우리는 과거와 현재의 Mao and Hu Lab의 모든 구성원이 흥미로운 토론과 프로젝트에 큰 기여를 한 것에 대해 매우 감사합니다. 국립아동건강임상연구센터(National Clinical Research Center for Child Health)의 큰 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidan Hu), 중국 저장성 자연과학재단(No. LQ22C070004 Lidan Hu)에게).

1. hiPSC 유지 보수
<ol><li>hiPSC의 해동<ol><li>액체 질소에서 세포를 꺼내고 37°C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다. 해동 셀을 3mL의 iPSC 유지 배지로 준비한 15mL 튜브로 옮깁니다(재료 표). 매체를 부드럽게 섞는다.</li>
		<li>300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 제거하고 10μM Y-27632를 사용하여 1mL의 iPSC 유지 배지에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다(세포를 위아래로 2-3회 피펫팅).</li>
		<li>세포 현탁액을 GFR(growth factor reduction)-세포외 기질 겔(1:100)과 10μM Y-27632가 미리 첨가된 2mL의 iPSC 유지 배지로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다(약 4 x 104 cells/cm2).</li>
		<li>매일 iPSC 유지 배지를 교체하여 37°C, 5% CO2 에서 5-6일(80%-90% 합류) 동안 세포를 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>hiPSC의 통과<ol><li>6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다. DPBS로 hiPSC를 한 번 씻으십시오.</li>
		<li>700-800 μL의 0.48 mM EDTA 용액을 첨가하고 실온(RT)에서 1분 동안 배양한 다음 분해 용액을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.</li>
		<li>세포가 시트로 분해될 때(세포를 단일 세포로 분해하지 않음) 10μM Y-27632와 함께 1mL의 iPSC 유지 배지를 추가하여 분해를 종료합니다. 세포를 위아래로 2-3회 조심스럽게 피펫팅합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)과 10μM Y-27632가 미리 첨가된 2mL의 iPSC 유지 배지로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다. 참고: 통과 비율은 1:6에서 1:20(약 4 x 104 cells/cm2)이며 평균 응집 크기는 약 50-200μm입니다.</li>
		<li>매일 iPSC 유지 배지를 교체하여 37°C, 5% CO2 에서 80%-90% 밀도(5-6일)까지 세포를 배양합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. EB 형성을 통한 hiPSC와 MSC의 분화
참고: 이 방법은 이전 문헌 21,22,23,24에서 파생되었습니다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법의 특징은 표 1에 요약되어 있다.
<ol><li>배지의 제조<ol><li>α-MEM에 1%(v/v) GlutaMAX, 10%(v/v) FBS, 10ng/mL FGF2 및 5ng/mL TGFβ를 보충하여 MSC 분화 배지를 준비합니다.</li>
		<li>α-MEM에 1%(v/v) GlutMAX, 10%(v/v) FBS 및 1ng/mL FGF2를 보충하여 MSC 유지 배지를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>hiPSC의 준비<ol><li>37°C, 80%-90% 밀도까지 5% CO2 까지 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트의 iPSC 유지 배지에서 hiPSC 라인(해동 후 최소 2-3회 통과).</li>
	</ol></li>
	<li>0일차: EB 형성<ol><li>6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다. DPBS로 hiPSC를 한 번 씻으십시오.</li>
		<li>700-800 μL의 0.48 mM EDTA 용액을 첨가하고 RT에서 1분 동안 배양한 다음 분해 용액을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.</li>
		<li>세포가 시트로 분해되면(세포를 단일 세포로 분해하지 않음) 2mL의 iPSC 유지 배지(10μM 암석 억제제 및 1:100 GFR- 세포외 기질 겔 포함)를 추가하여 분해를 종료합니다.</li>
		<li>세포를 6웰 낮은 부착 플레이트로 옮깁니다. 조직 배양 플레이트 2웰과 낮은 부착 플레이트 1웰의 비율로 세포를 파종합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 의 셰이커(60rpm/분)에서 24시간 동안 배양하여 구형 EB를 형성합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1일차-7일차: EB 감별<ol><li>파스퇴르 피펫을 사용하여 EB를 원심 분리기 튜브로 옮기고 (EB를 파괴하지 않고) EB가 RT에서 5-10 분 동안 자연적으로 침전되도록합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>EB를 2mL의 MSC 분화 배지가 있는 6웰 로우 부착 플레이트로 옮깁니다. 37 ° C, 5 % CO2 에서 7 일 동안 셰이커에서 EB를 배양하고 배지를 한 번 변경하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>8일차-17일차: EB 접종<ol><li>파스퇴르 피펫을 사용하여 EB를 원심 분리 튜브로 옮기고(EB를 파괴하지 않고) EB가 5-10분 동안 자연적으로 침전되도록 합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>EB를 2mL의 MSC 유지 배지가 있는 GFR-세포외 기질 겔 코팅된 6웰 플레이트로 옮깁니다. 세포 접착 후 정기적인 배지 교체로 90% 밀도(~10일)까지 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>18일차-27일차: MSC의 성숙 및 확장<ol><li>EB 유래 배양액을 37°C에서 해리 용액으로 5-10분 동안 처리합니다(세포 유형에 따라 분해 시간이 달라짐).</li>
		<li>세포의 일부가 단일 세포로 분해되면 MSC 유지 배지 2mL를 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화되지 않은 나머지 세포를 DPBS로 한 번 씻고 다시 소화합니다. 모든 세포가 단일 세포로 분해될 때까지 여러 번 반복합니다. 셀 현탁액을 250 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>젤라틴 코팅 배양 플레이트(약 2 x 105 cells/cm2)에 세포를 파종합니다. MSC 유지 배지에서 90% 밀도가 될 때까지 배양하고 배지를 정기적으로 교체합니다. 이 시점에서 이 세대의 세포를 통로 0(P0)으로 지정합니다.</li>
		<li>MSC를 순수하고 성숙하게 만들기 위해 약 6일 동안 1:3 분할 비율로 세포를 두 번 계속 통과시킵니다. 대부분의 세포는 섬유아세포와 같은 형태(방추형)를 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 단층 배양을 통한 MSC와 hiPSC의 차별화
참고: 이 방법은 이전 문헌 25,26,27,28에서 파생되었습니다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법의 특징은 표 1에 요약되어 있다.
<ol><li>배지의 제조<ol><li>α-MEM을 1%(v/v) GlutMAX, 10%(v/v) FBS 및 1ng/mL FGF2로 보충하여 MSC 유지 배지를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>hiPSC의 준비<ol><li>37°C에서 5% CO2 가 50%-60% 밀도가 될 때까지 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트의 iPSC 유지 배지에서 hiPSC 라인(해동 후 최소 2-3회 통과).</li>
	</ol></li>
	<li>0일차-13일차: 직접 단층 배양에 의한 분화<ol><li>6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다.</li>
		<li>MSC 유지 배지 2mL를 직접 첨가하고 37°C, 5%CO2 에서 14일 동안 배양하고 배지를 매일 교체합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>14일차-35일차: 반복 통과에 의한 MSC 성숙<ol><li>단층 배양액을 37°C에서 해리 용액으로 5-10분 동안 처리합니다(세포 유형에 따라 분해 시간이 달라짐).</li>
		<li>세포가 단일 세포로 분해되면 2mL의 MSC 유지 배지를 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화되지 않은 나머지 세포를 DPBS로 한 번 씻고 다시 소화합니다. 모든 세포가 단일 세포로 분해될 때까지 여러 번 반복합니다. 셀 현탁액을 250 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>젤라틴으로 코팅된 배양 접시(약 2 x 105 cells/cm2)에 세포를 파종합니다. MSC 유지 관리 배지에서 90%의 밀도가 될 때까지 배양하고 배지를 정기적으로 교체합니다. 이 시점에서 이 세대의 세포를 통로 0(P0)으로 지정합니다.</li>
		<li>MSC를 순수하고 성숙하게 만들기 위해 약 18일 동안 1:3 분할 비율로 세포를 6회 계속 통과시킵니다. 대부분의 세포는 섬유아세포와 같은 형태(방추형)를 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 유세포 분석에 의한 hiPSC 유도 MSC의 표면 항원 분석
참고: 골수 유래 MSC의 표면 항원과 유사하게, hiPSC를 유도하는 MSC는 CD105, CD73 및 CD90을 발현하지만, CD45, CD34는 발현하지 않는다29. 또한 hiPSC를 음성 대조 세포로 사용할 수 있습니다. 유세포 분석에 의한 hiPSC 유도 MSC 및 hiPSC의 표면 항원 분석은 그림 2에 나와 있습니다.
<ol><li>hiPSC 구동 MSC를 37°C에서 해리 용액으로 2-3분 동안 처리합니다. hiPSC를 0.48mM EDTA 해리 시약으로 처리하고 RT에서 1분 동안 배양한 다음 해리 시약을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.</li>
	<li>세포가 단일 세포로 분해되면 배지(MSC에 MSC 유지 배지, iPSC에 iPSC 유지 배지)를 추가하여 분해를 종료합니다.</li>
	<li>셀 현탁액을 350 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>차가운 DPBS로 세포를 한 번 세척하고 350 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>10 x 106 cells/mL의 차가운 10% FBS-DPBS(v/v) 용액에서 세포를 계수하고 재현탁시키고 100μL/튜브의 세포 현탁액(1 x 106 세포/튜브)을 1.5mL 원심분리 튜브에 분배합니다.</li>
	<li>5μL의 인간 Fc 수용체 차단 용액을 100μL의 세포 현탁액에 추가합니다. 비특이적 차단을 수행하기 위해 RT에서 5-10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>350 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액으로 세포를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>2% FBS-DPBS(v/v) 용액의 차가운 100μL에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
	<li>100μL 세포에 5μL(1 테스트)의 anti-CD34-FITC와 5μL의 anti-CD45-APC를 추가합니다. 서스펜션. 다른 100μL 세포 현탁 튜브에 5μL(1 테스트)의 anti-CD73-APC, 5μL의 anti-CD90-FITC의 90 μL(1 테스트) 및 5 μL의 anti-CD105-PE를 추가합니다. 5μL의 인간 IgG1 동형 대조군 FITC, 인간 IgG1 동형 대조군 PE 및 인간 IgG1 동형 대조군 APC를 세 번째 100μL 세포 현탁 튜브에 추가합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 15-20분 동안 배양합니다. 한편, 단일 염색 구슬을 준비합니다.</li>
	<li>차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액으로 세포를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>300μL의 차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액을 추가하여 세포를 재현탁시키고 200 메쉬 스크린 필터를 통해 필터링합니다.</li>
	<li>유세포 분석을 사용하여 샘플을 분석합니다. isotype control 항체로 염색된 세포 현탁액을 분석하고 게이트를 설정합니다. 그런 다음 표적 항체로 염색된 세포 현탁액을 분석합니다.</li>
</ol>5. hiPSC 유도 MSC의 골형성 분화
참고: hiPSC를 구동하는 MSC는 골형성 분화 전위가 있습니다(그림 3A, B). 골형성 분화를 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.
<ol><li>α-MEM에 10% FBS, 100nM 덱사메타손, 10mM 베타-글리세로포스페이트 및 100μM 아스코르브산을 보충하여 골형성 유도 배지를 준비합니다.</li>
	<li>1 x 105 MSC를 젤라틴으로 코팅된 48웰 플레이트에 파종하고 60%-70%가 합류할 때까지 배양합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 0.3mL의 골형성 유도 배지를 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 14 일 동안 골형성 유도 배지에서 세포를 3 일마다 배지를 교체하여 배양합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 DPBS로 한 번 씻으십시오.</li>
	<li>4% PFA 0.3mL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PFA를 제거합니다. RT에서 10분 동안 0.3mL의 DPBS로 세포를 헹구고 3회 반복합니다.</li>
	<li>DPBS를 제거하고 Alizarin red 염색액 0.2mL를 첨가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>염색액을 제거하고 0.3mL DPBS로 세포를 상온에서 10분 동안 헹구고 3회 반복합니다.</li>
	<li>광학 현미경으로 칼슘 침착의 염색을 관찰합니다.</li>
</ol>6. hiPSC 구동 MSC의 지방 분화
참고: hiPSC 구동 MSC는 지방 분화 전위를 가지고 있습니다(그림 3C, D). 지방 분화를 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.
<ol><li>α-MEM에 10% FBS, 1μM 덱사메타손, 1μM IBMX, 10μg/mL 인슐린 및 100μM 인도메타신을 보충하여 지방 생성 유도 배지를 준비합니다. α-MEM에 10% FBS와 10μg/mL 인슐린을 보충하여 지방 생성 유지 배지를 준비합니다.</li>
	<li>젤라틴으로 코팅된 48웰 플레이트에 1 x 105 MSC를 파종하고 세포 밀도가 90%에 도달할 때까지 배양합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 0.3mL의 지방 유도 배지를 추가합니다. 지방 유도 배지에서 세포를 37 ° C, 5 % CO2 에서 4 일 동안 계속 배양합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 0.3mL의 지방 유지 배지를 추가합니다. 지방 생성 유지 배지에서 세포를 37 ° C, 5 % CO2 에서 3 일 동안 계속 배양합니다.</li>
	<li>지방 세포 분화 및 성숙이 이루어질 때까지 6.3 및 6.4 단계를 2-3회 반복합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 DPBS로 한 번 씻으십시오.</li>
	<li>4% PFA 0.3mL를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. PFA를 제거하고 DPBS로 2회 헹굽니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 Oli Red O 염색제를 바르고 광학 현미경으로 지질 방울을 관찰합니다.</li>
</ol>7. hiPSC 구동 MSC의 연골 분화
참고: hiPSC 구동 MSC는 연골 분화 전위를 가지고 있습니다(그림 3E, F). 연골 분화에 대한 프로토콜은 다음과 같습니다.
<ol><li>α-MEM에 10% FBS, 100nM 덱사메타손, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 10μM 아스코르브산, 1mM 피루브산나트륨, 50μg/mL 프롤린, 0.02nM 형질전환 성장 인자 β3(TGFβ3) 및 0.5μg/mL 골 형태 형성 단백질 6(BMP-6)을 보충하여 연골아세포 유도 배지를 준비합니다.</li>
	<li>2.5 x 105 hiPSC 구동 MSC를 수집하고 세포를 150 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다. 세포를 1mL의 α-MEM에 현탁시킨 다음 150 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 0.5mL의 연골 유도 배지에 세포를 현탁시킵니다. 세포를 150 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>뚜껑의 나사를 직접 풀고 37 ° C, 5 % CO2에서 3 일마다 연골 유도 배지를 교체하여 21 일 동안 배양합니다. 원심분리기 튜브를 부드럽게 튕겨 연골 분화 중에 매일 연골 펠릿(연골 펠릿을 파괴하지 않고)을 부유시킵니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 PBS 0.5mL로 두 번 세척합니다.</li>
	<li>4% PFA 0.3mL를 넣고 24시간 동안 고정합니다.</li>
	<li>파라핀은 연골 펠릿을 내장한 다음 절편합니다(3μm). 톨루이딘 블루(1%) 섹션을 30분 동안 염색합니다.</li>
	<li>광학 현미경으로 세포외 연골세포 기질을 관찰합니다.</li>
</ol>

hiPSC-Driving MSC의 표면 항원 및 증식 능력 특성화

<ol>
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S., Seufert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+treatment+of+diabetes+mellitus+-+Focus+on+mesenchymal+stem+cells.">Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells.</a> Metabolism. 90, 1-15 (2019).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+derivation+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).</li><li>Hua, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-intensity+pulsed+ultrasound+promotes+osteogenic+potential+of+iPSC-derived+MSCs+but+fails+to+simplify+the+iPSC-EB-MSC+differentiation+process.">Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).</li><li>Dupuis, V., Oltra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+produce+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells:+Mesenchymal+stem+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+stem+cells.+A+Werner+syndrome+stem+cell+model+unveils+heterochromatin+alterations+as+a+driver+of+human+aging.">Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging.</a> Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Fanconi+anemia+pathogenesis+and+therapeutics+using+integration-free+patient-derived+iPSCs.">Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4330 (2014).</li><li>Kubben, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+the+antioxidant+NRF2+pathway+in+premature+aging.">Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging.</a> Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).</li><li>Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+deficiency+reprogrammes+human+neural+stem+cells+towards+a+glioblastoma+stem+cell-like+phenotype.">PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype.</a> Nature Communications. 6, 10068 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+from+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+MSCs+facilitate+cutaneous+wound+healing+by+promoting+collagen+synthesis+and+angiogenesis.">Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).</li><li>Hu, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+secreted+by+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells+attenuate+limb+ischemia+by+promoting+angiogenesis+in+mice.">Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 10 (2015).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+retain+adequate+osteogenicity+and+chondrogenicity+but+less+adipogenicity.">Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 144 (2015).</li><li>Wang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+results+in+downregulation+of+c-Myc+and+DNA+replication+pathways+with+immunomodulation+toward+CD4+and+CD8+cells.">Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells.</a> Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Kim, S., Kim, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem-like+cells+for+producing+extracellular+vesicles.">Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).</li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 프로토콜에서는 hiPSC를 MSC로 분화하는 두 가지 대표적인 방법을 조사하였다 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. 두 방법 모두 hiPSC에서 MSC를 유도할 수 ...

중간엽 기질 세포(Mesenchymal stromal cell, MSCs)는 중배엽 유래 성체 만능 줄기세포이다1. MSC는 거의 모든 결합 조직에 존재한다2. MSC가 1970년대에 처음 발견되고 1987년 Friedenstein et al.3,4,5에 의해 골수에서 성공적으로 분리된 이래, 다양한 인간 체세포(태아 및 성인 포함) 조직이 뼈, 연골, 힘줄, 근육, 지방 조직 및 조혈 지지 기질과 같은 MSC를 분리하는 데 사용되었습니다 1,2,6,7 . MSC는 많은 체세포 계통으로 분화할 수 있는 높은 증식 능력과 가소성을 보여주며 손상되고 염증이 있는 조직으로 이동할 수 있습니다 2,8,9. 이러한 특성으로 인해 MSC는 재생 의학의 잠재적 후보가 될 수 있다10. 그러나, 체세포 조직 유래 MSC(st-MSCs)는 제한된 기증, 제한된 세포 증식 능력, 품질 변화 및 기증자로부터 병원체의 전염 가능성에 대한 생물학적 안전성 우려에 의해 제한된다11,12.
인간 유도만능줄기세포(Human induced pluripotent stem cell, hiPSCs)는 전사인자(transcription factor)(Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)로 재프로그래밍하는 성체 세포에서 유래하며, 이는 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 유사한 기능을 갖는다13,14. 그들은 자가 재생이 가능하며 MSC를 포함한 모든 유형의 체세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. st-MSC와 비교하여 iPSC-MSC는 무제한 공급, 저렴한 비용, 더 높은 순도, 품질 관리의 편리성, 규모 생산 및 유전자 변형이 용이하다는 장점이 있습니다 15,16,17.
iPSC-MSC의 이러한 장점으로 인해 iPSC에서 MSC를 구동하는 다양한 방법이 보고되었습니다. 이러한 분화 방법은 두 가지 배양 방법론, 즉 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양(monolayer cultures)의 사용(11,18,19,20)을 중심으로 이루어졌다. 여기에서, 두 가지 방법론 각각에 대한 대표적인 접근법을 특징지었다. 또한, 시간, 비용, 증식 능력, MSC 바이오마커 발현 및 체외 분화 능력에 기반한 두 가지 대표적인 접근법 간의 비교도 이루어졌습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alizarin red staining kit</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>C0148S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD105 (PE)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD34 (FITC)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD45 (APC)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD73( APC)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD90 (FITC)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-6</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>C012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide level shaker</td>
			<td>Crystal</td>
			<td>CO-06UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation Beads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>424601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>ST1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12&#160; medium</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>HAKATA</td>
			<td>HS-FBS-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>78003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human IgG1 isotype control APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>403505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human IgG1 isotype control FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>403507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human IgG1 isotype control PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>403503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>78067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>ST1398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SI9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>P3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC maintenance medium</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Media Supplement</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>C0341-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>BD Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oli Red O staining kit</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>C0158S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;3</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>CJ44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme(1x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 Well Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparison of two representative methods for differentiation of human induced pluripotent stem cells into mesenchymal stromal cells

중간엽 기질 세포(MSC)는 재생 의학에서 널리 사용되어 온 성체 만능 줄기세포입니다. 체세포 유래 MSC는 제한된 기증, 품질 변화 및 생물학적 안전성으로 인해 제한됨에 따라 지난 10년 동안 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)에서 MSC를 생성하려는 노력이 크게 증가했습니다. hiPSC를 MSC로 분화하기 위한 과거와 최근의 노력은 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양의 사용이라는 두 가지 배양 방법론을 중심으로 이루어졌습니다. 이 프로토콜은 hiPSC에서 MSC를 유도하는 두 가지 대표적인 방법을 설명합니다. 각 방법은 시간, 비용, 세포 증식 능력, MSC 마커의 발현, 체외 분화 능력 등 장단점을 나타냅니다. 이 프로토콜은 두 방법 모두 hiPSC에서 성숙하고 기능적인 MSC를 도출할 수 있음을 보여줍니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 용이한 것이 특징인 반면 EB 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

프로토콜(그림 1A)에 따라 hiPSC는 EB 형성 및 단층 배양 방법을 통해 MSC로 분화되었습니다. 분화 과정에서 세포는 서로 다른 대표 형태를 보였습니다(그림 1B,C).
그림 1B에서 볼 수 있듯이 hiPSC 콜로니는 분화 전에 촘촘하게 채워진 세포로 구성된 명확한 경계로 전형적인 조밀한 형태를 나타냅니다. hi...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in iPSCs and Genetic Disease Research at JoVE.com

저자 스포트라이트: iPSC 및 유전 질환 연구의 발전 

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...

본 연구의 범위는 유전 질환의 메커니즘 및 치료 전략 연구입니다. 우리의 연구는 세포주, iPSC, 오가노이드 및 마우스와 같은 다단계 질병 모델을 기반으로 합니다. iPSC는 다른 모델에 비해 뚜렷한 장점이 있습니다.환자의 iPSC와 후속 파생 세포 및 오가노이드는 환자와 동일한 게놈을 공유하며, 이는 많은 질병에 대한 환자 세포 및 모델 뱅크를 제공합니다. 또한, 환자로부터 확립된 iPSC의 방법은 상당히 성숙합니다. iPSC를 특정 세포와 오가노이드로 분화하는 방향으로 많은 과제가 남아 있으며, 현재 개발 중인 개발 메커니즘에 대한 심화된 이해가 현장에서 발생할 것입니다.

comparison-two-representative-methods-for-differentiation-human

Research

JoVE Journal

Biology

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

911 조회수.  The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine. 본 연구의 범위는 유전 질환의 메커니즘 및 치료 전략 연구입니다. 우리의 연구는 세포주, iPSC, 오가노이드 및 마우스와 같은 다단계 질병 모델을 기반으로 합니다. iPSC는 다른 모델에 비해 뚜렷한 장점이 있습니다.환자의 iPSC와 후속 파생 세포 및 오가노이드는 환자와 동일한 게놈을 공유하며, 이는 많은 질병에 대한 환자 세포 및 모델 뱅크를 제공합니다. 또한, 환자로?...

비디오: 저자 스포트라이트: iPSC 및 유전 질환 연구의 발전 

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

연구

생물학

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.