눈물샘 오가노이드를 사용하면 특정 유전자가 눈물샘 항상성을 어떻게 조절하는지 조사할 수 있습니다. 또한 오가노이드는 재생 의학에 사용할 수 있습니다. 성체 줄기 세포 유래 눈물샘 오가노이드 기술의 주요 장점은 건강하고 변형되지 않은 눈물샘 상피 세포의 성장과 연구를 가능하게 한다는 것입니다.
이 오가노이드는 결국 안구건조증 환자를 치료하는 데 사용될 수 있습니다. 실험에 필요한 배지와 재료를 준비한 다음 실험 전에 소화 배지의 모든 구성 요소를 결합합니다. 티슈 조각이 메스에 달라붙지 않도록 이 매체에 메스를 미리 적십니다.
배지에서 마우스 눈물샘 조직을 꺼내 페트리 접시에 넣고 미리 적신 메스를 사용하여 다집니다. 티슈 조각이 0.5 입방 밀리미터 미만이되면 메스로 페트리 접시에서 긁어 내고 소화 매체가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 아주 작은 인간 생검의 경우, 다지지 않고 소화 배지에 직접 넣으십시오.
조직 조각이 있는 15밀리리터 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 최대 15분 동안 배양합니다. 그 동안 파스퇴르 피펫 팁을 화염에 좁히고 기본 배지에 미리 적십니다. 해리 과정을 용이하게 하기 위해 미리 적시고 좁아진 파스퇴르 피펫으로 다진 혼합물을 5분마다 위아래로 피펫팅합니다.
현미경으로 많은 단일 세포와 작은 덩어리가 보이면 기본 배지 10ml를 추가하여 해리를 중지합니다. 400g에서 5분 동안 회전시킨 후, 상청액을 제거하고, 펠릿을 10 밀리리터의 기본 배지에 재현탁하여 세척을 반복하고 세포를 펠릿 아래로 내린다. 다진 혼합물을 70마이크로미터 여과기로 여과하여 소화되지 않은 큰 조직 조각과 남아 있는 콜라겐 섬유를 제거합니다.
용리액을 400g에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 제거한 후, 기포를 생성하지 않고 단일 마우스 눈물샘의 경우 100 마이크로 리터의 차가운 세포 외 기질 (ECM)과 인간 생검의 경우 50 마이크로 리터의 차가운 ECM에 세포 펠릿을 재현탁합니다. P200을 사용하여 12-웰 현탁액 플레이트의 웰 당 최대 100 마이크로리터의 세포를 시딩하여 웰 내에 약 20 마이크로리터의 액적을 만든다.
ECM이 응고될 수 있도록 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 20-30분 동안 플레이트를 거꾸로 놓습니다. ECM이 고형화되면, 12-웰 플레이트의 웰 당 약 1 밀리리터의 실온 마우스 팽창 배지를 첨가한다. 눈물샘 오가노이드에 의한 분비를 유도하는 개별 성분을 함유하는 인간 분화 배지 1밀리리터를 새로 준비한다.
자동 명시야 타임랩스 현미경에서 플레이트에서 이미지화할 위치, 5분의 시간 간격 및 4시간의 지속 시간을 설정합니다. 각 위치에서 전체 ECM 방울이 보이는지 확인합니다. 이미징을 시작하기 전에 현미경에서 플레이트를 이동하지 않고 이미징할 웰에서 배양 배지를 제거하고 포스콜린 및 노르아드레날린을 포함한 화합물을 함유한 새로 준비되고 잘 재현탁된 인간 분화 배지로 교체합니다.
음성 대조군으로, 분화 배지를 새로 고친 웰을 포함하십시오. 현미경의 실행 버튼을 클릭하고 4시간 후에 결과를 분석합니다. 본문에 언급된 대로 오가노이드를 해리한 후 상층액을 버립니다.
80 마이크로리터의 전기천공 완충액에 세포를 재현탁합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 실험에 필요한 플라스미드를 준비합니다. 플라스미드를 세포에 넣고 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.
포링 펄스 및 전송 펄스에 대한 매개변수로 전기포레이터를 설정합니다. 플라스미드가 있는 세포를 전기천공 큐벳에 넣습니다. 0.3암페어에서 0.55암페어 사이여야 하는 저항을 즉시 측정하고 즉시 전기천공합니다.
완료되면 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 Rho-kinase 억제제가 보충 된 400 마이크로 리터의 전기 천공 완충액을 추가합니다. 세포를 실온에서 30분 동안 회복시킵니다. 다음으로, 세포를 500g에서 5분 동안 펠렛화한다.
상청액을 버린 후, 세포를 200 마이크로리터의 ECM에 플레이트한다. 응고 후 마우스 확장 매체를 추가합니다. 오가노이드 제제의 경우, 이식일 약 3일 전에 인간 눈물샘 오가노이드를 분할합니다.
ECM에서 오가노이드를 추출하려면 배양 배지에 디파아제를 첨가하여 밀리리터당 0.125단위의 최종 농도에 도달하고 P1000을 사용하여 ECM 방울을 완전히 재현탁하여 파쇄합니다. 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 30분 동안 다시 넣습니다. 오가노이드를 10밀리리터의 기본 배지에 재현탁하여 효소를 씻어냅니다.
400g에서 5분 동안 세포를 펠릿화한 후 5% ECM이 보충된 50마이크로리터의 차가운 인간 팽창 배지에 재현탁합니다. 오가노이드 현탁액을 얼음 위에 놓고 즉시 이식을 진행합니다. 생쥐의 동소 이식을 위해 인슐린 바늘로 오가노이드 현탁액을 흡인합니다.
마우스가 잠 들어있을 때, 주요 눈물샘에 접근 할 수 있도록 마우스를 옆으로 빠르게 눕히십시오. 5마이크로리터의 오가노이드 현탁액을 피부를 통해 눈물샘에 직접 주입합니다. 마우스가 회복될 수 있도록 하고 매일, 특히 눈에 이식 관련 불편함이 있는지 평가합니다.
쥐의 눈물샘을 해부한 후, 효소 및 기계적 소화는 acini와 ducts를 포함한 작은 조직 조각을 생성했습니다. 성공적인 마우스 눈물샘 오가노이드 유도에서, 약 500 마이크로미터 직경의 낭성 오가노이드가 7일 후에 발견되었다. 인간 눈물샘 오가노이드는 3-4일 이내에 낭종으로 성장했으며 조직 분리 후 10-14일 이내에 완전히 자란 크기에 도달했습니다.
분화 배지에서 각각 5일 및 7일 후, 마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드의 밀도가 높아졌다. 순환 AMP 활성제인 포스콜린 또는 신경전달물질인 노르에피네프린을 바르면 3시간 이내에 오가노이드 부종이 발생했습니다. 성공적인 전기천공법에서 하이그로마이신에 내성이 있는 오가노이드가 자랐습니다.
300마이크로미터 이상의 성장하는 오가노이드 클론은 분화 전에 선택되었습니다. 가이드 RNA에 의해 표적화된 Pax6 유전자좌의 PCR 증폭은 선택된 모든 클론에 대해 367개의 염기쌍 밴드를 생성했습니다. 6개의 염기서열 중 하나의 동형접합 녹아웃 마우스 눈물샘 클론을 Pax6를 표적으로 하는 가이드 RNA를 사용하여 얻었습니다.
일부 클론은 잘 자랐지만 일부 오가노이드 클론은 채취 후 손실되거나 분화되기 시작했습니다. 선별된 10개의 오가노이드 클론 중 7개가 잘 자랐습니다. 오가노이드 생착은 마우스 눈물샘에 오가노이드를 주입한 지 1개월 후에 인간 특이적 마커인 인간 뉴클레오라 항원에 대한 염색을 통해 확인하였다.
주의해야 할 한 가지는 조직이나 오가노이드를 과도하게 소화하지 않는 것입니다. 그렇지 않으면 세포가 죽을 수 있으며 이는 오가노이드 확립 속도를 감소시킵니다. 눈물샘 오가노이드는 조직학에 의해 분석될 수 있다.
그렇게 함으로써 세포 구성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
