Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

윤리 문 : 모든 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행하고, 튀빙겐 대학의 임상 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (38 / 2009B02 470 / 2013B02 프로젝트). 말초 혈액 단핵 세포의 1. 분리 (PBMC를) <ol><li> 1,000 IU의 헤파린 황산을 포함하는 50 ML의 주사기를 사용하여 정맥 천자를 통해 건강한 지원자에서 50 ~ 100 mL를 취하여 혈액 1 희석 : PBS (PH = 7.2)과 (2). </li><li> 15 ml의 혈액 분리 솔루션에 PBS 용액 등 Biocoll로 (D = 1.077 ㎍ / ㎖) 50 ㎖에 원뿔 튜브 : 조심스럽게 혈액 35 ml의 레이어. 실온에서 800 XG에 15 분 동안 원심 분리기. 참고 : 브레이크는 사용할 수 없습니다. </li><li> 피펫 림프 층의 세포를 수집하고, 적어도 50 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻어 (400 XG에서 12 분간 원심 분리). 피펫과 원심 분리 한 후 상층 액을 제거합니다. </li><li> 를 Lyse는 일시 중지 및 incub에 의해 적혈구 남아2-4 분간 저장성 완충액 1-5 mL를 림프 분획 ating. 주 : 노광, 용균 완충액의 양 기간이 사용될 용균 버퍼와 림프구 분획에 남아 적혈구의 양에 의존한다. </li><li> 12 분 동안 250 XG에서 PBS (1시 10분)와 세포와 원심 분리기를 희석하고, 이후에 재현 탁하고 12 분 동안 300 XG에 10 ml의 PBS에 한 번 세포 펠렛을 씻는다. </li><li> PBS에서 림프구를 재현 탁하고 트리 판 블루에게 솔루션을 사용 노이 바 우어 계산 실에서 세포를 계산합니다. 참고 : 일반적으로,&gt; 1 × 8 림프구가 100 ㎖에서받은 갓 말초 혈액을 그려. </li></ol> Vδ1 T 세포의 격리 2. <ol><li> Vδ1 CD4 T 세포의 빈도를 결정하는 초기 FACS를위한 &lt;1 × 106 림프구 절연 걸릴. 참고 :이 T 세포 개체의 인구 크기는 개인과 자신의 면역 상태에 따라 따라 크게 다를 수 있습니다. Typic아군, T 세포의 약 1 % 및 Vδ1 Vδ1 + + 세포의 1~5 %의 시간 CD4 +이다. <ol><li> PBS가 2 % FCS, 5 mM의 EDTA를 함유하는 1 ml의 이루어져의 FACS 완충액으로 세포를 희석. 2 분 동안 660 XG에 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다. 약 100 ㎕의 FACS 완충액 환류 량은 후속 염색 충분하다. 간단히 소용돌이 5 μL는 FACS 염색의 증가 특이성을 실온에서 5 분 동안 시약 된 Fc-차단과 세포를 품어. </li><li> 은 FC-차단 시약을 제거하지 않고 세포에 직접 인간 단일 클론 항체를 추가합니다. , CD8 (1 : 200)와 TCRαβ (1시 25분) : Vδ1 (1시 50분), CD3 (1시 50분), CD4 (200 1)에 대한 항체와 세포를 염색해야합니다. 해당 면역 글로불린 아이소 타입과 이소 제어를 준비합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 항체와 세포를 품어. </li><li> (2 분 동안 원심 분리, 660 XG에) 1 ML의 외과 버퍼에 세포를 씻으, supern을 가만히 따르다atant 나머지 버퍼 볼륨 외과 인수를 진행합니다. </li></ol></li><li> 12 분 동안 원심 분리하여 (FACS 분석에 사용되지 않는다) 세포를 펠릿 화; 300g에; 8 ° C. 상층 액을 제거하고 1 × 10 7 세포 당 60 μL의 맥 버퍼 pelletin 셀을 재현 탁. 1 × 10 7 세포 당 20 μL 된 Fc-차단 시약을 추가하고 4 ℃에서 5 분 동안 품어. </li><li> 직접 세포에 1 × 10 7 세포 당 10 μL FITC - 복합 항 - 인간 Vδ1 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 12 분 동안 품어. </li><li> 14 ml의 맥 버퍼를 사용하여 세포를 세척 (12 분 동안 원심 분리기를 300 g에서 8 ° C)를. 완전히 뜨는을 취소하고 1 × 7 세포 당 80 μL의 맥 버퍼에있는 세포를 재현 탁. </li><li> 1-2 × 10 5 세포를 가지고 FACS 분석하여 라벨의 확인을 위해 100 μL FACS 버퍼를 희석. 더 이상의 첨가제는이 단계에서 필요하지 않습니다. suffi이 있는지 확인Vδ1의 밝기 효율적인 차이 - 그리고 Vδ1 + 세포. 그렇지 않은 경우, 반복) 2.3) 2.4 단계. </li><li> 나머지 셀에 1 × 10 7 세포 당 20 μl를 방지 FITC 마이크로 비드를 추가, 잘 ​​섞는다 4 ° C에서 어둠 속에서 15 분 동안 품어. 그 후, (300 XG에서 12 분 동안 원심 분리기 8 ° C)를 최소 10 ml의 맥 버퍼를 사용하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 원심 분리 동안, 500 μL의 맥 버퍼와 자석에 배치 미리 냉각 자기 열 평형. </li><li> (세포 수보다 높은 1 × 8이 볼륨 따라 규모를 확대) 500 μL의 MACS-버퍼에 세포를 재현 탁하고 컬럼에 조심스럽게 세포를 적용합니다. Vδ1 함유 관류 수집 - 셀. </li><li> 500 μL의 맥 버퍼로 열 세 번 세척하고 같은 튜브에 다시 흐름을 통해 수집합니다. 저수지 컬럼에 버퍼를 적용하기 전에 비어 있어야합니다. </li><li> 자기 장치에서 열을 제거하고 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. 빨리 단단히 열에 플런저를 밀어 1 ml의 맥 버퍼와 컬럼을 세척하십시오. 튜브에 용출액을 수집합니다. 주 :&gt; 98 %의 순도를 얻기 위해, 그것은 일반적으로 반복 할 필요가 초 컬럼) 2.7부터 2.9까지 단계. </li><li> (2.1.2 참조) 이전과 같은 항체 패널 FACS 분석 (18)에 의해 세포의 순도를 확인하고 세포를 카운트. </li></ol> Vδ1CD4 + T 세포의 3. 분리 <ol><li> &gt; 30 초 동안 소용돌이와 CD4 비즈의 25 μl를 재현 탁. 1 분 동안 자석에 튜브를 배치하여 1.5 ml의 반응 튜브에 1 ㎖의 MACS 완충액 비드 (제조자에 의해 도시 된 바와 같이 최소한의 양)을 세척한다. 작은 규모의 피펫 (200 μL) 조심스럽게 뜨는을 취소하고 맥 버퍼의 원래 볼륨에서 구슬을 재현 탁. </li><li> 1 Vδ1 + 세포 (원심 분리기를 펠릿2 분; 등) 300 XG에서하면 뜨는을 대기음 500 μL의 맥 버퍼의 모든 Vδ1 + 세포를 재현 탁하고 구슬이 들어있는 튜브에 추가합니다. 적극적으로 믹스 (회 전자에서, 예를 들어) 일정한 경사와 4 ° C에서 20 분 동안 품어. </li><li> 2 분 동안 자석에 세포를 포함하는 튜브를 놓는다. 뚜껑에는 잔해가 없는지 확인합니다. 주 : CD4 + 세포는 자성 비드를 결합하고 자석에 대향 관의 측면에 부착 한 것이다. </li><li> 소규모 피펫을 사용하여 Vδ1가 + 세포를 - 조심스럽게 자기 장치 내부에 튜브를 유지하면서 뚜껑을 열고 CD4이 포함 된 상층 액을 수집합니다. 별도의 튜브에 Vδ1가 + 세포 인구에서 CD4 세포 또는 구슬 남아 가능성 피하기 위해 다시 자석으로이 관을 배치 - CD4를 놓습니다. <ol><li> CD4 워시 - 세포를 5 ml의 맥 - 버퍼 (원심 분리기 12 분 동안 300 XG에)ND 100 μL 용지 당 1 × 105 세포의 농도로 재현 탁 그들을. CD4 - 세포 용이 (4.2) 아래에 주어진 조건에서 재배 할 수있다. </li></ol></li><li> , 외부 자계의 CD4 + 세포 표적과 관을 배치 500 μL의 MACS 완충액에 세포를 재현 탁하고, 자기 장치에 다시 넣어. 반복은 더 높은 순도를 얻기 위해 두 번 3.3-3.5 단계를 반복합니다. 피펫으로 상층 액을 제거 </li><li> 100 μL 문화 미디어에서 CD4 + 세포 (RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % L 글루타민, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신)를 재현 탁하고 비드 분리 용액 10 μl를 추가합니다. 일정한 경사 (예를 들면, 회전)에 45 분 동안 RT에서 배양한다. </li><li> 1 분 동안 자석에서 세포를 놓습니다. 신중 소규모 피펫을 사용하여 비드없는 Vδ1 + CD4 + 세포를 포함하는 상층 액을 모은다. </li><li> 자석의 외부, 100 μL 문화 미디어와 반복과 구슬을 재현 탁CD4 + 세포의 높은 세포 수를 얻기 위해 두 번 3.6 및 3.7 단계를 반복합니다. </li><li> 세포를 펠릿 화 (12 분, 300 XG에 원심 분리기)와 피펫 팅에 의해 완전히 상층 액을 버린다. 신선한, 미리 예열 미디어 세포를 재현 탁하고이를 계산합니다. 2.1.1-2.1.3 단계에 묘사 된 FACS 분석에 의해 Vδ1 + CD4 + 세포의 순도를 검사합니다. </li></ol> 제한 희석 4. 단일 세포 복제 <ol><li> 1.1-1.6에 도시 된 바와 같이, 동종 기증자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리. </li><li> γ 방사선을 사용하여 25 ml의 배양 배지에서 80 Gy를 2.5 × 10 7 동종 PBMC를 조사. </li><li> 96- 웰 U 형 플레이트에 5 × 104 공급기들을 조사 피더 세포에 IL-2 (200 U / ㎖), IL-7 (20 NG / ㎖) 및 PHA (2 μg의 / ㎖)를 첨가하고, 분산 물론 당 50 μL 세포. </li><li> 50 μL 당 0.3 세포의 농도로 Vδ1 + CD4 + 세포를 희석. 피펫TE 각 웰 조사 세포 및 사이토 카인에 형질 세포 용액 50 μL. 주 : 따라서, 사이토 카인을 100 U / ㎖의 IL-2, 10 NG / ml의 IL-7 및 1 μg의 / ㎖의 PHA의 최종 농도로 희석된다. 37 ° C, 5 % CO 2 분위기에서 가습 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 배양한다. <ol><li> 선택적으로, 클론과 동일한 배양 조건에서 대량으로 배양 Vδ1 + CD4 + 세포를 정제하고 남은 배양. </li></ol></li><li> 사이토 카인과 신선한 미디어 3-4 일마다 세포를 제공합니다. 이를 위해, 50 μL 피펫 신선한 배지로 웰에 배지 교환 절반. 모든 보충에 사이토 카인의 2 배 농도를 추가합니다. 수유 아니라 다른 모든 라운드 당 5 × 4 조사 피더 세포를 추가합니다. </li><li> 배지 및 콜로니 형태의 색상을 변경할 따라서 그들은 대사로서, 제 클론 3-4 주 후 가시가 관찰하고, 현미경 사용. 참고 : 모피를 들어THER 재배, 잘 클론을 재현 탁하고 96 웰 플레이트를 분리 전송합니다. 2.1.1-2.1.3에서 나타낸 바와 같이 FACS를 통해 세포를 분석한다. 이러한 조건에서 유지 클론은 결국 αβTCR에 Vδ1에서 자신의 TCR을 변경할 수 있습니다. 이 분화에 대한 시점은 복제하는 복제에 따라 다릅니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

긍정적 자기 세포 분리를 위해 Vδ1 및 CD4 : 부족한 (T-) 세포의 표현형 엔티티, 생물학 및 기능을 연구하기 위해, 즉 Vδ1 + CD4 + T 세포, 우리는 두 개의 마커를 사용 하였다. CD4가 단핵 세포 및 수상 세포에 낮은 레벨, T 헬퍼 세포에 발현 한 조혈 전구 세포에 매우 낮은 레벨에있는 반면 Vδ1는 고아 수용체이다. 고순도 세포 농축하고 선택하기위한 기술은 형광 세?...

척추 동물에서 세포 및 면역의 체액 부분으로 구성되어 적응 면역은 병원체에 대한 방어에 중요한 역할을한다. 항원의 광범위한 인식은 T 세포와 관련하여 흉선 1에서 주로 생성되는 것으로 가정 hyperpolymorphic B 및 T- 세포 수용체 (TCR / BCR)에 의해 매개된다. 이에는 골수로부터 유도 된 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는, 흉선 시드 최종적 모든 T 세포 계통을 발생주고 잘 정의 된 스테이지를 따라 차별화. 및 CD8 - - 흉선 시드 조상은 CD4이며, 따라서 미성숙, 더블 네거티브 (DN) 흉선 세포의 일부를 구성한다. 흉선에서 유래 신호는 자신의 계보 헌신과 αβ 또는 γδ T 세포 중 하나에 분화를 유도. DN2 / 3 흉선 세포에 기능적으로 재 배열 된 TCR-γ 및 TCR-δ 사슬 유전자의 발현은 세포 증식의 드라이브 δTCR 단지를, γ에 이르게γ의 ΔT 세포 2,3로 분화를 촉진 거라고. 대조적으로, preTCR하여, Pt를 구축 preTα 페어링 수 기능적 TCR-β 사슬의 재 배열은, 전사 DN3의 흉선 세포의 TCR-γ 사슬의 사일런 및 CD4 + CD8 + 이중 양성 흉선 세포 (4)에 그들의 전이를 유도 . 이 단계에서, TCR-α 사슬의 재조합은 따라서 이들 세포 돌이킬 5-9 생산 γδTCR를 폐지, TCR-α 궤적 내에 멈춰서 TCR-δ 궤적 삭제를 발생한다. 재 배열 αβTCRs 이후자가 면역 (부정적인 선택)를 방지하기 위해 특정 임계 값을 초과 할 수 없습니다 약하게 (긍정적 인 선택을) 자기 MHC를 결합 할 수있는 능력, 선택됩니다. MHC 클래스 I 또는 II를 결합 그들의 능력에 따라, 선택된 셀 αβT은 단일 양성 CD4 + 또는 CD8 + T 세포, 흉선 출구로서 나이브 T 세포로 발달. 그러나, 흉선의 퇴화 일찍 거의 소멸 후 사춘기 10 나이브 T 세포의 기하 급수적으로 감소 출력에 최고의 인생에서 시작됩니다. 그럼에도 불구하고, T 세포 풀의 크기는 포스트 흉선 항상성 T 세포의 증식 및 수명이 긴 면역 메모리 (11)의 확산에 의해 부분적으로 만 설명 될 수 수명 내내 일정하게 유지된다. 따라서 extrathymic T 세포 발달이 발생한다. 최근의 연구-에서 extrathymic 기능 αβ T 세포 12-17을 초래 사이트 - 준 αβT 세포 전구 세포를 특징으로 상당한 매력을 얻고있다. 그러나, 흉선 독립적가 αβT 세포로 분화 extrathymic αβT 세포 전구체에 대한 자세한 지식은 우리가 그들이하여 수행 경로에있는 배경으로 단편이다. 우리는 최근 Vδ1 +의 작은 T 세포 개체를 식별 </suP&gt; 가벼운 염증 환경에서 αβT 세포에 transdifferentiate 수있는 건강한 인간 기증자의 말초 혈액에서 분리 extrathymic αβT 세포 prognitor (18), 같은 CD4 + γδT 세포. 흥미롭게 잠재적 새로운 항원을 인식 할 수 있도록, 따라서 레퍼토리의 다양성을 확대 후 흉선 T 세포의 항상성 증식 Vδ1 CD4 + 세포의 분화 새로운 T 세포 수용체를 생성하고, 반대로 보호 수도 새롭게 취득한 병원체에 대해 숙주. 이는 T 세포의 가소성에 가산 extrathymic T 세포 개발 원경 인정받지 새로운 경로를 추가한다. 대물이 αβT 셀 extrathymic 개발 precursor`s ​​트리거 이들 마커 분자를 식별하기위한 소스로부터 림프 정량적 격리는 단일 세포 클론의 발생 및 그 효율적인 확장이 필수적이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biocoll Solution</td>
			<td style="width:93px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L 6113</td>
			<td style="width:361px;">lymphocyte separating solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysing Buffer</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>lysis of erythrocytes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MACS buffer</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>supplement with BSA and pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human Vd1 FITC (clone:&#160; TS8.2)</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td>TCR2730</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>345766</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555548</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-333</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>641400</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Anti-FITC MultiSort Kit</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-058-701</td>
			<td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS columns</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td>pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CD4 Positive Isolation Kit</td>
			<td style="width:93px;">life technologies</td>
			<td>11331D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

흉선, αβ T 세포와 척추 동물에서 적응 면역계의 주쇄의 생성을위한 주요 기관은, 긴 αβT 세포의 공급원으로서 만 고려되고있다. 그러나, 흉선 퇴화는 주변에 순진 αβT 세포의 대폭 감소 출력에 이르는 인생의 초기에 시작됩니다. 그럼에도 불구하고, 심지어 백세인은 새로 인수 한 병원균에 대한 면역을 구축 할 수 있습니다. 최근의 연구 기능의 흉선 손실을 보상 할 수있다 경로의 그러나 우리의 이해는 여전히 rudimental 있으며, extrathymic αβT 전지 개발을 제안합니다. γδ ​​T 세포는 주 조직에서 T 세포 서브 세트를 구성 타고난 림프구이다. 우리는 최근 보여 γδ T 세포의 서브 세트에 지금까지 뛰어난 기능을 인정받지 기인하는 CD4의 부족한 엔티티 Vδ1 + + γδ T 세포가 염증 상태의 세포 내로 αβT transdifferentiate있다. 여기, 우리 쪽말초 혈로부터이 선조의 분리 및 그 후속 재배 프로토콜 rovide. Vδ1 세포 양 우리가 상기 자성 라벨링 기술에 CD4 + 세포의 부족 부분을 대상으로 상기 제 2 단계이어서, 자성 비드를 이용하여 건강한 인간 공여자로부터의 PBMCs를 충실. 제 라벨링의 자력은 제 1 자기 라벨의 하나 초과하고, 따라서 관심 인구의 효율적인 양적 및 특정 양의 절연을 허용한다. 우리는 그 다음 세포를 복제하고 효율적으로 확장과 FACS 분석에 의해 생성 된 클론의 식별을 위해 필요한 기술과 문화 조건을 소개합니다. 따라서, 우리는 정제, 문화와 CD4 + Vδ1 + γδ T 세포의 생체 확장에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 지식이 αβT 세포 progenitor`s ​​생물학 관련 연구 및 IDE하는 것을 목표로 사람들을위한 전제 조건입니다그 분화에 관여하는 분자 트리거를 ntify.

도 1은 다른 단계 및 말초 혈액으로부터 Vδ1 T 세포의 분리의 결과를 도시한다.도 1a는 CD3 + 림프구 Vδ1 + 세포의 전형적인 분포뿐만 아니라 Vδ1 + 인구의 공 수용체의 발현을 나타낸다. 이 도너에서 Vδ1 + 세포 (적색)의 주파수는 총 림프구 수가 2.3 %이고 Vδ1 + 림프구의 CD4 발현 (녹색) 2.6 %이다. 요컨대, 분리를위한 표적 집단이 도너의 ...

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

분리 및<em&gt; 전의 VIVO</emVδ1의&gt; 문화<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K 조회수.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

비디오: Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide complete protection against the development or recurrence of breast cancer. To overcome this problem by increasing the frequency of tumor-reactive T cells, adoptive immunotherapy has been employed. A variety of protocols have been used for the expansion of tumor-specific T cells. These protocols, however, are restricted to the use of tumor antigens ex vivo for the activation of antigen-specific T cells. Very recently, common gamma chain cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 have been used alone or in combination for the enhancement of anti-tumor immune responses3. However, it is not clear what formulation would work best for the expansion of tumor-reactive T cells. Here we present a protocol for the selective activation and expansion of tumor-reactive T cells from the FVBN202 transgenic mouse model of HER-2/neu positive breast carcinoma for use in adoptive T cell therapy of breast cancer. The protocol includes activation of T cells with bryostatin-1/ionomycin (B/I) and IL-2 in the absence of tumor antigens for 16 hours. B/I activation mimics intracellular signals that result in T cell activation by increasing protein kinase C activity and intracellular calcium, respectively4. This protocol specifically activates tumor-specific T cells while killing irrelevant T cells. The B/I-activated T cells are cultured with IL-7 and IL-15 for 24 hours and then pulsed with IL-2. After 24 hours, T cells are washed, split, and cultured with IL-7 + IL-15 for additional 4 days. Tumor-specificity and anti-tumor efficacy of the ex vivo expanded T cells is determined.

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

An efficient protocol for the ex vivo expansion of tumor-reactive T cells from tumor-draining lymph nodes or other secondary lymphoid tissues of tumor-bearing hosts is described. This protocol selectively expands tumor-specific T cells for use in adoptive immunotherapy of breast cancer.

Bryostatin의 1/Ionomycin에 의해 종양 반응 T 세포의 생체내 전 확장 및 일반 감마 체인 크린 시토킨 제제

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

위드 필드와 공촛점 현미경과 Murine 림프절의 조각에서 T 세포의 생체내 이미징 전

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

Isolation of Double Negative &amp;#945;&amp;#946; T Cells from the Kidney

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...