부유 기반 T 세포 분리, 활성화 및 마이크로버블을 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 샘플로부터의 확장

마이크로버블 활성화 및 확장 프로토콜은 세포 치료제 연구 및 제조에서 충족되지 않은 주요 요구를 해결하고 T 세포 치료의 지속성과 효능을 개선하기 때문에 중요합니다. Akadeum의 부력 기반 포지티브 선택, 활성화 및 확장 기술은 활성화 및 확장 워크플로 중 과도한 자극과 후속 T 세포 고갈을 제한합니다. 시작하기에, 상업적으로 입수한 8번째 PBMC를 2.5 밀리리터의 분리 완충액에서, 비오티닐화된 항-CD3 항체와 함께 10회 3회 인큐베이션한다.

피펫팅으로 성분을 부드럽게 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 벗겨진 아비딘 마이크로 버블을 제조업체의 지침에 따라 0.5 : 1의 비율로 세포에 첨가하십시오. 그리고 상용 엔드-오버-엔드 로테이터를 사용하여 20 RPM에서 실온에서 10 내지 15분 동안 혼합한다.

실온에서 5 분 동안 400g으로 원심 분리합니다. 원심분리 후, 양성으로 선택된 세포는 벗겨진 아비딘 마이크로버블과 함께 현탁액의 상단에 있을 것이고, 선택되지 않은 나머지 세포는 튜브 바닥의 세포 펠릿에 있을 것입니다. 9인치 유리 피펫을 사용하여 버블 셀 층 아래의 팁을 튜브 바닥에 삽입합니다.

세포 펠릿과 하위 산액을 전자 피펫으로 흡인하고 새 튜브로 옮깁니다. 원래 튜브에 남아 있는 버블 셀 층을 완전한 T 세포 배지 1ml에 재현탁합니다. 상온에서 5분 동안 400g의 서브액액을 원심분리하고, 이를 간접 순도 측정 및 회수율에 사용한다.

하부액 및 선택되지 않은 세포를 원심분리한 후, 상청액을 흡인하고, 계수하기 전에 1밀리리터의 배지에 펠릿을 재현탁시킨다. 자동 세포 카운터를 사용하여 명시야 현미경으로 하산액의 세포를 계수하고 텍스트 원고에 설명된 대로 버블 세포 층에서 포획된 세포 수를 결정합니다. 접합된 항-CD28 박탈 아비딘 및 마이크로버블을 생성하려면 비오티닐화된 항-CD28 항체를 상업용 마이크로버블에 첨가하고 최소 2시간 동안 엔드 오버 엔드 회전을 사용하여 혼합합니다.

항-CD28 접합된 스트렙 아비딘 마이크로버블을 제조된 버블 세포 현탁액에 1.5:1의 비율로 첨가한다. 15분 동안 엔드 오버 엔드 회전을 사용하여 구성 요소를 혼합합니다. 그런 다음 얻은 세포 수에 따라 완전한 T 세포 배지 또는 다른 원하는 배지를 사용하여 총 부피를 밀리리터당 2백만 세포로 조정합니다.

24 웰 플레이트에 활성화 된 세포 1 밀리리터를 분배하고 섭씨 37 도의 가습 된 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 배양합니다. 24시간 후, IL-2 및 가용성 항-CD3을 첨가하여, 0일째에 플레이팅된 세포의 초기 수를 사용하여 계산된 바와 같이, 추가 확장을 촉진한다. 세포 플레이트를 가습 이산화탄소 인큐베이터에 다시 넣고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

2 일마다 중간 산액에서 배지의 절반을 제거하십시오. 신선하고 완전한 T 세포 배지로 교체하고 밀리리터 당 50 단위의 농도로 IL-2를 첨가하십시오. 세포 밀도를 평가하기 위해 T 세포를 매주 두 번 세십시오.

세포 밀도가 밀리리터 당 2 배 10에서 6 번째 세포 또는 2.5 배 10에서 6 번째 세포를 초과하면 더 큰 용기로 옮겨 밀리리터 당 5 배 10에서 5 번째 세포로 희석합니다. 위아래로 피펫팅하여 각 웰의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 마이크로 버블을 포함하여 우물의 전체 내용물을 제거하고 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다.

400 마이크로 리터의 칼슘이없고 마그네슘이없는 DPBS로 각 웰을 씻고 용액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 400g에서 튜브를 원심 분리합니다. 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 50 마이크로리터의 분리 완충액에 재현탁시킨다.

다음으로, 활성화 및 고갈을 위해 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 각각 25 마이크로리터로 분할합니다. 활성화 및 고갈 항체 염색 칵테일로 세포를 염색하고, 이들을 암실에서 실온에서 10분 동안 배양한다. 분리 완충액 1ml을 넣고 부드럽게 섞은 다음 원심분리하여 과도한 항체를 씻어냅니다.

상청액을 완전히 흡인하십시오. 세포 펠릿을 1밀리리터의 분리 완충액에 재현탁시키고 유세포분석 분석을 위해 적절한 용기로 옮깁니다. 생존 가능한 T 세포 수 및 전이유전자 양성 T 세포의 증가가 대조군 샘플과 마이크로버블 공동 자극을 받은 세포 사이에서 관찰되었습니다.

증가된 이펙터 세포 집단이 또한 마이크로버블 샘플에서 관찰되었다. 생존가능한 활성화된 T 세포는 증가된 초기 활성화 마커 CD69, 및 중간에서 후기 활성화 마커 CD25를 발현한다. 고갈 마커 PD1 양성 세포의 총 수 및 백분율은 또한 마이크로버블 공동-자극을 받은 세포 샘플에서 유의하게 더 높았다.

마이크로버블의 적절한 혼합 및 분배는 마이크로버블이 교반 없이 표면으로 빠르게 부유하기 때문에 정확한 투여를 보장하는 데 필수적입니다. 우리는 다른 방법에서 자주 볼 수있는 더 고갈 된 T 세포보다 더 높은 활성을 가진 많은 T 세포 집단의 빠른 성장을 가능하게함으로써 그렇게 할 것으로 기대합니다.