이 프로토콜은 대식세포 기능을 조작하고 평가하기 위해 애벌레 얼룩말 대식세포에 관심있는 약물을 대상으로하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 약물이 특히 리포솜 캡슐화를 통해 대식세포에 표적으로 한다는 것을 확인해서 침수와 같은 전통적인 약 납품 전략에 비해 이점이 있습니다. 염증 성분을 가진 질병의 제브라피시 모델에 적용될 때, 이 기술은 대식세포가 병리학 적 과정에 기여하는 방법을 해결할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.
여기서, 우리는 활성화를 억제하기 위해 대식세포에 미토콘드리아 반응성 산소 종 억제 약물을 표적으로 하여이 기술의 유용성을 입증한다. 애벌레에 약물로드 리포솜의 미세 주입은 도전이 될 수 있습니다, 과도한 상피 손상을 유발하지 않도록주의가 취해야하기 때문에, 잠재적으로 면역 학적 연구에 영향을 미치는. 이 프로토콜의 시각적 데모는 단일 실험실에서 일상적으로 수행되지 않을 수 있는 약리학 및 전체 동물 라이브 세포 방법론을 수반하기 때문에 중요합니다.
25 밀리리터 라운드 하단 플라스크에서 10 밀리그램의 리포솜을 준비하려면 31 나노몰라의 마린 블루와 미토콘드리아 반응성 산소 종 억제 약물의 300 나노몰라를 플라스크에 첨가하십시오. 진공 압력하에서 분당 섭씨 75도 회전시 45도 이상의 회전 증발기에서 용매를 천천히 제거하여 간단히 초음파 처리합니다. 플라스크의 유리 벽 내에 건조한 지질 박막이 형성되면, 유기 용매의 완전한 제거를 용이하게하기 위해 질소 하에서 45 분 동안 필름을 더 건조시키십시오.
다음으로, PBS의 1 밀리리터로 필름을 수화하고, 플라스크를 파라핀 필름으로 밀봉한 후 플라스크를 60도 의 수유 욕조에 손으로 교반합니다. 7사이클의 동결 및 해동 후, 미니 압출기와 1마이크로미터 트랙 에칭 폴리카보네이트 멤브레인을 사용하여 2~6사이클 동안 리포좀을 돌출합니다. 큰 unilamellar 소포가 얻어졌을 때, 초원심 분리에 의해 펠릿에 신선한 리포솜을 응축합니다.
펠릿에 1%폴로사머 188 용액1밀리리터로 1밀리리터188 용액을 섭씨 45도, 밀리터리 마이크로센시르후지 튜브 부착이 있는 ThermoMixer에서 분당 750회 회전하는 데 30분 동안 배양합니다. 폴로사머(188)를 리포솜에 삽입하는 동안, 정확한 폴로사머 농도, 인큐베이션 시간 및 온도는 결과 리포솜의 최적의 물리화학적 특성을 달성하는 데 중요하다. 인큐베이션의 끝에서, 초원심분리는 동일한 원심분리기 조건하에서 혼합물을 다시 분리하고, 임의의 언바운드 중합체 또는 약물을 포함하는 상퍼나탄을 제거한다.
그런 다음 빛으로부터 보호되는 리포솜 펠릿을 섭씨 4도에 보관하십시오. 리포솜의 크기와 제타 전위를 결정하기 위해 리포솜 제형을 1 대 100 비율로 초순수물로 희석한다. 동적 광 산란 분석기를 사용하여 입자 크기, 다분산도 지수 및 제타 전위를 섭씨 25도에서 측정합니다.
리포솜의 함정 효율과 약물 적재를 계산하려면 트리톤 X-100에서 리포솜을 용해하십시오. 용존 리포솜 샘플 20마이크로리터를 쿼터니펌프, 230나노미터로 설정된 다이오드 어레이 검출기, 3마이크로미터, 250배-4.6mm 컬럼을 갖춘 고압 액체 크로마토그래피 시스템에 주입한다. 주사를 위해 형질전환 제브라피시 유충을 준비하려면 미세 팁 집게를 사용하여 수정 후 30 시간 배아를 수동으로 데코리오네이트하고 배아가 2 일 후 수정까지 섭씨 28.5도에서 개발할 수 있도록하십시오.
배아가 적절한 단계에 도달하면, 멸균 PBS에서 1 대 1 비율로 갓 준비 된 리포솜 제형을 희석하고, 소용돌이에 의해 2 ~ 3 초 동안 용액을 혼합한다. E3 배지에 충분한 3%의 메틸 셀룰로오스를 35mm 배양 접시 뚜껑의 뚜껑에 붓고 전체 표면을 덮는 얇은 필름을 형성합니다. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 약 20~25개의 마취유충 풀을 수집합니다.
배아가 중력에 의해 파이펫의 끝에 집중하고, 조심스럽게 최소한의 용액으로 35 밀리미터 배양 접시 뚜껑의 중간에 유충을 전송 할 수 있습니다. 마이크로 모세관 로더를 사용하여 주사제판 의 상단쪽으로 애벌레를 배치하여 등쪽 표면이 미세 주입 바늘을 향하여 마이크로 주입 바늘을 향하게 하거나, 주위 베노에 주입하기 위해 미세 주입 바늘을 향하여 주입 판의 왼쪽쪽으로 전방을 배치하십시오. 마이크로 모세관 로더를 사용하여 리포솜 주입 믹스의 약 5 마이크로 리터로 주사 바늘을 다시 채웁니다.
바늘을 자기 스탠드 및 압력 인젝터에 연결된 미세 조작기에 장착하고 스테레오 현미경 아래에 설치를 배치합니다. 깨끗하고 미세한 집게를 사용하여 미세 주입 바늘의 끝을 잘라 직경약 5 마이크로미터의 개구부를 생성합니다. 인젝터를 약 50밀리초의 펄스 지속 시간과 평방 인치당 약 40파운드의 주입 압력을 설정합니다.
주입할 부피를 보정하기 위해 혈류계의 그리드 라인에 위치한 미네랄 오일 한 방울에 볼러스를 주입합니다. 그런 다음 볼루스의 직경이 가장 작은 그리드 라인의 2 1/2를 덮을 때까지 펄스 지속시간 및/또는 사출 압력을 조정합니다. 각 애벌레의 뒷뇌 심실에 리포솜 주입 믹스의 나노리터 1개를 조심스럽게 주입합니다.
주사 직후, 주사판에 E3 배지를 추가하고 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 메틸 셀룰로오스에서 유충을 부드럽게 교반합니다. 물 침지 렌즈가 장착된 공초점 현미경으로 힌드뇌의 등쪽 표면을 이미지화하기 위해 먼저 35mm 배양 접시를 장착 매체로 5밀리미터 깊이로 채우고 중간 중합체를 허용한다. 실험배아의 노른자 낭을 수용할 수 있는 충분한 면적의 아가로오스에 작은 트렌치를 발굴하고, 마취된 유충을 수거하기 위해 용융 장착 매체로 채워진 플라스틱 이송 파이펫을 사용한다.
즉시 유충을 문화 접시에 넣고 마이크로 모세관 로더를 사용하여 노른자 삭 복부 면을 발굴 된 구멍으로 방향을 지정합니다. 아가로즈가 중합될 때까지 이 위치에서 배아를 유지한다. 트리사인 밀리리터 당 200 마이크로그램으로 보충된 E3 배지로 배아를 덮어놓습니다.
뒷뇌 심실을 이미지화하려면 20배 목표를 선택하고 공초점 현미경을 512x x 512 픽셀 및 2.5x 줌으로 설정합니다. 현미경 매개 변수가 설정되면, 블루 형광 리포솜과 녹색 형광 대식파지를 이미지하기 위해 2 채널 이미징을 사용하여 뒤뇌의 등쪽 가장 표면에서 확장 40 x 3 마이크로 미터 Z 스택을 습득. 모든 이미지를 얻은 경우 파일을 적절한 3D 이미지 분석 소프트웨어 프로그램에 로드합니다.
측정 탭에서 개체 찾기 프로토콜을 드래그 작업으로 드래그하여 측정 공간을 만듭니다. DAPI 채널을 선택하여 리포솜을 강조 표시하고 Z 단면을 통해 검사 도구를 드래그하여 리포솜이 함유된 대식세포를 감지합니다. 개별 셀 내에서 리포솜의 형광 강도를 정량화하려면 클립을 관심 영역 으로 드래그 태스크로 드래그 하여 측정 공간을 만들고 사각형 도구를 사용하여 X, Y 및 Z 치수에 관심 있는 셀 주위에 상자를 그립니다.
그런 다음 측정 드롭다운 메뉴에서 측정 항목 만들기를 선택하여 라이브러리 창에 측정 파일을 생성합니다. 이 표에서, 생성된 리포솜의 크기, 제타 전위, 약물 적재 및 함정 효율이 요약된다. 관찰된 바와 같이, 리포솜의 입자 크기는 약물 적재와 유사하지만, 약물 적재 리포솜의 표면 전하는 해양 블루만으로 제어 리포솜보다 약간 더 중립적이다.
해양 청색 라벨 리포솜을 뒷뇌 심실로 미세 주입하면, 입증된 바와 같이, 주체 대식세포에 의해 빠르게 섭취하여 3시간 후 주입에 의한 공초점 현미경 검사법에 의해 용이하게 정량화될 수 있습니다. 호중구는, 그러나, 거의 세포내 리포솜을 포함하는 관찰되지 않습니다. 개별 리포솜이 함유된 대식세포 내에서, 리포솜은 지방분해 및 후속 약물 함량이 세포질로 방출되는 데 필요한 phagolysosomal 구획 내에 축적됩니다.
부비동 독소로의 전달은 순환을 통해 소달 조혈 조직 -상주 대식세포에 리포솜을 전달할 수 있습니다. 미토콘드리아 반응성 산소 종 억제 약물이 뇌 심실로 적재된 리포솜을 미세 주입하면 리포솜이 함유된 뒤뇌-상주 대식세포 내에서 단일나트륨 유레이트 결정 유도 미토콘드리아 반응성 산소 종 생산을 크게 억제할 수 있다. 대식세포 활성화 상태에 대한 관심있는 약물의 억제 효과의 추가 검증은 시상 혼성화 및 호중구의 측량 모집에 전체 마운트에 의해 염증성 사이토카인 유전자 발현을 조사함으로써 수행 될 수있다.
이 기술을 사용하여, 우리는 면역 대사 기계장치가 급성 조티 염증의 애벌레 얼룩말 부피 모형에 있는 그들의 활성화를 유도한다는 것을 확인하기 위하여 대식세포에 약을 표적으로 할 수 있었습니다. 이 프로토콜의 미래 적응은 대식세포 표적화를 향상시키거나 호중구와 같은 다른 면역 세포에 표적화를 촉진하기 위해 리포솜의 표면 수정을 수행하는 것을 포함할 수 있었다.
