 펫 RNase 무료 환경에서 작동 하는 필터 팁을 사용 하 여 확인 합니다.<ol>
<li>갓 50 µ M β-mercaptoethanol 보충 하는 세포의 용 해 버퍼의 1 mL를 준비 합니다. 참고: 여기서, β-mercaptoethanol RNA 저하를 줄이기 위해 추가 됩니다.</li>
		<li>무료 물 70%와 80% 에탄올 솔루션 RNase를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
		<li>세포 세포의 용 해 버퍼 50 µ M β-mercaptoethanol 보충의 75 µ L lyse 다음 세포 파쇄를 분쇄기를 사용.</li>
		<li>제조 업체에 따라 RNA 추출의 매뉴얼을 계속 한다.</li>
		<li>프로토콜의 끝에, 충분 한 RNA 농도를 RNase 무료 물 14 µ L로 RNA elute.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chrast, R., Scott, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mouse+Brain+Transcriptome+by+SAGE:+Differences+in+Gene+Expression+between+P30+Brains+of+the+Partial+Trisomy+16+Mouse+Model+of+Down+Syndrome+(Ts65Dn)+and+Normals.">The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals.</a> Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).</li><li>Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. 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저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 실험 프로토콜 8 dpf에 3에서 zebrafish 애벌레에서 뇌 세포를 분리 하는 강력 하 고 효율적인 방법을 나타냅니다. 중요 한 것은, 이것은 첫 번째 프로토콜에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia의 특정 격리를 허용입니다. 프로토콜은 세포 막의 무결성을 유지 하 고 처리 하는 동안 발생 하는 유전자 발현의 잠재적인 수정 최소화 하기 위해 설계 되었습니다. 이 마지막 점은 그 고립 된 세포 게놈 프로 파일의 분석에 따라 결과의 관련성에 대 한 중요 한 있습니다. 실제로, microglia 및 macrophage 분극 강하게 그들의 microenvironment에 의해 영향을 받습니다. 37 ° C에서이 세포 실험 조건 (부상 (transection) 응답)에 자신의 유전자 식 프로필을 변경 것입니다. 따라서, 그것은 이전 세포 프로세스 및 신진 대사 활동을 천천히 RNA 추출, 4 ° C에서이 실험을 수행 하는 중요 한 했다. 또한, 기계적 뇌 조직 균질 4 ° C에서 37 ° C에서 효소 조직 소화 대신 유전자 식 프로필에 어떤 영향을 피하기 위해 선정 되었다.
이 메서드는 매우 빠른; 강조 하는 것이 중요 하다 하루 내 여러 뇌 세포 인구는 적어도 두 개의 다른 실험 조건 및 그들의 RNA 추출에서 격리 될 수 있습니다. 프로토콜의 총 길이 애벌레 머리의 transection 제한 단계 (∼ 350 머리/h)으로 각 조건에 대해 사용 하는 애벌레의 수에 따라 달라 집니다. 일반적으로 3에서 microglia를 작업할 5 및 7 dpf이 좋습니다 transect ∼ 600 머리 (표 1)를 추출 하는 충분 한 RNA를 시험 당 하. Microglia 셀 형식을 나타내는 낮은 산출 (7 dpf에 인당 약 112 세포), 대 식 세포 (7 dpf에 인당 약 170 세포)를 포함 하 여 다른 세포 유형 머리의 수를 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜의 또 다른 장점은 FACS 정렬 설정이 설정 된 후 동일한 설정을 사용할 수 있는 다양 한 실험에 대 한. 그것은 세포 인구 맞는 완벽 하 게 한 실험에서 다른 이전 설계, 게이츠와 함께이 메서드를 사용 하 여 실험의 재현성을 보여주는 관찰 되었습니다.
이 방법의 약간의 불리는 수확 하는 RNA의 상대적으로 낮은 금액입니다. 그러나,이 제한은 microglia 수로 두뇌 개발 (표 1)의 초기 단계에서 매우 낮은 기술적인 문제 보다는 더 많은 생물 학적 문제입니다. 수집 하는 RNA의이 낮은 양 때문에 증폭 단계 게놈 넓은 유전자 표정 분석을 수행 하기 위해 고려 될 필요가 있다. 다행히도, 이러한 증폭 단계 고품질 cDNA의 충분 한 양을 생산. 따라서, 고립 된 세포의 유전자 식 프로필에 글로벌 변화는 공부 될 수 있다.
결론적으로,이 프로토콜에는 격리 하 고 애벌레 zebrafish 두뇌에서 다양 한 CNS 셀 유형을 공부 강력한 방법을 제공 한다. 이것은 또한 질병에 그들의 역할을 연구로 개발 하는 동안이 세포의 깊은 이해를 얻기 위해 적용할 수 있습니다.

두뇌 개발 및 뇌 질환에 대 한 지식을 마우스 뇌 transcriptomes1의 첫 번째 정량화 이후 지난 10 년간에서 크게 개선 했다. 실제로, 게놈 넓은 유전자 표정 분석 우리에 액세스할 뇌 조직 및 보완 하 고 관측 다른 기술 및 도구를 향상 시킬 수 있는 셀에 대 한 자세한 유전 정보.
제 브라는 쉽게 번 식 하 고 유전자; 수정 강력한 생물 학적 모델 애벌레 단계에서 광학 투명도 라이브 이미징 관찰2수 있습니다. 불행 하 게도, 인간을 비교 하 고 마우스, immuno 얼룩이 수행에 사용할 수 있는 항 체의 수는 오히려 낮은. 이 문제를 해결 하려면 유전자 변형 zebrafish 물고기 라인 쉽게 만들어집니다 유전자 물고기를 수정 하 여 셀 형식 특정 발기인에서 형광 단백질을 표현 하. 유전자 변형 zebrafish 라인 중앙 신경 시스템 (CNS) 개발 및 질병3,4,,56동안 microglia 및 대 식 세포의 역할을 공부 하는 과거에 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 프로세스의 상세한 이해를 얻기 위해 우리가 해당 셀 형식에서 유전자 발현에 변화를 이해 해야 합니다. 이 목표를 우리는 특별히 신경 세포, 대 식 세포 및 8 일 3에서 microglia 같은 세포를 분리 하는 실험 방법 개발 후 수정 (dpf) 애벌레 zebrafish 두뇌. 프로토콜의 설립에 대 한 우리 신경 신경 ß-tubulin 아래에 있는 대 식 세포 표현 유전자 발기인 (mpeg1:eGFP) 및 DsRed 세포/microglia에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 유전자 변형 물고기 라인 근무 발기인 (NBT:DsRed)7,,89. 또한, 우리는 immuno 얼룩이 microglia 4C 4, 특별히 zebrafish microglia10,11얼룩 마우스 단일 클론 항 체를 사용 하 여의 수행. 이후에, ribonucleic 산 (RNA) 추가 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 또는 transcriptome 분석에 대 한 이러한 세포에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 zebrafish 애벌레;에서 뇌 조직을 효율적으로 균질 하도록 설계 되었습니다. 신경 세포, 세포/microglia 및 그들의 원형질 막 무결성의 변경 없이 microglia를 수집 하 고 마지막으로 높은 품질의 이러한 세포에서 RNA 추출 (린 > 7) 및 게놈 분석을 수행 하는 수량. 뇌 조직12,13소화를 트립 신 처리 37 ° C에서 사용 하는 연구에 대 한 이전 게시, 달리이 프로토콜 RNA 추출 단계를 줄이기 위해 유전자 식 프로필의 수정까지 4 ° C에서 작업을 촉진 합니다. 이 단계는 결정적으로 microglia 및 대 식 세포는 매우 중요 한 세포는 그들의 진 식 프로필과 분극14,15, 를 변경 하 여 즉시 그들의 microenvironment에 있는 변화에 응답 16.
세부 사항에, 여기에 설명 된 프로토콜 신경 세포, 대 식 세포 및 microglia zebrafish 애벌레 두뇌에서 거의 그것의 다른 셀에 적용할 수 있습니다 보여줍니다 뇌-유전자 변형 물고기 라인을 사용 하 여 내 제시 또는 함께 표시 특정 항 체입니다. 이 방법은 그들의 게놈 넓은 유전자 표정 분석을 통해 CNS 세포의 더 나은 특성화 고 개발 및 뇌 질환 중 그들의 역할을 이해 하는 데 도움이 됩니다.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 90mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>Surgical micro-scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Pasteur plastic bulk pipette</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>Glass homogenizer</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 55mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylen conical tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Needle 23G x 1&#039;&#039;</td><td>BD</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Cell Signalling</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m cell strainer cap</td><td>BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS sorter FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI, FACS facility</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 Real-Time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq System V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains

개발 또는 설립 중 다른 CNS 세포의 역할에 대 한 상세한 이해 및 두뇌 병 리의 진행을 얻으려면, 그것은 그들의 유전자 식 프로 파일을 변경 하지 않고 이러한 세포를 분리 하는 것이 중요. Zebrafish 모델 제공 많은 유전자 변형 물고기 라인 있는 특정 세포 유형 표시 됩니다; NBT:DsRed 선 또는 대 식 세포/microglia mpeg1:eGFP 라인에서 하는 예를 들어 신경에 대 한 또한, 항 체 개발 되었습니다 microglia 4C 4와 같은 특정 세포를 얼룩이 항 체.
여기, 우리 신경 세포, 대 식 세포에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia의 설명. 이 프로토콜은 셀룰러 프로필을 수정할 수 있는 37 ° C에서 효소 조직 소화의 회피입니다. 4 ° C에서 조직 균질의 기계 시스템 대신 사용 됩니다. 이 프로토콜 세포 현 탁 액으로 두뇌의 균질, 그들의 immuno 얼룩이 지 고 신경 세포, 대 식 세포 및 FACS에 의해 microglia의 격리를 의미 한다. 이후에, 우리는 그 세포에서 RNA를 추출 하 고 그들의 품질/수량 평가. 우리는 고품질의 RNA를 관리 (RNA 무결성 번호 (린) > 7) 세포/microglia 및 신경, 그리고 transcriptomic microglia 분석에서 정량 수행 하. 이 방법은 개발 및 pathologies에 그들의 역할에 대해 명확 하 게 이해로 서이 세포의 더 나은 특성을 수 있습니다.

설명된 프로토콜은 신경 세포, 대 식 세포 및에서 zebrafish 애벌레 두뇌 microglia 분리 간단 접근 이다. 이들에서 고립 세포, 높은 품질의 상당수 (린 > 7) RNA 추출 되었다. 이 프로토콜의 목표 분석 및 셀 속성 및 기능 특성에 그들의 유전자 식 프로 파일의 최소 수정 CNS에서 다른 종류의 세포를 분리 하는. 따라서, 전체 프로토콜 기계적 뇌 조직 균질 화와 4 ° C에서 수행 됩니다. 이 방법은 실험실에서 수행 하는 두 개의 연구 성공적으로 사용 되었습니다. 첫 번째 연구에서 신경 세포와 대 식 세포/microglia 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ 애벌레 (그림 1)에서 분리 했다. 그들의 크기의 기능에서 파편에서 셀 분리를 허용 하는 FACS (FSC-A) 및 세분성 (SSC-A) (그림 1A). 단일 셀 다음 남자 또는 세포 응집 체 (그림 1B)에서 분리 되었다. 단일 세포 인구에서 죽은 세포 (DAPI+)를 제거 하는 게이트 그려 했다. 해당 점 플롯으로 죽은 세포의 비율은 26.7% (그림 1C)만이 실험 프로토콜 세포 원형질 막 무결성을 보존 공개 했다. 마지막으로, 신경 (DsRed+)와 대 식 세포/microglia (GFP+) 쉽게 라이브 셀 인구 게이츠에서 차별 했다. 신경 인구 (23.1%) (그림 1D) 뇌 내 세포/microglia 인구 (1.56%) 보다 더 두드러진 것으로 나타났다. 이 프로토콜을 신경 세포와 대 식 세포/microglia 사이 특정 유전자의 표정을 비교할 후속 정량 분석을 수행 하려면 그 세포에서 RNA를 분리를 허용 했다. 그림 2 쇼 신경 고 증식 세포 핵 항 원 (pcna)예를 들어 β-걸 집 지키는 유전자에 대 한의 대 식 세포/microglia 유전자 식 수준.
두 번째 연구에 대 한이 방법은 3, 5, 7 dpf 애벌레 두뇌 microglia 절연에 집중 했다. 위에서 설명한 실험과 달리 세포 면역 염색에 의해 고립 되었다 4C 4, 특히 라벨 microglia (그림 3 A D)는 항 체를 사용 하 여. 앞에서 설명한, microglia (4C 4+) 라이브 셀에서 선정 됐다 고 (그림 3D) 수집. Zebrafish 애벌레 두뇌 내의 Microglia 번호는 변수 (표 1), 3 dpf (물고기 당 25 ∼)에서 매우 낮은. 그 세포에서 추출 된 RNA의 양과 품질 마이크로 모 세관 전기 이동 법 기반 시스템을 사용 하 여 측정 되었다. 결과 5 dpf 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia에서 추출 된 RNA의 RNA 분석 (표 1 (5 dpf; 실험 4))의 예를 보여 주기 위해 제공 되었습니다. 그림 4 는 전기 추적 및 리보솜 RNA (28s와 18s)의 명확한 시각화로이 샘플에 대 한 얻은 그것의 그래픽 표현. 이 데이터는 샘플 린 계산 하 고 RNA 농도 결정 하는 데 필요한. 표 1 절연된 microglia 생선과 microglia 당 RNA의 양을 각각 다른 실험 3, 5, 7 dpf에 대해 린 점수 당 수를 요약 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 격리 microglia에서 추출 된 RNA의 품질과 양을 키트를 사용 하 여 cDNA로 RNA를 증폭 수 있었습니다. 에 딘 버 러 유전체학에서 제공 하는 품질 및 수량 테스트 증폭된 cDNA 라이브러리 준비 및 후속 시퀀싱에 대 한 충분 한 품질의 확인. 그림 5 는 cDNA 조각 및 전기 이동 시스템을 사용 하 여 측정 하는 그들의 금액의 크기 분포를 보여준다. 이 샘플에는 cDNA 36100의 농도에 299bp의 평균 크기를 했다 pmol/l. 표 2 는 각각 RNA 샘플 (표 1 (5 dpf; 실험 4))에서 증폭 된 cDNA에서 품질과 수량 테스트를 보여 줍니다. 증폭된 cDNA는 시퀀싱을 위해 성공적으로 사용 되었습니다.
실험실에서 수행 하는 여러 연구 확인 품질 신경 세포, 대 식 세포 및 microglia에서 추출 된 RNA의 수량 및 후속 정량 및 게놈 넓은 진 식 분석에 사용할 수 있습니다. 따라서,이 실험 프로토콜 안정적으로 막 무결성을 변경 하 고 그들의 유전자 식 프로 파일의 수정에 제한 하지 않고 CNS 세포의 다른 종류를 분리 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> 그림 1 : 신경 세포와 대 식 세포/microglia mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 에서 8 dpf zebrafish 애벌레 정렬 FACS. (A-C) 연속 게이팅의 모든 뇌 세포 () 순차 선택, 앞으로 분산형과 측면에 의해 단일 셀 분산형 (B). (C) 죽은 세포 DAPI 라벨에 의해 제외 되었습니다. (D) 신경 세포 및 대 식 세포/microglia 각각 DsRed와 GFP 긍정적인 얼룩에 의해 확인 되었다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> 그림 2 : 유전자 표정 분석 pcna 및 신경 세포와 대 식 세포/microglia β-말라 . 격리 된 신경 세포와 대 식 세포/microglia RNA 정량 PCR 분석에 사용 하기 위해 cDNA에는 복사할 수 수 있습니다. 격리 된 신경 세포와 대 식 세포/microglia 정량에 의해 결정에서 β-걸 집 지키는 유전자에 대 한 pcna 의 mRNA 식 레벨 (N = 3). 배 변화 비교 (ΔΔCT) 메서드를 사용 하 여 측정 했다. 오차 막대 대표 평균 ± SEM. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> 그림 3 : FACS microglia 3 dpf zebrafish 애벌레에서에 대 한 정렬. (A-C) 연속 제어 순차 선택 모든 뇌의 세포 (A), 앞으로 분산형과 측면에 의해 단일 셀 분산형 (B). (C) 죽은 세포 DAPI 라벨에 의해 제외 되었습니다. (D) Microglia 4C 4에 의해 확인 되었다 긍정적인 얼룩이 지기. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> 그림 4 : 5 dpf zebrafish microglia에서 추출 된 RNA의 마이크로 모 세관 전기 이동 법 결과. 두 개의 큰 봉우리는 18와 28S ribosomal RNA. RNA 무결성 번호 (린)은 28S ribosomal 소 단위는 18의 생성된 비율 및 전체 전기 이동 추적의 분석을 사용 하 여 bioanalyzer 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 됩니다. Microglia RNA 린 8.6 있다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> 그림 5 : 5 dpf zebrafish microglia의 RNA 샘플에서 증폭 된 cDNA의 품질과 수량 테스트. 화면은 299의 평균 크기를 가진 cDNA 조각 크기 분포 분석된 샘플의 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>조건</td>
			<td>실험</td>
			<td>물고기 수</td>
			<td>휴대폰 번호</td>
			<td>물고기 당 휴대폰 번호</td>
			<td>RNA 농도 (pg/ul)</td>
			<td>총 RNA (pg)</td>
			<td>셀 (pg) 당 RNA 금액</td>
			<td>린 점수</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19.94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0.26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54.18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0.09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0.06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0.06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: microglia 격리 및 3, 5, 7 dpf zebrafish 애벌레에서 RNA 추출 데이터의 요약.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>내부 샘플 ID</td>
			<td>외부 샘플 ID</td>
			<td>큐 비트 (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>평균 농도 (ng/ul)</td>
			<td>볼륨 (ul)</td>
			<td>ug 받은</td>
			<td>최소 농도 대 한 합격/불합격</td>
			<td>Minimim 수량에 대 한 합격/불합격</td>
			<td>권장된 수량에 대 한 합격/불합격</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (실험 4)</td>
			<td>58.8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58.6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>패스</td>
			<td>패스</td>
			<td>패스</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">샘플 라이브러리 준비에 대 한 요구 사항:</td>
		</tr>
<tr>
<td>라이브러리 준비</td>
			<td>최소 수량 (ng)</td>
			<td>권장된 수량 (ng)</td>
			<td>최소 농도 ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq 나노 젤 cDNA에서 무료 350 bp 삽입 라이브러리</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 5의 dpf zebrafish microglia의 RNA 샘플에서 증폭 된 cDNA의 수량 테스트 합니다.

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Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

우리는 신경 세포, 대 식 세포 및에서 생리 및 병 적인 조건 하에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia 분리 프로토콜을 제시. 절연, 시 RNA 유전자 식 프로필 분석 하이 셀에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 정량 및 transcriptomics 같은 다운스트림 분석에 대 한 높은-품질 RNA의 컬렉션에 대 한 수 있습니다.

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K 조회수.  University of Edinburgh. 우리는 신경 세포, 대 식 세포 및에서 생리 및 병 적인 조건 하에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia 분리 프로토콜을 제시. 절연, 시 RNA 유전자 식 프로필 분석 하이 셀에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 정량 및 transcriptomics 같은 다운스트림 분석에 대 한 높은-품질 RNA의 컬렉션에 대 한 수 있습니다.

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Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

연구

발생학

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Single-Cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장세포 처리

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

저자 스포트라이트: 위장 발달의 전사체학적 측면을 조사하기 위한 제브라피시 유충의 장 세포 분리 및 분석 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

신경과학

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

신경 염증 및 신경 독성을 평가하기 위해 유충 제브라피쉬에 지질 다당류의 뇌실 미세 주입

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

세제 및 효소 없는 방법을 사용하여 조직 전체에서 핵 분리

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

생물학

Brain Cell Isolation from Zebrafish Larvae: A Technique to Obtain Intact Neurons, Macrophages, and Microglia from Zebrafish Brain Tissue

Source: Mazzolini, J. et al. <a href="https://www.jove.com/v/57431/isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval">Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a protocol to isolate neurons, macrophages, and microglia from larval zebrafish brains by mechanically disrupting the brain tissue. The purified cell populations can further be used for genomic analysis.

제브라피시 유충에서 뇌 세포 분리: 제브라피시 뇌 조직에서 온전한 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 얻는 기술

Source: Mazzolini, J. et al. Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains. J. Vis. Exp. (2018)
This ...

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

요약

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성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

신경 염증 및 신경 독성을 평가하기 위해 유충 제브라피쉬에 지질 다당류의 뇌실 미세 주입

세제 및 효소 없는 방법을 사용하여 조직 전체에서 핵 분리

제브라피시 유충에서 뇌 세포 분리: 제브라피시 뇌 조직에서 온전한 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 얻는 기술