이 연구는 National Science Foundation(IOS-2217757)(XQ)과 University of Arkansas for Medical Sciences(UAMS) Bronson Foundation Award(H.Z.)의 지원을 받았습니다.

1. 용액 준비
<ol><li>표백제 15mL와 증류수 35mL 및 Triton X-100 50μL를 혼합하여 종자 살균 용액을 준비합니다.</li>
	<li>BFA 분말을 에탄올에 용해시켜 브레펠딘 A(BFA) 용액을 최종 농도 10 mM(스톡)으로 제조한다. Wm 분말을 DMSO에 용해시켜 최종 농도 10 mM(stock)이 되도록 맥아즙만닌(Wm) 용액을 제조한다.</li>
</ol>2. 씨앗 파종
<ol><li>필요한 형질전환 식물 각각에서 10-50개의 종자를 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 분취합니다. 각 튜브에 종자 멸균 용액 1mL를 넣고 셰이커에서 10분 동안 튜브를 부드럽게 뒤집어 완전히 혼합합니다.</li>
	<li>종자 살균 용액을 버리고 1mL의 오토클레이브 증류수로 종자를 5회 세척합니다.</li>
	<li>오토클레이브 증류수 300μL를 각 튜브에 넣고 1%(w/v) 자당과 0.75%(w/v) 한천을 포함하는 절반 강도 MS 배지에 종자를 뿌립니다. 필요에 따라 해당 항생제로 배지를 보충하십시오.</li>
	<li>플레이트를 4°C의 어두운 곳에서 2일 동안 거꾸로 보관하여 발아를 동기화합니다.</li>
	<li>2일 후, 플레이트를 22°C에서 16시간 라이트/8시간 다크 사이클(80μmol/m2/s1)로 성장실로 옮깁니다. 이것은 발아 후 첫날 (1 dpg)로 간주됩니다.</li>
	<li>추가 성장을 위해 묘목을 10dpg의 토양에 이식하십시오.</li>
</ol>3. 이중 착색 F1 형질전환 식물의 제조
<ol><li>ERL1-YFP(식물 A)를 포함하는 동형접합 형질전환 식물과 RFP 표지 마커 단백질 RFP-Ara7(식물 B)20을 포함하는 동형접합 형질전환 식물을 16시간 조명/8시간 암주기(80μmol/m2/s1)로 성장실에서 개화할 때까지 나란히 성장시킵니다.</li>
	<li>식물 A에서 어린 꽃차례를 선택하십시오. 유전 적 십자가를 위해 꽃차례에 막 열려는 꽃 한 송이를 유지하십시오. 오래된 꽃과 실리크를 모두 제거하십시오. 또한 미래의 혼란을 피하기 위해 어린 꽃과 꽃 분열 조직을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>한 쌍의 날카로운 핀셋을 사용하여 꽃받침, 꽃잎, 수술을 제거하여 개봉하지 않은 꽃을 부드럽게 해부합니다. 꽃차례에 암술을 남겨 두십시오.</li>
	<li>식물 B의 열린 꽃에서 성숙한 수술을 취하고 식물 A의 해부 된 암술의 암술머리에 꽃가루 알갱이를 놓습니다.</li>
	<li>이 수동으로 교차 된 꽃은 아버지, 어머니 및 유전 적 십자가의 날짜를 표시하여 레이블을 지정합니다. 꽃을 성숙시키고 실리크가 노란색 / 갈색으로 변할 때 F1 씨앗을 수확합니다 (십자가 후 ~ 20 일). YFP 및 RFP 신호가 모두 있는 성공적인 F1 플랜트를 확인합니다.</li>
</ol>4. 약리학 적 치료
<ol><li>BFA 처리를 위해 7 일 된 묘목의 자엽을 제거하고 나머지 묘목을 모의 용액 (0.3 % 에탄올) 또는 30 μM BFA 용액에 담그고 1 분 동안 진공을 적용하고 샘플을 30 분 동안 담근 상태로 유지합니다.</li>
	<li>맥아즙 처리를 위해 7 일 된 묘목의 자엽을 제거하고 나머지 묘목을 0.25 % DMSO 용액 또는 25 mM 맥아 즙 만닌에 담그고 1 분 동안 진공을 적용하고 이미징하기 전에 샘플을 30 분 동안 담근 상태로 유지합니다.</li>
	<li>샘플의 진공 처리를 위해 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 해당 약물 용액 500μL를 넣고 해부된 묘목을 용액에 담그십시오. 10mL 주사기를 미세 원심분리기 튜브에 단단히 부착하고 1분 동안 진공을 적용합니다(그림 1). 주사기를 제거하고 필요한 시간 동안 용액에 샘플을 보관하십시오. 이미징 준비를 위해 묘목을 부드럽게 꺼냅니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig01.jpg"> 그림 1: 간단한 진공 장치. 진공 처리를 위해 10mL 주사기를 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 부착합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
5. 이미징을 위한 샘플 준비
<ol><li>날카로운 면도날을 사용하여 처리 된 샘플에서 실제 잎을 해부하십시오. 유리 슬라이드의 물 한 방울에 진정한 잎을 부드럽게 넣고 축 방향면을 위로 유지하십시오. 거품이 끼지 않도록 덮개 슬립으로 실제 잎을 천천히 덮으십시오.</li>
</ol>6. 컨포칼 이미징
참고: 라이카 SP8 도립 주사 컨포칼 현미경을 사용하여 이 작업에서 샘플의 형광 신호를 이미지화했습니다.
<ol><li>빔 경로 설정<ol><li>YFP 여기를 위한 514nm 레이저를 선택합니다. 높은 레이저 출력을 사용하여 신호 강도를 높여 높은 이미지 품질을 얻을 수 있습니다. 그러나 5% 이상의 레이저 출력은 광표백의 위험이 있으며 샘플의 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 샘플 신호가 너무 어둡지 않으면 낮은 레이저 강도에서 시작합니다.</li>
		<li>검출을 위해 PMT/HyD를 켜고 YFP 형광단의 스펙트럼을 기반으로 방출 대역 상한 및 하한 임계값을 정의합니다. YFP 신호를 수집하기 위해 530-570nm의 감지 창을 설정합니다.</li>
		<li>두 번째 색상에 대한 순차 이미징: Seq 버튼을 클릭하고 새 채널을 추가합니다. 기본적으로 이전에 설계된 YFP 빔 경로는 Seq 1입니다. Seq 2에서 RFP 여기용 561nm 레이저를 선택하고 RFP 신호를 수집하기 위해 570-630nm의 검출 창을 설정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스캔 조건 설정(그림 2)<ol><li>기공 전구체 세포 내의 세포내 막 트래픽 활동을 이미지화하려면 이미징을 위해 시스템에서 63x/1.2W Corr 렌즈를 선택하십시오.</li>
		<li>형식은 픽셀 단위의 이미지 크기를 나타냅니다. 1,024 픽셀 x 1,024 픽셀로 시작한 다음 확대/축소 비율과 목표 설정을 기반으로 최적화하여 게시 품질의 좋은 해상도를 제공합니다.</li>
		<li>속도는 레이저가 각 픽셀을 통과할 때 스캔헤드의 속도를 나타냅니다. 스캔 속도가 느리면 신호 대 잡음비가 향상되는 경우가 많지만 빠르게 변화하는 멤브레인 트래피킹 이벤트를 효율적으로 캡처하지 못할 수 있습니다. 400Hz의 속도로 시작하여 샘플의 특정 상황에 따라 이를 최적화합니다.</li>
		<li>확대/축소 비율은 대물 렌즈를 변경하지 않고 관심 영역을 확대하는 데 사용됩니다. 확대/축소 계수 1로 시작하고 실험의 특정 요구 사항에 따라 최적화합니다.</li>
		<li> 라인 평균은 평균 결과를 얻기 위해 각 X-라인을 스캔하는 횟수를 나타냅니다. 라인 평균이 클수록 결과 이미지의 노이즈가 줄어들지만 스캔 시간과 레이저 광에 대한 노출 시간도 늘어납니다. 멤브레인 트래피킹 이벤트를 이미지화하려면 높은 라인 평균을 사용하지 마십시오. 2x 라인 평균으로 시작하여 필요에 따라 최적화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시계열 수집 참고: 막 트래피킹 사건을 연구할 때 세포내 엔도솜의 빠른 움직임을 기록하기 위해 시계열이 필요한 경우가 많습니다.<ol><li>획득 모드에서 xyt 스캔 모드를 선택하여 시계열 유틸리티를 활성화합니다.</li>
		<li>시간 간격에서 시점 사이의 대기 기간을 결정합니다. 또는 최소화를 클릭하여 이미지를 차례로 즉시 촬영합니다. 7초의 시간 간격이 다음 시계열 실험에 사용되었습니다.</li>
		<li>기간을 선택하고 실험을 실행할 총 시간을 입력합니다. 또는 Frames(프레임)를 선택하여 수집할 프레임 수를 정의합니다(그림 3).</li>
	</ol></li>
	<li>전체 세포 내의 멤브레인 트래피킹 이벤트에 대한 3차원 정보를 수집하려면 Z-스택 스캔 모드를 사용합니다. Z 스택 이미지의 최대 강도 투영은 종종 분석에 사용됩니다.<ol><li>획득 모드에서 xyz 스캔 모드를 선택하면 Z-Stack 유틸리티에 액세스할 수 있습니다.</li>
		<li>Z 와이드 옵션을 선택합니다. Scan Mode(스캔 모드)에서 Begin(시작) 및 End(종료) 버튼을 사용하여 Z 스택의 상단 이미지와 하단 이미지를 정의합니다.</li>
		<li>z-스텝 크기를 클릭하여 z-스텝의 두께를 정의합니다. 또는 Z 스택의 전체 범위를 커버하기 위해 촬영할 이미지 수를 정의합니다. 샘플 간의 일관성을 보장하려면 z-스텝 크기를 정의합니다(그림 4).</li>
	</ol></li>
	<li>이미지 처리<ol><li>z-스택 이미지의 최대 강도 투영은 컨포칼 소프트웨어(http://www.leica-microsystems.com)에 의해 생성됩니다. 기본 프로세스(Primary Process) 탭에서 맨 왼쪽의 프로젝트 열기(Open Projects) 탭 아래에서 관심 있는 z-stack 파일을 먼저 선택합니다. 그런 다음 Process Tools라는 중간 탭으로 전환하고 투영 기능을 선택한 다음 방법 드롭다운 패널에서 최대를 선택하고 적용 버튼을 클릭합니다. z-stack 프로젝션 이미지는 Open Projects 탭 아래에 생성됩니다.</li>
		<li>시계열 영상의 영상은 피지(https://imagej.net/Fiji)에 의해 생성된다. 파일 탭에서 열기 함수를 사용하여 모든 시계열 이미지를 올바른 순서로 엽니다. [Image ] 탭에서 [ Stack ] 함수를 찾고 [Images to stack ]을 선택하여 비디오를 생성합니다. 원하는 프레임 속도( 비디오 1의 경우 5프레임/초)로 .avi 형식으로 파일을 저장합니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig02.jpg"> 그림 2: XY 치수의 스캔 모드 패널 스캔 모드 패널은 이미지 스캔 조건을 설정하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig03.jpg"> 그림 3: xyt 스캔 모드의 시계열 유틸리티. 시계열 유틸리티는 일련의 이미지를 연속적으로 수집하기 위한 이미징 조건을 설정하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig04.jpg"> 그림 4: xyz 스캔 모드의 z-stack 유틸리티 z-stack 유틸리티는 z축에서 일련의 이미지를 수집하기 위한 이미징 조건을 설정하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

컨포칼 이미징을 통한 ERL1 동역학의 시공간 조사

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulators+of+stomatal+lineage+signal+transduction+alter+membrane+contact+sites+and+reveal+specialization+among+ERECTA+kinases.">Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases.</a> Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).</li><li>Le, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+transport+and+activity+regulate+stomatal+patterning+and+development.">Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development.</a> Nature Communications. 5, 3090 (2014).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GNOM+ARF-GEF+mediates+endosomal+recycling,+auxin+transport,+and+auxin-dependent+plant+growth.">The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth.</a> Cell. 112 (2), 219-230 (2003).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+stomatal+differentiation+potential+by+EPF1+and+ERECTA-LIKE1+ligand-receptor+signaling.">Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling.</a> Elife. 6, 24102 (2017).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+super-resolution+imaging+techniques.">Label-free super-resolution imaging techniques.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy:+Present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), (2019).</li><li>Nwaneshiudu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+confocal+microscopy.">Introduction to confocal microscopy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

내막 시스템은 진핵 세포의 세포질을 서로 다른 구획으로 분리하여 이러한 세포 기관의 특수한 생물학적 기능을 가능하게 합니다. 화물 단백질과 거대분자를 적시에 최종 목적지로 전달하기 위해 수많은 소포가 이러한 세포 기관 사이를 왕복하도록 안내됩니다. 고도로 조절된 막 밀매 사건은 세포의 생존력, 발달 및 성장에 근본적인 역할을 합니다. 이 중요하고 복잡한 과정을 조절하는 메커니즘...

막 이동(Membrane traffic)은 단백질, 지질 및 기타 생물학적 산물을 포함한 막 구성 요소(화물이라고도 함)를 진핵 세포 내의 서로 다른 세포 기관 사이 또는 원형질막을 가로질러 세포외 공간으로 또는 세포외 공간으로 분배하는 보존된 세포 과정입니다1. 이 과정은 핵막, 소포체, 골지체, 액포/리소좀, 원형질막 및 다중 엔도솜으로 구성된 내막 시스템(endomembrane system)이라는 막과 세포 기관의 집합체에 의해 촉진된다1. 내막 시스템은 이러한 세포 기관 사이를 왕복하는 동적 소포를 사용하여 막 구성 요소의 수정, 포장 및 운송을 가능하게 합니다. 세포막 밀매 현상은 세포 발달, 성장 및 환경 적응에 매우 중요하므로 엄격하고 복잡한 규제를 받고 있습니다2. 현재, 분자 생물학, 화학 생물학, 현미경 및 질량 분석법의 여러 접근법이 개발되어 막 이동 분야에 적용되었으며 내막 시스템 3,4의 시공간 조절에 대한 이해를 크게 발전시켰습니다. 분자 생물학은 관심 단백질의 유전자 발현을 변경하거나 관심 단백질에 특정 태그를 표시하는 것과 같이 막 이동에 관여하는 것으로 추정되는 플레이어의 고전적인 유전자 조작에 사용됩니다. 화학 생물학의 도구에는 특정 경로의 교통을 구체적으로 방해하는 분자의 사용이 포함됩니다 4,5. 질량 분석법은 생화학적 접근법 3,4에 의해 기계적으로 분리된 세포 기관의 구성 요소를 식별하는 데 강력합니다. 그러나 막 교통은 역동적이고 다양하며 복잡한 생물학적 과정이다1. 다양한 조건에서 살아있는 세포의 막 이동 과정을 시각화하기 위해서는 광학 현미경이 필수적인 도구입니다. 사건의 효율성, 동역학 및 다양성을 측정하는 문제를 극복하기 위해 첨단 현미경 기술이 지속적으로 발전해 왔습니다4. 여기에서 이 연구는 화학/약리학 생물학, 분자 생물학 및 현미경 검사에서 널리 채택된 방법론에 중점을 두어 자연적으로 단순화되고 실험적으로 접근 가능한 시스템인 기공 발달 과정에서 막 이동 사건을 연구합니다.
기공은 내부 세포와 환경사이의 가스 교환을 촉진하기 위해 열리고 닫히는 식물 공중 표면의 미세 기공입니다 6,7,8. 따라서 기공은 식물의 생존과 성장에 중요한 두 가지 사건인 광합성과 증산에 필수적입니다. 기공 발달은 주변 환경에 대한 식물의 적응을 최적화하기 위해 환경 신호에 의해 동적으로 조정된다9. 2002년 연구로 거슬러 올라가면, 수용체 단백질인 TMM(Too Many Mouths)의 식별은 모델 식물인 Arabidopsis thaliana10에서 기공 발달의 분자 메커니즘을 조사하는 새로운 시대의 문을 열었습니다. 불과 수십 년 후, 고전적인 신호 전달 경로가 확인되었습니다. 상류에서 하류로, 이 경로는 표피 패턴 인자 (EFP) 패밀리의 분비 펩티드 리간드 그룹, EREECTA (ER) 패밀리의 여러 세포 표면 류신 풍부 반복 (LRR) 수용체 키나아제, LRR 수용체 단백질 TMM, MAPK 캐스케이드 및 SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA 및 SCREAM (SCRM)을 포함한 여러 bHLH 전사 인자를 포함합니다11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. 이전 연구는 수용체 키나아제 중 하나인 ER-LIKE 1(ERL1)이 EPF 인식 시 활성 세포내 행동을 나타낸다는 것을 나타냅니다 20. ERL2는 또한 원형질막과 일부 세포내 소기관 사이를 동적으로 이동한다27. 막 트래피킹 단계를 차단하는 것은 비정상적인 기공 패터닝을 일으켜 잎 표면에 기공 클러스터를 생성한다(28). 이러한 결과는 막 교통량이 기공 발달에 필수적인 역할을 한다는 것을 시사합니다. 이 연구는 일부 막 이동 억제제를 사용한 약리학적 치료와 결합된 단백질-단백질 세포 내 공동 국소화 분석을 사용하여 ERL1 역학을 시공간적으로 조사하는 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309695</td>
			<td>Vacuum samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A (BFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651</td>
			<td>membrane trafficking drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Lecia SP8 TCS with LAS-X software package</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-402</td>
			<td>Genetic cross</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS AF software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>http://www.leica-microsystems.com</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic seeds of ERL1-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic seeds of RFP-Ara7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin (Wm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td>membrane trafficking drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based methods to study membrane trafficking events in stomatal lineage cells

진핵 세포에서 단백질과 지질을 포함한 막 구성 요소는 내막 시스템 내에서 시공간적으로 목적지로 운반됩니다. 여기에는 새로 합성된 단백질을 세포 표면 또는 세포 외부로 분비 수송하는 것, 세포외 화물 또는 원형질막 성분을 세포로 세포내로 운반하는 것, 세포내 소기관 사이에서 화물을 재활용하거나 이동하는 것 등이 포함됩니다. 막 밀매 사건은 모든 진핵 세포의 발달, 성장 및 환경 적응에 매우 중요하므로 엄격한 규제를 받고 있습니다. 세포외 공간에서 리간드 신호를 감지하는 세포 표면 수용체 키나아제는 분비 및 세포내 수송을 모두 거칩니다. 원형질막-국소화된 류신-풍부한-반복 수용체 키나아제, ERL1을 사용하여 막 트래피킹 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 접근법이 여기에 기재되어 있다. 접근 방식에는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정이 포함됩니다. ERL1의 시공간 조절을 모니터링하기 위해 이 연구에서는 ERL1과 다소포체 마커 단백질인 RFP-Ara7 사이의 공동 국소화 분석, 이 두 단백질의 시계열 분석, 막 밀매 억제제 brefeldin A 및 wortmannin으로 처리된 ERL1-YFP의 z-스택 분석에 대해 설명합니다.

Membrane traffic is a conserved cellular process that distributes membrane components (also known as cargoes), including proteins, lipids, and other biological products, between different organelles within a eukaryotic cell or across the plasma membrane to and from the extracellular space1. This process is facilitated by a collection of membranes and organelles named the endomembrane system, which consists of the nuclear membrane, the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the vacuole/lysosomes, the plasma membrane, and multiple endosomes1. The endomembrane system enables the modification, packaging, and transport of membrane components using dynamic vesicles that shuttle between these organelles. Membrane trafficking events are crucial to cell development, growth, and environmental adaptation and, thus, are under stringent and complex regulation2. Currently, multiple approaches in molecular biology, chemical biology, microscopy, and mass spectrometry have been developed and applied to the field of membrane trafficking and have greatly advanced the understanding of the spatiotemporal regulation of the endomembrane system3,4. Molecular biology is used for classical genetic manipulations of the putative players involved in membrane trafficking, such as altering the gene expression of the protein of interest or labeling the protein of interest with certain tags. Tools in chemical biology include the usage of molecules that specifically interfere with the traffic of certain routes4,5. Mass spectrometry is powerful for identifying the components in an organelle that has been mechanically isolated by biochemical approaches3,4. However, membrane traffic is a dynamic, diverse, and complex biological process1. To visualize the membrane trafficking process in live cells under various conditions, light microscopy is an essential tool. Continuous progress has been made in advanced microscope techniques to overcome the challenges in measuring the efficiency, kinetics, and diversity of the events4. Here, this study focuses on the widely adopted methodologies in chemical/pharmacological biology, molecular biology, and microscopy to study membrane trafficking events in a naturally simplified and experimentally accessible system, the stomatal developmental process.
Stomata are micropores on plant aerial surfaces that open and close to facilitate gas exchange between the inner cells and the environment6,7,8. Hence, stomata are essential for photosynthesis and transpiration, two events that are crucial for plant survival and growth. Stomatal development is dynamically adjusted by environmental cues to optimize the plant&#39;s adaptation to the surroundings9. Dating back to studies in 2002, the identification of the receptor protein Too Many Mouths (TMM) opened the door to a new era of investigating the molecular mechanisms of stomatal development in the model plant Arabidopsis thaliana10. After just a few decades, a classical signaling pathway has been identified. From upstream to downstream, this pathway includes a group of secretory peptide ligands in the epidermal patterning factors (EFP) family, several cell-surface leucine-rich-repeat (LRR) receptor kinases in the EREECTA (ER) family, the LRR receptor protein TMM, a MAPK cascade, and several bHLH transcription factors including SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA, and SCREAM (SCRM)11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Previous work indicates that one of the receptor kinases, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstrates active subcellular behaviors upon EPF perception20. ERL2 also dynamically traffics between the plasma membrane and some intracellular organelles27. Blocking the membrane trafficking steps causes abnormal stomatal patterning, resulting in stomatal clusters on the leaf surface28. These results suggest that membrane traffic plays an essential role in stomatal development. This study describes a protocol to spatiotemporally investigate the ERL1 dynamics using protein-protein subcellular co-localization analysis combined with pharmacological treatment using some membrane trafficking inhibitors.

저자 스포트라이트: 기공 계통 세포에서 막 이동 이벤트를 연구하기 위한 이미지 기반 방법  

기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하기 위한 이미지 기반 방법

This technique studies the membrane trafficking events in stomatal development, the micropores on plant aerial surface, to facilitate photosynthesis and the transpiration. Various techniques are used to study plant stomatal development. This includes molecular biology, cell biology or microscopy, chemical biology, mass spectrometry, biochemistry, and structural biology.Individual stomata form asynchronously. Each stoma is formed by three transcend cell fate transitions. So collecting enough stomata lineage cells at a particular cell fate is one of the big challenges.Membrane trafficking is essential for cell survival and growth. Stomata lineage cell is no exception. This protocol addresses the commonly used approach to study membrane trafficking events in stomata lineage cells.Plants face challenging environment in the face of climate change. Stomata are passages for plant gas exchange, and are highly flexible to environmental stress for adaptation. We are interested in studying how abiotic stress affects the stomata development by focusing on the membrane trafficking of certain proteins in stomata lineage cells.

이전 연구에서는 ERL1이 동적 막 트래피킹 사건을 겪는 활성 수용체 키나아제임을 나타냈다20. ERL1은 원형질막의 막횡단 LRR-수용체 키나아제입니다. 소포체에서 새로 합성된 ERL1은 골지체에서 처리되어 원형질막으로 추가로 운반됩니다. 원형질막 상의 ERL1 분자는 그의 세포외 LRR 도메인18을 사용하여 EPF 리간드를 인지할 수 있다. EPF1을 포함한 억제성 EPF에 의해 ?...

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원형질막 수용체 키나아제의 막 이동 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 몇 가지 방법이 여기에 소개됩니다. 이 원고는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정을 포함한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

이 기술은 광합성과 증산을 촉진하기 위해 기공 발달, 식물 공중 표면의 미세 기공에서 막 이동 사건을 연구합니다. 식물 기공 발달을 연구하기 위해 다양한 기술이 사용됩니다. 여기에는 분자 생물학, 세포 생물학 또는 현미경, 화학 생물학, 질량 분석법, 생화학 및 구조 생물학이 포함됩니다.개별 기공은 비동기식으로 형성됩니다. 각 장(요)루는 세 번의 초월 세포 운명 전이에 의해 형성됩니다. 따라서 특정 세포 운명에서 충분한 기공 계통 세포를 수집하는 것이 큰 과제 중 하나입니다.막 트래피킹은 세포 생존과 성장에 필수적입니다. 기공 혈통 세포도 예외는 아닙니다. 이 프로토콜은 기공 계통 세포에서 막 밀매 사건을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 접근 방식을 다룹니다.식물은 기후 변화에 직면하여 도전적인 환경에 직면해 있습니다. 기공은 식물 가스 교환을 위한 통로이며 적응을 위한 환경 스트레스에 매우 유연합니다. 우리는 비생물적 스트레스가 기공 계통 세포에서 특정 단백질의 막 이동에 초점을 맞춰 기공 발달에 어떤 영향을 미치는지 연구하는 데 관심이 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

550 조회수.  Rutgers University. 이 기술은 광합성과 증산을 촉진하기 위해 기공 발달, 식물 공중 표면의 미세 기공에서 막 이동 사건을 연구합니다. 식물 기공 발달을 연구하기 위해 다양한 기술이 사용됩니다. 여기에는 분자 생물학, 세포 생물학 또는 현미경, 화학 생물학, 질량 분석법, 생화학 및 구조 생물학이 포함됩니다.개별 기공은 비동기식으로 형성됩니다. 각 장(요)루는 세 번의 초월 세포 운명...

비디오: 저자 스포트라이트: 기공 계통 세포에서 막 이동 이벤트를 연구하기 위한 이미지 기반 방법  

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

연구

생물학

﻿Preparation of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Preparation of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana  

To begin, grow homozygous transgenic Arabidopsis thaliana plants bearing ERL1-YFP and a red fluorescent protein, or RFP-labeled marker protein RFP ARA7 side-by-side in a growth room until flowering. On the young inflorescence of plant A, remove all the older flowers and calyx, except for one recently opened flower. Carefully remove the younger flowers and floral merostems.In the recently opened flower, remove the sepals, petals, and stamen using a pair of sharp tweezers, leaving only the pistil on the inflorescence. From plant B, take mature stamen from an opened flower and deposit the pollen grains into the stigma of the dissected pistil of plant A.Label this manually crossed flower, indicating its parents and the date of the genetic cross. When the calyx turns yellow or brown, harvest the F1 seeds to check for a successful F1 plant having yellow fluorescent protein, or YFP, and RFP signals.

이중 색상 F1 형질전환 애기장대 탈리아나의 제조

Pharmacological Analysis of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Pharmacological Analysis of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana   

To begin the pharmacological analysis of dual-colored F1 Arabidopsis thaliana, dissect and remove the cotyledons of seven-day old transgenic seedlings. Add 500 microliters of a 30-micromolar Brefeldin A, or BFA solution, in a 1.5-milliliter micro-centrifuge tube. Immerse the dissected seedlings in it.Tightly attach a 10-milliliter syringe to the micro-centrifuge tube and apply a vacuum for one minute. Remove the syringe before incubating the sample in the solution for 30 minutes before imaging. Next, immerse the dissected seven-day old seedling into 25-millimolar wortmannin.Apply the vacuum for one minute before incubating the immersed sample for 30 minutes. Examining ERL-1 trafficking routes in transgenic plants showed that 30 minutes of exposure to Brefeldin A solution resulted in ERL-1-YFP detection in large compartments known as BFA bodies. It indicated that Brefeldin A could block ERL-1 trafficking suggesting recycling or endocytosis of ERL-1.When transgenics were treated with wortmannin for 30 minutes, ring-like structures called WM bodies were highlighted by ERL-1-YFP. It showed that ERL-1-YFP were transported to multivesicular bodies indicating that ERL-1 followed the route to vacuoles for degradation.

이중 색상 F1 형질전환 Arabidopsis thaliana의 약리학적 분석

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana   

To begin the sample preparation, dissect the true leaf from the pharmacologically treated Arabidopsis thaliana transgenic sample using a sharp razor blade. Place the true leaf on a glass slide in a drop of water with the abaxial side up. Slowly cover the true leaf with a cover slip without air bubbles.For imaging, set up the beam path by selecting a 514-nanometer laser for yellow fluorescent protein, or YFP excitation. Obtain high image quality by using high laser power. Turn on PMT or HYD and define the upper and lower emission band thresholds based on the spectrum for the YFP fluorophore.Set a detection window of 530 to 570 nanometers to collect the YFP signal. for the sequential image of the second color, click on the seek button and add a new channel. In seek two, select a 555-nanometer laser for the red fluorescent protein, or RFP excitation, and set a detection window of 570 to 630 nanometers to collect the RFP signal.Select a 63X, 1.2W core lens on the system for imaging the subcellular membrane traffic activity within stomatal precursor cells. Start the format with an image size of 1024 by 1024 pixels, then optimize it based on the zoom factor and the objective settings for a good resolution. Next, set up the speed of the scan head, starting with a speed of 400 hertz, and optimize this based on the specific situation of the samples.To zoom on a region of interest without changing the objective lens, enter a zoom factor of one and optimize this based on the specific needs of the experiment. The line average refers to the number of times each X line will be scanned to obtain an average result. Start with a 2X line average For imaging the membrane trafficking events and optimize as needed.select the XYT scan mode in the acquisition mode to enable the time series utility. Next, select the waiting period between the time points under time interval. Define the number of frames to be collected by selecting frames.Use the Z-stack scan mode with the maximum intensity projection to collect the three-dimensional information regarding the membrane trafficking event within The entire cell. Then select the XYZ scan mode in acquisition mode and then the Z-stack utility will become accessible. Select the Z wide option.Under the scan mode, define the Z stack's top and bottom images using the begin and end buttons. Next, define the thickness of the Z step by clicking on the Z step size. To process the image, click on the primary process tab in Confocal software.Under the open projects tab on the far left side, select the interested Z-stack file. Then, in the middle tab named process tools, select the projection function. Choose maximum in the dropdown panel of method and click on the apply button.A Z-stack projection image will be generated under the open projects tab. To generate the video from the time series images, click the file tab in Fiji software and open function to open all the time series images one by one in the correct order. Alternatively, drag the images onto image J to open the data in the correct order.Then find the stack function in the image tab and choose images to stack to generate a video. Once done, save the file in the avi format with the desired frame rate. In the true leaf of seven-day-old transgenic plants bearing ERL1 promoter ERL1 YFP, scattered cells were highlighted by the YFP signal where ERL1 YFP labeled the plasma membrane.Multiple punctate signals were also observed, suggesting that ERL1 was also localized to the endosomes. RFP Ara7 highlighted multiple punctate signals in almost all the cells, indicating the multivesicular bodies, or MVBs, in these cells. When RFP Ara7 merged with the ERL1 YFP signal, most punctates overlapped, suggesting that some ERL1 YFP molecules were transported to the MVBs.Time series of true leaves bearing ERL1 YFP and MVB marker protein RFP Ara7 showed that YFP-labeled endosomes moved together with RFP Ara7 within the stomatal lineage cells. It confirmed that ERL1 YFP was localized to the multivesicular bodies.