이러한 광-유도 이전기영동 프로토콜 또는 LiDEP는 인간 중간엽 줄기 세포의 특성화를 위한 단계별 방법을 제공한다. 이 방법은 줄기 세포 샘플의 이질성에 대한 답변을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. LiDEP의 장점은 기존 DEP 방법으로는 불가능했던 줄기 세포 이질성에 대응하여 가상 전극 구성을 실시간으로 변경할 수 있다는 것입니다.
이 기술의 새로운 사용자는 가상 전극을 만들기 위해 프로젝터 빛을 미세 유체 장치에 충분히 응축하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 작동할 때까지 설정을 재구성하는 것이 좋습니다. 절차를 시연하는 데 도움을 주는 것은 내 연구실의 대학원생인 Zuri Rashad가 될 것입니다.
시작하려면 짧은 치수의 가장자리에서 약 5-6mm 떨어진 양면 테이프에 테이프의 긴 면 사이를 중앙에 펀칭하여 직경 4mm의 구멍을 뚫어 마이크로채널을 준비합니다. 메스를 사용하여 구멍을 가로질러 3mm 간격으로 두 개의 직선을 절단하여 전체 마이크로채널 절단 중에 테이프 양쪽 면의 보호 시트가 부착되도록 합니다. 뚫린 구멍이 양면 테이프에 뚫린 구멍과 정렬되도록 빨 수 있는 마커로 전체 위치를 표시하십시오.
이 두 구멍은 미세유체 장치의 입구 및 출구 구멍으로 사용됩니다. 상단 ITO 유리 슬라이드에 직경 3mm 구멍 2개를 뚫습니다. 그런 다음 천공된 ITO 코팅 유리 상단에 테이프의 긴 가장자리를 유리의 긴 가장자리에 맞춰 놓습니다.
양면 테이프의 보호 필름 한쪽을 제거합니다. 상단 ITO 유리 슬라이드에 테이프 구멍을 맞추고 부드럽게 눌러 특히 마이크로 채널 근처의 공기 주머니를 제거합니다. 양면 테이프에서 다른 보호 필름을 제거합니다.
몰리브덴 및 비정질 실리콘 코팅 ITO 유리 슬라이드를 2mm 간격 면과 반대쪽에 있는 광 전도성 슬라이드의 가장자리와 일치시키고 양면 테이프의 가장자리가 상단 ITO 유리 슬라이드의 중앙을 향하도록 누릅니다. 이러한 방식으로 ITO와 광전도성 ITO 슬라이드 사이에 숙취가 존재합니다. 평평한 표면을 눌러 접착력을 높이고 측면의 여분의 테이프를 잘라냅니다.
함수 발생기를 연결하려면 ITO 유리층과 광전도성 코팅된 ITO 유리층의 가장자리에 구리 테이프를 붙입니다. 양면 테이프의 가장자리에서 유리 기판의 코팅되지 않은 면에 약 3cm까지 ITO 또는 광전도성 물질의 측면에 테이프를 감쌉니다. 성공적인 장치 제작을 위해 고도계를 사용하여 두 유리 기판의 코팅된 슬라이드와 유리에 부착된 구리 테이프 사이의 저항 판독값을 테스트합니다.
자당 25g과 포도당이 들어 있는 50밀리리터 원추형 튜브에 4.25밀리리터의 초순수를 추가합니다. 자당과 포도당의 절반이 녹을 때까지 잘 섞고 최대 50 밀리리터 표시까지 초순수로 보충하십시오. 그런 다음 완전히 용해될 때까지 이 DEP 버퍼를 세게 혼합합니다.
준비된 자당 및 포도당 용액 20 밀리리터를 50 밀리리터 원추형 튜브에 넣는다. 0.1g의 소 혈청 알부민(BSA)을 튜브에 추가합니다. 모든 BSA가 용해될 때까지 잘 소용돌이치면 DEP 완충액에서 0.5% BSA의 최종 농도를 얻을 수 있습니다.
10 밀리리터 원심분리 튜브에 1 밀리리터의 성장 배지에 현탁된 6개의 인간 중간엽 줄기세포 또는 HMSCS 또는 인간 배아 신장 HEK293을 1회 10회 놓습니다. 원심분리기, HEK293 세포를 201G에서 5분 동안, HMSC를 290G에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡인합니다.
01 그리고 0.5% BSA가 함유된 1밀리리터 DEP 완충액에 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 원심분리를 두 번 더 반복하고 0.5% BSA로 DEP 버퍼에 세포를 다시 현탁합니다. 노트북, 프로젝터, 대물 렌즈, 디지털 현미경 및 LiDEP에 대한 세포 반응을 정량화하기 위한 함수 발생기와 같은 실험 설정 항목을 준비합니다.
프로젝터 렌즈 위에 10x 대물 렌즈, LiDEP 칩 및 홀더를 놓습니다. 노트북을 사용하여 별, 다이아몬드, 세 줄 및 타원형과 같은 조명 프로젝션을 디자인하고 노트북을 프로젝터에 연결합니다. LiDEP 칩을 함수 발생기에 연결하여 AC 전기장을 적용합니다.
LiDEP 힘을 경험하는 세포를 관찰하려면 디지털 현미경을 사용하여 NVIDIA 기록을 이미징하십시오. 셋업을 완료한 후, 마이크로채널을 70% 에탄올로 플러시한 다음, 0.5% BSA 용액을 플러시하여 이전 세포에서 에탄올을 제거하였다. 이전에 DEP 필드에 노출된 세포가 신선한 세포와 다르게 반응하여 데이터 수집을 방해할 수 있으므로 플러시를 세 번 반복하여 완전히 씻겨 나가도록 합니다.
피펫으로 0.5% BSA 용액을 제거합니다. 그런 다음 함수 발생기를 원하는 전압과 주파수로 설정합니다. 더 작은 피펫 팁을 사용하여 준비된 세포 현탁액 70마이크로리터를 장치 마이크로채널에 조심스럽게 추가하고, 마이크로채널의 얇음으로 인해 유출을 방지하기 위해 구멍에서 마이크로채널 쪽으로 약간 기울입니다.
일회용 종이 물티슈로 접근 용액을 닦아내고 생물학적 위험 폐기물에 버리십시오. 그런 다음 원하는 가상 전기 기하학 원, 다이아몬드, 별 또는 평행선을 LiDEP 칩에 투영합니다. 디지털 현미경 소프트웨어에서 비디오 길이를 3분으로 설정합니다.
랩 타이머를 2분 30초로 설정합니다. 세포가 LiDEP 칩의 마이크로채널에 고정되면 디지털 현미경 소프트웨어에서 시작을 눌러 비디오 녹화 프로세스를 시작합니다. 10초 후 함수 발생기 채널 출력의 On 버튼을 눌러 AC 전기장을 인가하고 타이머의 시작을 누릅니다.
디지털 현미경을 통해 세포 DEP 동작을 모니터링하고 설정 주변의 흔들림이나 움직임을 방지합니다. 타이머가 꺼지면 함수 발생기 채널 출력의 켜기 버튼을 눌러 채널 출력을 끄고 AC 전기장이 더 이상 전극을 통해 공급되지 않습니다. 3분 후에 비디오 녹화를 중지하고 나중에 분석할 수 있도록 저장합니다.
0.5% BSA가 포함된 DEP 버퍼 60마이크로리터를 마이크로채널로 천천히 밀어 넣고 동시에 출구를 수집하여 LiDEP 칩의 출구 끝에서 세포를 피펫팅합니다. 마이크로채널에 셀이 거의 또는 전혀 없을 때까지 계속하고 그림과 같이 모든 주파수로 DEP를 반복합니다. HMSC의 속도 및 생존율 측면에서 DEP 응답이 결정되었습니다.
5, 10, 20 전압 피크 대 피크 또는 VPP에서 양의 DEP 반응을 측정한 결과 셀이 각각 초당 0.025, 0.036 및 0.051마이크로미터의 평균 속도로 이동하는 것으로 나타났습니다. DEP 힘을 경험한 후 HMSC의 생존력 결과는 일반적으로 더 높은 전압이 20VPP에서 생존할 수 있는 전지의 57%로 더 낮은 전지 생존율을 초래한다는 것을 보여주었습니다. 이 연구를 위해 흰색, 노란색, 빨간색 및 파란색 전극을 선택했지만 LiDEP 깊이 칩을 통한 조명은 빨간색 주황색을 띤 광 전도층의 영향을 받았습니다.
따라서 투영된 흰색 전극은 내부가 흰색인 노란색으로 나타났고, 빨간색 전극은 빨간색 윤곽선이 있는 주황색으로 나타났으며, 파란색 전극은 연한 녹색으로 나타났습니다. 이 현상은 노란색과 흰색이 가장 강한 DEP 필드를 가지고 있고 파란색과 빨간색이 약하다는 것을 나타냅니다. HMC의 DEP 응답은 10VPP에서 3개의 깊이 분석기에서 LiDEP로 측정되었습니다.
LiDEP를 사용하면 양성 DEP 응답이 30 킬로 헤르츠에서 20 메가 헤르츠로 감소했습니다. 3 개의 분석기에서 셀은 양성 DEP에서 37에서 255 킬로 헤르츠로 증가했으며 양성 DEP에서 1, 772 킬로 헤르츠에서 20 메가 헤르츠로 감소했습니다. 이 방법의 두 가지 중요한 구성 요소는 전기장의 생성과 셀 조작을 보장하기 위한 강력한 광원과 견고한 전기 연결입니다.
우리는 가상 전극에 반응하여 세포가 회전하는 것을 관찰했습니다. 따라서, 전기 회전은 수행될 수 있는 또 다른 전지 분석 방법이다. 전기 회전은 HMSC의 이질성 및 희귀 하위 집단에 대한 정보를 제공합니다.
