세포외 기질 또는 ECM 수치 하이드로겔 미세입자는 스캐폴드 제조를 위한 빌딩 블록으로 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 젤라틴 메타크릴로일 또는 GelMA 하이드로겔 미세입자의 제조, 정제, 동결건조, 사진 조립 및 3D 바이오프린팅을 보여줍니다. GelMA는 세포 반응성 및 유익한 생체 재료로 널리 사용되어 온 세포 접착제 및 생분해성 부분을 포함하는 광화학적으로 가교 가능한 단백질 기반 생체 고분자입니다.
기존의 벌크 하이드로겔과 비교하여 GelMA 과립형 하이드로겔 스캐폴드는 미세 다공성이므로 빌딩 블록 크기에 따라 맞춤화할 수 있는 빠른 세포 침투가 가능합니다. GelMA 과립형 하이드로겔 스캐폴드는 저렴한 플랫폼과 재생 엔지니어링에서 두꺼운 조직, 장기 및 질병의 3D 바이오프린팅을 위한 새로운 기회를 열 수 있습니다. 시작하려면 10밀리그램의 LAP를 10밀리리터의 DPBS에 첨가하여 0.1% 광개시제 용액을 준비합니다.
알루미늄 호일로 싸서 용액을 빛으로부터 보호하고 라벨을 붙입니다. 다음으로, 원하는 양의 GelMA를 광개시제 용액에 용해시킨다. 알루미늄 호일로 감싼 용액을 섭씨 37도 오븐에 1시간 동안 넣어 투명한 용액을 얻습니다.
유상을 준비하려면 엔지니어링 유체에 2% 생체 적합성 계면활성제 용액을 만드십시오. Tygon 튜브를 PDMS 장치의 입구와 출구에 삽입한 다음 Tygon 튜브의 다른 쪽 끝에 25게이지 무딘 바늘을 삽입하여 입구를 만듭니다. 장치를 현미경 아래에 놓고 헤어드라이어나 스페이스 히터를 사용하여 섭씨 약 40도에서 환경을 따뜻하게 유지합니다.
장치에 연결된 별도의 주사기에 수용액과 오일 용액을 넣습니다. 분당 160 마이크로 리터의 유속으로 오일 상 용 주사기 펌프를 시작하십시오. 오일이 채널을 채운 후 분당 80 마이크로 리터에서 수성상을 시작하십시오.
현미경으로 물방울 형성을 확인하십시오. 용기에 물방울을 모으고 광학 현미경 이미징으로 이미징 챔버에서 평가합니다. 물방울을 밤새 섭씨 4도에서 유지하면서 빛으로부터 보호하여 GelMA 마이크로젤의 물리적 가교를 시작하고 물방울을 안정적인 마이크로젤로 전환합니다.
미세 공학 에멀젼-분말(MEtoP) 방법을 구현하려면 내열성 미세 원심분리기 튜브 또는 극저온 유체를 사용하여 엔지니어링 유체에서 물리적으로 가교된 마이크로젤을 수집합니다. 열린 튜브를 실험실 물티슈와 테이프로 밀봉합니다. 물리적으로 가교된 마이크로젤을 액체 질소에서 10분 동안 급속 동결하여 동결건조를 진행한다.
동결건조 후, 고체 분말이 얻어질 것이다. 섭씨 4도에서 냉각된 0.1% 광개시제 용액 1밀리리터를 동결건조된 분말에 첨가하여 마이크로겔 현탁액을 만듭니다. 와동된 혼합물을 3, 000g에서 15초 동안 원심분리한다.
상층액을 버린 후, 포지티브 치환식 피펫을 이용하여 충진된 마이크로겔 현탁액을 몰드에 옮기고, 400나노미터 파장에서 제곱센티미터당 15밀리와트의 강도로 60초 동안 노출시켜 과립형 하이드로겔 스캐폴드 또는 GHS를 형성한다. 400 마이크로 리터의 마이크로 겔 현탁액의 경우, 물리적으로 가교 된 GelMA 마이크로 젤에 동일한 양의 얼음처럼 차가운 PFO 용액, 20 %의 엔지니어링 유체를 첨가하십시오. 이어서, 와동된 혼합물을 300g에서 15초 동안 원심분리하고, 피펫팅에 의해 GelMA 마이크로겔로부터 오일상을 제거하였다.
그런 다음 400 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 0.1 % 광 개시제 용액을 마이크로 겔 현탁액에 첨가하십시오. 볼텍싱된 용액을 300g에서 15초 동안 원심분리한 후, 오일을 버린다. 광개시제 용액 첨가 및 원심분리의 단계를 반복하되 이번에는 3, 000g에서 원심분리하고 충진된 GelMA 마이크로겔의 상층액을 버린다.
포장된 GelMA 마이크로젤을 몰드에 옮긴 다음 빛에 노출시켜 GHS를 형성합니다. 3 밀리리터의 얼음처럼 차가운 초순수에 100 밀리그램의 나노 혈소판 분말을 첨가하여 3.33 % 나노 입자 분산액을 형성한다. 분산액을 섭씨 4도의 냉장고 내부에서 15분 동안 격렬하게 소용돌이치게 하여 응집된 나노입자를 각질 제거합니다.
적절하게 각질 제거 된 나노 입자는 명확한 분산을 생성합니다. 50 밀리그램의 LAP를 5 밀리리터의 얼음처럼 차가운 초순수에 녹여 1 % 광 개시제 원액을 준비합니다. 그런 다음 박리된 나노입자 분산액에 333마이크로리터의 1% 광개시제 용액을 추가하고 주변광으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감쌉니다.
상기 혼합물을 1분 동안 와동시켜 나노입자 분산액과 광개시제를 혼합하였다. 얼음처럼 차가운 PFO, 20%in 엔지니어링 유체를 물리적으로 가교된 GelMA 마이크로젤에 1:1 부피비로 첨가합니다. 와동된 혼합물을 300g에서 15초 동안 원심분리한 후, 계면활성제가 포함된 유상을 버린다.
얼음처럼 차가운 LAP 보충 나노 입자 분산액을 세척 된 GelMA 마이크로 겔에 첨가하십시오. 3, 000g에서 15초 동안 원심분리한 후, 바닥에 남아 있는 오일을 버리고 상등액을 분산시켰다. 현탁액을 섭씨 4도에서 보관하고 하루 동안 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하면 GelMA 나노 공학 과립 바이오 잉크 또는 NGB 제품을 얻을 수 있습니다.
다음날 NGB를 3 밀리리터 주사기에 넣습니다. 적재된 주사기를 캡과 파라필름으로 밀봉하고 200g에서 펄스 원심분리를 수행하여 갇힌 공기를 제거합니다. 암-암 루어 잠금 커넥터를 사용하여 바이오잉크를 3밀리리터 카트리지로 옮깁니다.
카트리지를 다시 200g에서 잠시 원심분리하여 갇힌 공기를 제거하고 NGB를 섭씨 4도로 유지한 후 사용합니다. 다음으로, 제조된 쥐 섬유아세포 현탁액을 3-밀리리터 주사기에 로딩한다. 암-암 루어 잠금 커넥터를 사용하여 NGB와 셀 로드 주사기를 결합하고 앞뒤로 40회 밀어 내용물을 부드럽게 혼합합니다.
노즐을 3 밀리리터 프린트 헤드에로드하여 표준 원추형 노즐이있는 적절한 바이오 프린터를 사용하여 NGB 또는 셀 함유 NGB를 인쇄하십시오. 인쇄 베드 온도를 섭씨 10도 미만으로 유지하고 속도 및 배압과 같은 매개변수를 최적화합니다. 원하는 gcode 또는 STL 파일을 선택합니다.
그런 다음 표준 원추형 노즐이 장착 된 공압 3 밀리리터 주사기의 기판과 노즐 유형을 선택하십시오. 장치 지침을 사용하여 바이오 프린터를 보정하고 인쇄를 시작하여 3D 구조를 얻습니다. MEtoP 기술은 저압 동결 건조를 통해 재현 가능한 건조 마이크로 겔 분말을 생성하면서 마이크로 겔을 응집 및 심한 변형으로부터 보호했습니다.
SEM 이미지는 이 기술을 사용하여 건조된 GelMA 미세입자가 기존의 동결건조에서 관찰된 응집과 비교하여 동결건조 후에도 구형 모양을 유지한다는 것을 보여주었습니다. 고분자량 형광 염료를 사용한 GelMA, GHS 및 NGB의 미세 기공 특성 분석은 상호 연결된 마이크로 스케일 빈 공간을 보여주었습니다. 또한 사용자 지정 작성 MATLAB 스크립트를 사용하여 평가한 형광 이미지는 기공을 감지했습니다.
공극 분율 및 중앙 기공 등가 직경 측정은 NGB를 사용하여 3D 프린팅된 스캐폴드에서 마이크로 스케일 기공의 가용성과 상호 연결성을 증명하는 유의미한 차이를 나타내지 않았습니다. 매달린 필라멘트 길이 측정에 의해 단단하고 느슨하게 포장된 GelMA 마이크로겔에 대한 NGB 스캐폴드의 우월성은 NGB가 패킹된 마이크로겔보다 더 긴 길이를 갖는 것으로 나타났습니다. 느슨하게 포장된 마이크로젤은 필라멘트를 생성하지 못했습니다.
속이 빈 실린더를 3D 프린팅하고 전체 구조물을 광가교를 위해 빛에 노출시켰습니다. 인쇄된 구조는 모양, 충실도 및 구조적 무결성을 보여주기 위해 물리적으로 유지되었습니다. 예를 들어 스캐폴드가 생물학적 평가에 사용되는 경우(예: 세포 함유 바이오프린팅) 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 특정 조건에서 모든 단계를 수행해야 합니다.
우리는 세분화 된 하이드로 겔 스캐 폴드의 사용을 생물 의학에서 새롭게 등장한 생체 재료 플랫폼으로 탈시장화하기를 희망합니다.
