Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

96 웰 플레이트 1.면 준비 <ol><li> 다른 기판과 세포 유형의 개요를 96 웰 플레이트의지도를 생성 (그림 1) 검사합니다. </li><li> 다른 기판 [폴리 -L- 라이신, 피브로넥틴, 나는, 라미닌 및 entactin - 콜라겐 IV-라미닌 (ECL) 형 콜라겐, 96 웰 멀티 웰 플레이트와는 무균 세포 배양에 워크 스테이션을 준비의 주식 솔루션을 확보 후드. </li><li> (이 농도는 이전에 세포의 성장과 증식에 기질 농도 의존적​​ 분석에 기초하여 결정 하였다) 5 ㎍ / ml의 최종 농도로 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 희석하여 스톡 각 기체를 준비한다. 멸균 용기에 주입하기 전에 소용돌이를 사용하여 섞는다. </li><li> 96- 웰 맵 (도 1)에 따라 각 웰에 기질 용액 100 ㎕를 추가 (12 또는 8 채널 마이크로 피펫 96- 웰 플레이트 micropipetting위한 편리). 파라 필름의 스트립을 사용하여 96 웰 플레이트에 뚜껑을 밀봉하고 4 ℃에서 하룻밤 저장합니다. </li></ol> 2. 셀 도금 및 시간 경과 영상 주 : 마우스 중간 엽 줄기 세포가 성체 C57BL / 6 마​​우스의 골수로부터 단리 및 점착성 세포주로 유지 하였다. 렌티 바이러스 벡터의 인코딩 BDNF (LV-BDNF를 사용하고, 아교 세포 유래 신경 영양 인자 (사람의 cDNA GDNF), 중간 엽 줄기 세포는 뇌 유래 신경 영양 인자 (사람의 cDNA BDNF)를 분비하도록 엔지니어 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 감염 CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), 녹색 형광 단백질 (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). 주 : 마우스 중간 엽 줄기 세포에 대한 배양 매체 (MSC들)는 10 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 %의 하이 브리 도마 - 정규화 소 태아 혈청, 10 % 말 혈청, 2 mM L- 글루타민, 및 10000 U / ㎖ 페니실린을 함유 Iscove 개변 둘 베코 중간 . 마우스 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포, GFP - 중간 엽 줄기 세포, BDNF-GFP - 중간 엽 줄기 세포, GDNF-GFP-M의 다섯 가지 유형SCS에와 BDNF는 / GDNF-GFP - 중간 엽 줄기 세포는) T75 세포 배양 플라스크에 약 30 %의 합류에 도금했다. <ol><li> 셀 도금 <ol><li> 두번 그 다음날, 흡인 기판 솔루션을 제거하고 멸균 PBS 약 200 μL로 각 웰을 씻어. PBS 최종 헹굼 후 각 웰에 세포 배양 배지를 (200 μL / 웰)을 추가한다. 37 ° C, 5 % 평형에 대한 CO 2로 설정 세포 배양 인큐베이터로 96 웰 플레이트를 놓습니다. </li><li> 96 웰 플레이트를 인큐베이터에서 평형화 동안 세포 수확 성장 배지를 수집하여 (T75 플라스크에서 중간 엽 줄기 세포 수확 / 도금시 약 70 %의 융합 성이 있어야한다) T75 플라스크 (같이 조정 배지라고 함) 및 멸균 조건 하에서 15ml의 원뿔형 튜브에 기억 (이 조정 배지는하기 단계 2.1.4에서 사용한다). </li><li> 플라스크에 멸균 PBS의 8 ML을 추가하고 부드럽게 소용돌이 후 PBS를 피펫 0.05 % 트립신 1 ml의 0.01 %를 추가EDTA 용액을 T75 플라스크 배양 표면에서 세포를 분리한다. 위상차 광학이 장착 도립 현미경을 사용하여 플라스크를 보면 세포 분리를 모니터한다. </li><li> 세포가 분리되면, 즉시 플라스크에 (단계 2.1.2에서 수집) 조절 된 미디어의 8 ㎖를 추가합니다. 세포 현탁액을 수집하고 세포 펠렛 450 XG에서 4 분 동안 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에서 원심 분리에 옮긴다. </li><li> 상등액을 제거하고 200 ㎕의 신선한에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 (도 37의 C) 세포 배양 배지 가온. </li><li> 혈구를 이용하여 트리 판 블루 균량을 행함으로써 세포 현탁액 중의 세포 수를 결정한다. 약 300 세포의 밀도 / 웰로 96- 웰 플레이트의 적당한 웰에 세포를 접시. </li><li> 각 셀 인구에 대해 이러한 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 시간 경과 영상 <ol><li> 중간 엽 줄기 세포의 모든 도금되고 나면, 장소2 시간 동안 인큐베이터로 96 웰 플레이트는 중간 엽 줄기 세포는 상기 기판에 부착 할 수 있도록한다. </li><li> HCS 시스템을 시작하고 시스템이 평형을 2 시간 동안 기다립니다. 37 ° C로 제어 환경을 설정하고 일정한 공기 공급원 HCS 시스템 환경 챔버로 공기 중 5 % CO 2를 함유하는 혼합 가스 실린더를 연결한다. </li><li> 2 시간의 평형 기간 후의 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거하고 HCS 시스템의 세포 증식 챔버 내로 직접 배치. 평형은 판의 열 관련 확장을 고려하고 판 설정을 구성 할 수있는 이미지 수집 및 분석 소프트웨어를 시작하는 30 분을 허용합니다. </li><li> 영상의 20 배 목표를 선택합니다. [즉, 등 피브로넥틴에 GFP - 중간 엽 줄기 세포 (× 2 회 반복 (30)의 조건 = 총 60 우물의 총 6 기판 × 5 MSC 서브 타입)] 시간 경과 영상을 설정하는 조건 당 두 개의 우물을 선택합니다. 와 이미징을위한 두 개의 사이트를 선택물론 각. </li><li> 영상에 대한 올바른 파장의 빛을 선택합니다. 참고 : 두 개의 서로 다른 파장 (상 대비 및 GFP의 형광) 시간 경과 영상으로 선택했다. </li><li> 레이저 오토 포커스 기능을 사용하여 잘 바닥에 초점 최적화 된 초점면을 찾기 위해 여러 사이트 및 여러 우물에 대한 테스트 이미지를 가지고. </li><li> 초점이 설정되면, 모든 60 우물 (120 사이트)에 48 시간 동안 이미지를 5 분마다 캡처를 시작. </li><li> HCS 시스템에서 96 웰 플레이트를 제거하여 세포마다 24 시간 피드. 각에서 미디어의 75 μl를 잘 제거하고 각 웰에 신선한 매체의 100 μl를 추가 (37 ° C 5 % CO에서이 새로운 미디어를 평형 2). </li><li> 시간 경과 실험의 끝에서, HCS 시스템에서 96 웰 플레이트를 제거한다. 멸균 조건 하에서, 각 웰로부터의 조정 배지의 샘플을 수집하고 다른 96- 웰 플레이트로 이들 샘플을 전송. 참고 :이 샘플이 더 analys 사용할 수 있습니다신경 영양 인자 ELISA를 수행하는 것입니다. </li><li> 이러한 Ki67 세포 증식 분석 또는 요오드화 프로피 듐 라이브 / 죽은 얼룩 분석 (자세한 내용은 아래 참고) 등의 추가 분석을 배양 중간 엽 줄기 세포와 함께 96 웰 플레이트를 준비합니다. </li><li> 아래 섹션 5에 기술 된 바와 같이 세포 이동 / 셀 추적을위한 시간 경과 영상 분석을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 3. Ki67 세포의 증식과 프로피 디움 요오드 라이브 / 죽은 분석 <ol><li> Ki67 세포 증식 분석 (면역 세포) <ol><li> 0.1 M 인산 (PO 4) 일분 두 번 버퍼와 세포 배양을 씻어. 실온에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 배양 수정. PFA를 제거 7 분 3 회 PBS로 우물을 씻어. </li><li> 최종 헹굼 후, 각 웰을 차단 용액 100 ㎕ (인산 완충 식염수, 5 % 정상 당나귀 혈청, 0.4 % 소 혈청 알부민, 0.2 %의 트리톤 X-100)을 추가ND을 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 200 : 1의 작업 비율로 차단 용액에 희석하여 차 항체, 토끼 반 Ki67을 준비합니다. </li><li> 차단 솔루션을 제거하고 각 웰에 차 항체 용액 100 μl를 적용합니다. 96 웰 플레이트를 덮고 하룻밤 4 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> 다음날, 항체 용액을 제거하고, 7 분, PBS로 3 회 헹군다. </li><li> 차 항체를 준비, 당나귀 항 - 토끼를 Cy3 1의 작업 비율로 차단 솔루션에 : 500. 100 : 1의 희석 차 항체 용액에 DAPI 핵 얼룩을 추가합니다. 마지막 헹굼의 PBS를 제거한 후, 각 웰에 차 항체 / DAPI 용액 100 μL를 적용. 90 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 배양한다. </li><li> 이차 항체 / DAPI 용액을 제거하고 7 분, 3 회, PBS로 각 웰을 씻어. 영상까지 4 ° C에서 96 웰 플레이트 및 저장을 커버. </li></ol></li><li> Propidium 요오드 라이브 / 죽은 분석 <ol><li> 후술하는 바와 같이 요오드화 프로피 듐 (PI) 배제 분석법에 의한 세포 사멸을 측정한다. </li><li> 배양 배지에서 1.5 μM의 농도로 요오드화 프로피 듐 염색 용액을 준비한다. </li><li> 그 세포를 죽이는 목적으로 2 분 동안 중간 엽 줄기 세포의 잘 하나에 70 % 에탄올 100 μl를 추가합니다. 이 우물은 PI 얼룩에 대한 긍정적 인 제어 역할을합니다. 중간 엽 줄기 세포의 대부분은 PI 염색 세포의 사멸을 나타내는 것이다. 에탄올 용액을 제거합니다. </li><li> 각 웰에 요오드화 프로피 듐 염색 용액 100 ㎕를 첨가하고, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 1 분, 2 회 0.1 M 인산 버퍼로 세포를 씻어. 실온에서 20 분 동안 0.1 M P0 4 완충액 4 % PFA로 세포를 고정. 7 분 동안 세 번 PFA를 제거하고 PBS로 씻어. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 차단 DAPI 용액에 희석 용액 (1시 50분)와 인큐베이션. 모든 우물을 씻어7 분, 3 회 PBS. </li><li> DAPI 용액을 제거하고 7 분, 3 회, PBS로 각 웰을 씻어. 영상까지 4 ° C에서 96 웰 플레이트 및 저장을 커버. </li></ol></li></ol> 4. 자동화 된 이미징 및 다중 파장 점수 분석 <ol><li> 96 웰 플레이트를로드 HCS 시스템에 (이전 Ki67의 immunolabeling 또는 요오드화 프로피 듐 염색에 대한 처리) 20 분 HCS 시스템 이미지 수집 및 분석 소프트웨어를 열기 판은 평형 수 있습니다. </li><li> 세포가 자동 노출 기능을 이용하여 상주 관심있는 각각의 파장에 대한 오프셋을 계산하는 Z 평면 찾기 1 비닝 카메라 (2)의 이득 설정을 사용하여 10 배 대물 대한 인수 설정을 선택한다. 이 분석을 위해, DAPI (W1)를 Cy3 (W2) 및 FITC (W3)에 대한 이미지를 캡처합니다. 음성 대조군 웰은 화상 획득에 대한 신호를 보여주지있는 최대 휘도 레벨을 선택한다. 이 설정을 확인하면 POS에 적합을 직관적으로 우물. </li><li> 판을 획득. 이미지를 캡처하고 이미지 수집 및 분석 소프트웨어의 데이터베이스에 저장합니다. </li><li> 이미지가 인수되고 나면, 이미지에서 열린 이미지 수집 및 분석 오프라인 소프트웨어 및 검토 판 데이터는 위의 인수했다. </li><li> 다중 파장 점수 분석을 선택합니다. 각 파장에 대한 최소 및 최대 강도를 구성합니다. 참고 : DAPI 감지 각 표시 핵 주위의 얼룩을 표시해야합니다. 를 Cy3는 Ki67 면역 (IR)와 양성 세포를 감지해야하며, 음성 대조군에서 IR을 감지하지 않아야합니다. Cy3에 Ki67 IR 들어, 대략 최소 폭이 대략 최대 폭이 30 ㎛, 7 ㎛, 로컬 상기 배경 강도는 150 계조이고, 최소 염색 면적은 50㎛의 2였다. </li><li> 모든 위치에 대한 실행 분석. 스프레드 시트에서 볼 수있는 데이터를 내 보냅니다. </li></ol> 5. 셀 추적 <ol><li> 열기 이미지 acquisition 및 분석 프로그램 및 클릭 &quot;검토 플레이트 데이터 [DB] ...&quot;관심있는 판을 선택. </li><li> &quot;음 대 시간&quot;으로 데이터를 볼 수 있습니다. </li><li> 원하는 선택에 왼쪽 버튼으로 클릭하여 &quot;사이트&quot;섹션에서 사이트 중 하나를 선택합니다. 선택에서 &quot;... 전송 ​​된&quot; &quot;파장&quot;. 마우스 오른쪽 단추로 96 웰 플레이트 템플릿에 잘 대상을 클릭하고 &quot;이미지로드&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;애플 리케이션&quot;다음 &quot;트랙 개체&quot;를 클릭하여 세포를 추적 할 수 있습니다. </li><li> 사용 &quot;동적 데이터 교환 (DDE)는&quot;예를 들어, 데이터, Microsoft Excel을 내보낼 형식을 선택합니다. </li><li> 원산지, 델타 x와 델타 Y에 예를 들어 수출, 경과 시간, 개체 수, 거리, 시간 간격, 속도, 절대 각도, 거리에 추적 데이터를 선택합니다. </li><li> 표적 세포의 &quot;Ctrl 키 + 마우스 왼쪽 버튼을 클릭&quot;하여 원하는 각 셀에 태그. </li><li> 트랙 세포. 필요한 경우, 정지 / &quot;ESC&quot;키를 사용하여 세포의 부적절한 추적을 변경 한 다음 설정을 조정합니다. </li><li> 셀 추적이 완료되면, &quot;로그 데이터&quot;와 데이터를 저장한다. </li></ol>

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	<li>Thoenen, H., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+from+enthusiastic+expectations+through+sobering+experiences+to+rational+therapeutic+approaches.">Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches.</a> Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).</li><li>Park, H., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+regulation+of+neural+circuit+development+and+function.">Neurotrophin regulation of neural circuit development and function.</a> Nature reviews. 14, 7-23 (2013).</li><li>Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+for+midbrain+dopaminergic+neurons.">GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.</a> Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).</li><li>Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+and+migration+of+human+bone+marrow+stromal+cells+implanted+in+the+brains+of+albino+rats--similarities+to+astrocyte+grafts.">Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).</li><li>Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+strategy+for+cell+and+gene+therapy:+harnessing+the+power+of+adult+stem+cells+to+repair+tissues.">One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).</li><li>Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+of+the+spinal+cord+following+intravenous+delivery+of+bone+marrow+cells.">Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells.</a> Glia. 39, 229-236 (2002).</li><li>Hofstetter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+stromal+cells+form+guiding+strands+in+the+injured+spinal+cord+and+promote+recovery.">Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).</li><li>Chopp, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+neural+injury+with+marrow+stromal+cells.">Treatment of neural injury with marrow stromal cells.</a> Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+marrow+stromal+cells+restores+cerebral+blood+flow+and+reduces+cerebral+atrophy+in+rats+with+traumatic+brain+injury:+in+vivo+MRI+study.">Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study.</a> Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).</li><li>Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+into+acid+sphingomyelinase-deficient+mice+delays+the+onset+of+neurological+abnormalities+and+extends+their+life+span.">Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).</li><li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+BDNF-secreting+mesenchymal+stem+cells+provides+neuroprotection+in+chronically+hypertensive+rat+eyes.">Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52, 4506-4515 (2011).</li><li>Arnhold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirally+transduced+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+pigment+epithelial+cells+and+induce+rescue+effects+in+RCS+rats.">Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 47, 4121-4129 (2006).</li><li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+transplantation+of+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+delays+retinal+degeneration+in+the+RCS+rat+model+of+retinal+degeneration.">Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration.</a> Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).</li><li>Xia, X., Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+a+high-content+screening+approach+to+stem+cell+research+and+drug+discovery.">Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+a+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 41-49 (2002).</li><li>Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+and+human+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+neurons.">Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).</li><li>Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+as+therapeutic+agents+and+potential+targeted+gene+delivery+vehicle+for+brain+diseases.">Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).</li><li>Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+features+of+mesenchymal+stem+cells.">Neuroprotective features of mesenchymal stem cells.</a> Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).</li><li>Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells+in+spinal+cord+injury,+regenerative+medicine+and+possible+clinical+applications.">The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications.</a> Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+lentivirus-mediated+TH+and+GDNF+genetic+engineering+mesenchymal+stem+cells+on+Parkinson's+disease+rat+model.">The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model.</a> Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).</li><li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+released+from+engineered+mesenchymal+stem+cells+attenuates+glutamate-+and+hydrogen+peroxide-mediated+death+of+staurosporine-differentiated+RGC-5+cells.">Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells.</a> Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).</li><li>Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+human+embryonic+stem+cell-derived+hN2+cells+using+automated+high-content+image+analysis.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis.</a> Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).</li></ol>

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성인 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)은 셀룰러 및 유전자 전달 기반 치료법​​을 조합 한 실험 전략의 개발을위한 매력 세포 유형이다. 중간 엽 줄기 세포는 17, 18 패러다임 / 차별화 적절한 유도와 신경 및 신경 교세포 계통에 transdifferentiating, 중배엽 계통의 세포로 분화 할 수있는 다 능성, 그리고 상당한 소성을 표시합니다. 또한, 중간 엽 줄기 세포 이식 및 신경 퇴행성 조건 (19)을 포함하여 장애의 숫자에 대한 임상 연구에서 효과가 입증되었다. 중간 엽 줄기 세포의 치료 효과는 부대 유익한 항 증식, 항 염증 및 항 아폽토시스 활동 (20)에 의한 공지되어있다. 중간 엽 줄기 세포는 가능성이 부상 또는 질병 (21)의 사이트에 이식 다음 순진한 중간 엽 줄기 세포와 관련된 신경 품질에 기여하는 다양한 신경 영양과 성장 인자를 생산하고 분비하는 것으로 알려져있다. IMPOrtantly, 중간 엽 줄기 세포는 유전자 결합 셀룰러 및 유전자 요법 기반 애플리케이션을위한 신경 영양 인자의 지속적인 전달을 위해 수정 될 수 있으며, CNS 11,19,22 상해 또는 질병의 동물 모델들에서 이용되어왔다. 결합 된 세포 및 유전자 치료 기반 전략을 개발에서는, 셀의 상태가 심하게 체외 그들의 광범위한 사용에 앞서, 특히 생체 내 용도로 평가하는 것이 중요하다. 개념의 증거로서, 우리는 높은 콘텐츠 심사 (HCS) 방식을 사용하여 세포의 건강과 체력에 유전자 조작의 결과를 연구하기 위해 설계 및 제어 MSC 라인의 다수의 인구를 조사 하였다. 일반적으로, HCS 세포 이미지 기반의 높은 처리량 검사 (14)를 의미한다. 이 검사 방법은 공간의 여러 수준 (일 밀리 초) (세포 내에 셀) 및 시간 해상도에서 세포 표현형의 정량적 평가를 허용다양한 실험 조건에서 해결 방법. 세포 증식, 녹색 형광 단백질의 발현 (GFP), 세포 사멸, 세포 운동성 / 마이그레이션 : 우리는 다음과 같은 매개 변수에 대한 기판 환경에서 가능한 차이를 액세스이 방법을 사용. 실험은 96 웰 세포 배양 플레이트 형식으로 설계 하였다. 하나의 판 안에 우리는 일상적으로 렌티 바이러스 형질 세포의 다른 MSC 인구에 대한 각 매개 변수에 대한 가능한 기판 관련 차이를 조사하고 원본과 설계 중간 엽 줄기 세포, 비 형질 중간 엽 줄기 세포를 비교했다. 이것은 직접 저속 디지털 이미징을 수행하여 프로피 듐 요오다 이드 염색을 이용 Ki67에 immunolabeling 라이브 / 죽은 세포 생존력 분석을 이용하여 이러한 세포 증식과 같은 시험 관내 어 세이의 배터리 셀 동작과 다른 MSC 아형에 대한 결과를 비교하는 수단을 구비 . 하나는 개별 w에서 수집 된 배지 샘플에 ELISA를 수행 할 수 있습니다이 HCS의 확장으로ELL을 정량적으로 신경 영양 인자의 분비를 결정합니다. 다른 MSC 아형 조정 배지에서 분비 된 인자도 11,23의 생물학적 활성을 측정하기 위해 시험 관내 생물학적 정량에 사용될 수있다. HCS 플랫폼이 유형의 일차 배양 신경과 신경 줄기 세포주 (24)로부터의 신경 돌기의 시험 관내 측정을 위해 사용될 수있다. 전반적으로, 우리의 결과는 유 전적으로 변형 된 중간 엽 줄기 세포의 하위 집단은 비 개질 된 중간 엽 줄기 세포에 비하여 유사한 동작을 표시하는 것이 보였다. 세포 성장 및 세포 이동에 대한 다양한 배양 기판의 영향은 극적 MSC 서브 타입간에 차이뿐만 아니라, 배양 기재하지 않았다. 이와 같이, 테스트 외 매트릭스 기판이 상이한 엔지니어링 된 중간 엽 줄기 세포에 대한 이들의 행동 양상을 조절하는 중요한 역할을하는 것으로 나타나지 않았다. 이 연구는 differen 분석 HCS 시스템의 사용을 보여세포 행동의 양상 t. 그러나, 이미지 분석과 관련된 한계가 발생하는 것은 드문 일이 아니다. 형광 이미지를 분석하면서 경우에 따라, 그것은 immunolabeled 또는 염색 된 세포가 아니라 적극적으로 염색 / 표지 카운트 될 것이다 위에 올바른 임계 값을 결정하기 위해 다소 어려웠다. 따라서, 주관적 바이어스를 최소화하기 위해, 임계 값의 결정은 제어와 비교 (형광 이미징에 대한 음성 대조군은 일차 또는 이차 항체의 생략에 의해 모든 처리 중에 병렬로 수행 하였다)에 의존했다. 또 다른 제한은 저속도 디지털 이미징을 사용하여 세포 이동의 분석 중에 발생했습니다. 어떤 경우에는, 이미지 소프트웨어 실제로 오직 매우 짧은 거리를 이주 세포 대 세포의 임의의 브라운 운동 사이를 구별 할 수 없었다. 분석 소프트웨어는 multip의 존재를 구별 할 수 없었다 여기서 추가적인 제한 상황에서 분명했다한 다른 매우 근접 르 셀. 분석보다는 완전 자동 분석시 이러한 제한 필요한 수동 셀 선택을 극복. 셀 도금 밀도는 서로 분리되어 성장하는 세포에 비해 대단히 짧은 시간에 성장하는 큰 선호를 표시하는 세포의 집단 사이에 세포의 이동 데이터를 기울이 발생할 수 있습니다. 이러한 타입의 차이는 일부 가능성 세포 - 세포 대 세포 - 기본 기판의 반사에있다. 이미지를 수집 및 데이터 분석을 수행 할 HCS 시스템을 사용하면 효율적이고 신속한 수단은 복수의 셀 파라미터를 평가하기 위해 제공한다. 또한, 30 가지 조건 (6 기판과 5 가지 MSC 하위 유형)에 대한 시간 경과 디지털 비디오 정기적으로 환경 챔버를 사용하는 동안 시간에서 일 (48 시간)에 이르는 기간 동안 획득했다. 이 데이터는이어서 다른 ECM 다양한 세포주에 걸쳐 세포의 이동 속도의 차이를 계산하고 결정하는 데 사용되었다분자. 이 보고서에서 우리는 세포의 건강과 기능을 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 플랫폼의 구현을 강조했다. 이러한 유형의 분석 직접 세포 성장 및 신경 재생을 촉진하는 세포 유형뿐만 아니라, 폴리머 기판을 설계하기위한 합리적인 전략을 개발하는데 유용하다. 이는 세포 이식 전략을 사용하여 생체 내에서의 전임상 연구 전에 광범위한 치료 학적 요인 줄기 세포 기반 배출인가 향해 필수적인 단계이다.

신경계 장애의 치료에 유용한 요법을 구현하는 더 큰 문제는 변성을 방지하고 또한 기능의 회복을 촉진 효과적인 방법을 개발하는 것이다. 혁신적인 전략은 이식 전에 그들의 신경 보호 인자의 생산을위한 유전자 엔지니어 줄기 세포 체외이다. 유전자 치료의 형태로 결합 된 세포 기반 치료의 조합은, 신경계 질환 또는 손상 유발 신경 사망의 치료를위한 강력한 방법을 제공한다. 신경 영양 요소는 성숙한 신경 세포의 성장과 개발 뉴런의 생존뿐만​​ 아니라 유지 보수 및 소성에 필수적이다. 다수의 연구는 중추 및 말초 신경계에서 신경 (CNS 및 PNS)의 초기 성장과 분화를 촉진하는 신경 영양 인자의 중요한 역할을 입증하고 또한 관내 및에서 재생을 자극 할 수있다신경 손상 1 nimal 모델. 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF)는 매우 CNS 표현과 신경 개발, 시냅스 가소성 및 수리 (2)를 조절하는 중요한 역할을 담당한다. 폐해 세포주 유래 신경 영양 인자 (GDNF)는 도파민과 motorneurons 3를 포함하여 신경 세포의 많은 유형의 생존을 촉진한다. 따라서, 신경 수리 중요한 전략은 신경계의 부상이나 질병 영역에 신경성 외인성 소스를 제공하는 것이다. 능성 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)가 손상되거나 병에 걸린 신경을 치료하는 치료 용 단백질의 전달을 위해 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그들은, 2) 다 분화능 용량, 3) 거의 윤리적 문제, (4) 분리 및 유지 1) 비교적 용이 포함한 다수의 이점을 갖기 때문에 엽 줄기 세포의 이식 환자 호환 세포 - 기반 치료법​​을 개발하기위한 노력으로 상당한 주목을 받고) 생존 및자가 이식 4,5에 대한 이식 및 5) 가능성을 다음 마이그레이션 할 수있는 능력을. 유망한 결과는 척수 손상 6,7, 8,9 뇌졸중, 미엘린 결핍 10, 망막 변성증을 포함한 다양한 신경 퇴행성 11-13 조건의 수에 대한 동물 모델에서의 나이브 및 유 전적으로 조작 된 중간 엽 줄기 세포의 사용과보고되었다. 유전자 조작 된 줄기 세포에서 신경 영양성 인자의 전달과 세포 이식을 연결하는 것은 신규하고 중요한 신경 복구 전략이다. 세포 기반 치료 인자 전달 시스템의 개발에 필수적인 단계는 설계 세포의 정상 상태를 결정하는 것이다. 따라서, 본 연구의 주 목적은 유전 공학 성체 줄기 세포의 일반적인 성장 파라미터를 평가하는 것이었다. 빠르게 여러 세포 매개 변수를 평가하는 중요한 방법은 셀룰러 이미지 기반 높은 스루 screenin을 사용하는 것이다g (HTS)을, 종종 높은 콘텐츠 스크리닝 (HCS) 절차 (14)라고합니다. 이 기술은 자동화 된 이미지 획득 및 분석이 가능하고,이 방법은 줄기 세포 연구 어플리케이션에 특히 적합하다. 이 프로젝트에서 우리는 유전자 조작 성체 줄기 세포는 HCS 시스템을 채용와 세포 기질 환경 설정 및 세포 기능의 빠른 특성 및 최적화를 가능하게하는 프로파일 플랫폼을 개발했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam (Cambridge, MA)</td>
			<td>Ab16667</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>C7661</td>
			<td>Collagen from rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td>
			<td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td>
			<td>08-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chemistry Store (Ames, IA)</td>
			<td>12003510</td>
			<td>100%, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P285</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P288</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine (mouse)</td>
			<td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td>
			<td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td>
			<td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>O4042</td>
			<td>4% PFA in 0.1M PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (EDTA 1X)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>12440&#8211;046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma-qualified FBS</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>ImageXpress micro</td>
			<td>High content screening system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

MSC 성장 파라미터는 다른 기판 상에 중간 엽 줄기 세포의 개체군을 배양함으로써 조사 하였다. MSC 아형 (MSC들, GFP-엽 줄기, BDNF-GFP-MSC들, GDNF-GFP-MSC들, 및​​ BDNF / GDNF-GFP-엽 줄기 세포)의 다섯 가지 인구 96- 웰 조직 배양 플레이트 상이한 사전 도포에 도말 도 1에 도시 된 바와 같이 기판. 배양 나흘 후, 플레이트를 고정 immunolabeled 및 / 또는 적합한 시약으로 염색 한 다음 HCS 시스템을 이용하여 검사 및 이미지 획득 및 분석 소프트웨어 프로그램으로 분석을 수행 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> 도 1 :. 템플릿에 나타낸 바와 같이 실험 설계 96 웰 플레이트 템플릿 96- 웰 플레이트 웰 및 다양한 기재로 코팅은 엔지니어링 된 줄기 세포로 시딩 하였다. 예로서, 단지 WEL행의 BF의 LS는이 실험에 사용 하였다. 행 A, G와 H는 비어 있었다. 약어 - 중간 엽 줄기 세포 : 중간 엽 줄기 세포; GFP - 중간 엽 줄기 세포 : 녹색 형광 단백질을 발현하는 중간 엽 줄기 세포; BDNF-GFP - 중간 엽 줄기 세포 : 뇌는 신경 영양 인자-GFP를 발현하는 중간 엽 줄기 세포 유래; GDNF-GFP - 중간 엽 줄기 세포; 폐해 신경 영양 인자-GFP를 발현하는 중간 엽 줄기 세포를 세포 유래; BDNF / GDNF-GFP - 중간 엽 줄기 세포; BDNF와 GDNF- GFP를 발현하는 중간 엽 줄기 세포; ECL : Entactin 콜라겐 IV-라미닌). DAPI의 대조 염색 하였다 안티 Ki67의 immunolabeling은 상이한 기판 설계가 중간 엽 줄기 세포 (도 2a)의 개체군의 증식에 영향 여부를 평가하기 위해 사용되었다. Ki67 항원의 발현은 세포주기의 G 1, S, G이 늦게 M 단계에서 우선적으로 발생하고, 휴식 단계에서 세포 (G 0)에서 검출되지 않으며 증식 15 세포 마커로서 유용한 . 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)는 일반적으로 사용되는 것이다 뉴DNA (16)의 영역 AT 바인딩에 파란색 형광을 방출 명확하고 염색체 Counterstain과. 필드 세포의 총 수는 DAPI 염색 핵의 수를 카운트함으로써 결정될 수있다. 도 2b에 도시 된 바와 같이 편차가 중간 엽 줄기 세포의 증식 백분율 있었지만, 모든 기판들은 그럼에도 MSC 아형마다 상당한 세포 증식을 지원. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> 그림 2 : Ki67 세포 증식 분석. (A) 합병, Ki67의 immunolabeling (빨간색)와 DAPI (파란색) 핵 염색의 이중 형광 이미지. 중간 엽 줄기 세포의 대부분은 Ki67 항체 (적색)와 immunolabeled했다. 스케일 바 = 50 μm의. 폴리스티렌 (PS)에 성장 MSC 하위 유형 immunolabeled Ki67의 비율, 폴리 -L- 라이신 (PLL)를 나타내는 (B) 막대 그래프, 피브로넥틴, 콜라겐시험 관내 (DIV) 5 일 동안 I, 라미닌, 또는 entactin - 콜라겐 IV-라미닌 (ECL) 기판을 입력합니다. N은 하나의 실험을 =. 각 막대는 각각의 조건이 우물에서 8 군데 사이트에서 풀링의 평균 데이터를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 요오드화 프로피 듐 (PI) 염색 상이한 기판이 세포 생존 (도 3)에 영향 여부를 평가하기 위해 사용되었다. 요오드화 프로피 듐은 일반적으로 사용되는 빨간색 형광 핵 염색체 Counterstain과입니다. 요오드화 프로피 듐은 막 impermeant이며, 일반적으로 가능한 세포에서 제외하고, 따라서 인구의 죽은 세포를 감지하는 데 유용합니다. 필드 내의 모든 셀을 식별하기 위해 예컨대 DAPI와 같은 일반적인 핵 라벨와 결합 될 때 주어진 조건 내에서 죽은 세포들의 비율을 결정할 수있다. PI 양성 세포의 비율을 검사 모든 기판에 낮은 (그림 3). PI 시약에 대한 양성 대조군으로, 중간 엽 줄기 세포를 함유하는 몇 웰, 70 % 에탄올에서도 3b 및 3c에 도시 된 바와 같이, PI 표지 된 세포의 비율이 높은 결과, 대부분의 세포를 죽이는 것으로 알려진 상태를 배양 하였다 (에탄올 양의 치료 제어). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> 그림 3 : 프로피 디움 요오드 세포 사멸 분석. (A) 합병, 요오드화 프로피 듐 (빨간색)와 DAPI (파란색) 염색 이중 형광 이미지. 생존 세포의 모든 핵 DAPI (블루) 염색을했지만, 어떤 요오드화 프로피 듐 염색 엽 줄기 세포. (B) 거의 모든 중간 엽 줄기 세포를 70 % 에탄올에 노출 된 후 요오드화 프로피 듐 염색 하였다에서 검출되지 않았다. A의 스케일 바, B = 100 ㎛. 요오드화 프로피 듐 (PI)의 비율을 나타내는 (C) 막대 그래프는 스테인드 MSC 하위 유형폴리스티렌 (PS), 폴리 -L- 라이신 (PLL), 피브로넥틴, 시험 관내 (DIV)에서 5 일간 I 형 콜라겐, 라미닌 또는 entactin-IV 콜라겐 - 라미닌 (ECL)의 기판 상에 성장 s는. 에탄올 컨트롤 :이 조건은 PI 염색 시약에 대한 양성 대조군으로. PI 얼룩 다음 에탄올 처리 한 대부분의 세포는 죽은 따라서 긍정적 인 PI 시약 스테인드 있습니다. N은 하나의 실험을 =. 각 막대는 각각의 조건이 우물에서 8 군데 사이트에서 풀링의 평균 데이터를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> , 세포 이동이 경과 디지털 현미경 HCS 시스템 투과광 / 환경 챔버 시스템을 사용하여 분석 하였다 설계 엽 줄기 세포의 거동에 상이한 기판의 가능한 영향을 조사하기 위해 (기업 비디오 1 참조). 여러 사이트 / 잘 시간이 경과 군데 있었다및 이미지 획득 및 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 서로 다른 기판 상에 성장하는 중간 엽 줄기 세포의 다른 부분 집단에 대한 세포의 이동 속도를 계산하는 데 사용된다. 도 4c에 도시 된 바와 같이, 일반적으로, 중간 엽 줄기 세포의 모든 하위 세포 외 기질은 코팅면 (피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌 및 ECL) 및 비 - 코팅 폴리스티렌 표면 상에 느린 빠른 이동 속도를 확인할 수있다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> 그림 4 :. 셀 추적 및 마이그레이션 중간 엽 줄기 세포는 이미지 수집 및 분석 소프트웨어를 추적. 29 시간 후 시간 경과 촬상 세션의 끝에서 저속 이미징 및 (B)의 (A) 개시로부터의 투과광 및 형광 이미지의 이미지는 오버레이 (보조 비디오 1 참조). 셀 마이그레이션 트랙이 색깔의 리튬으로 표시됩니다NES. 스케일 바 :. 50㎛의 (C) 막대 그래프의 평균 이동 속도를 (μm의 / 시간으로 표현 된) MSC 아형 용 폴리스티렌 (PS) 상에 성장, 폴리 -L- 라이신 (PLL), 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, 라미닌, 시험 관내 (DIV) 2 일 동안 또는 entactin - 콜라겐 IV-라미닌 (ECL) 기판. N은 하나의 실험을 =. 각 막대는 각각의 조건이 우물에서 적어도 10 군데 세포의 평균을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 함께 찍은, 이러한 결과는 유전자 조작 된 중간 엽 줄기 세포의 이러한 소집단 비슷한 성장 속성을 표시하는 것이 예비 증거를 제공합니다. 이러한 결과는 렌티 바이러스 스크리닝이 플랫폼을 사용하여 조사 성장 파라미터에 대해서는 극적인 검출 해로운 효과를 유발하지 이들 엽 줄기 세포의 유전 적 변형을 매개한다는 강력한 증거를 제공한다. 기업 비디오 1. 저속 디지털 비디오. 마이그레이션 경로가 두 엽 줄기 세포에 대한이야 [1 (녹색 추적 선)과 2 (블루 추적 선)로 표시] 도시되어있다. 비디오는 29 시간 기간 동안 캡처. 이미지는 매 5 분을 붙 잡았다. GFP 발현 엽 줄기 세포의 형광 이미지는 동영상을 준비 경과 촬상을 위해 사용되었다. 교정 바는 50 μm의 =. 이러한 유형의 분석 세포 이동 및 세포 분열을 포함하여, 세포의 행동을 연구하는데 유용하다.

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High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

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비디오: High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

연구

의학

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

두개골 방사선 치료에 의한인지 기능 장애의 회복을위한 세포 이식 전략을 줄기

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

원격 높은 처리량 Phenotyping에 마우스 눈 핵의 제거

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

급성 이식 - 대 - 호스트 질병의 생체의 유효성을 검사에 대한 높은 처리량 순차적 엘리사

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...