이온 채널 TRPL GFP와 같은 GFP 태그 광수용체 단백질은 비침습적 기술을 사용하여 뉴런에서 단백질 수송을 연구 할 수있게합니다. 이 방법은 또한 광수용체 변성을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 따라서, 인간의 실명을 초래하는 유전성 질환의 분자 기초는 초파리 눈에서 연구 될 수 있습니다.
GFP-태깅된 단백질의 세포 국소화는 깊은 유사동공에서 형광을 관찰하거나 수침 현미경에 의해 평가될 수 있다. 두 방법 모두 시각 단백질의 국소화를 신속하게 결정하고 광수용체 세포의 변성으로 인한 횡문근의 구조적 결함을 관찰 할 수 있습니다. 고품질 이미지를 얻으려면 가장 중요한 측면은 플라이 아이의 방향입니다.
이 기술을 수행하는 동안 눈의 주변을 약간 향해 위치한 ommatidia에 초점을 맞추어야합니다. 나는 DPP 이미징의 절차를 시연 할 것이며, 침수 현미경을 사용하는 두 가지 기술은 동료 인 Krystina Wagner 박사와 우리 그룹의 박사 과정 학생 인 Matthias Zeger가 시연 할 것입니다. 깊은 의사 동공 또는 DPP를 시작하려면 일대일에서 삼 일 된 파리를 마취하고, 그 중 하나를 현미경 목표물의 중앙에 배치하여 왼쪽 또는 오른쪽 눈이 목표를 정확하게 방사상으로 향하게합니다.
전체 눈에 맞게 배율을 높이고 눈의 중앙 옴마티디아를 가운데에 맞춥니다. 가능한 경우 이중 아이리스 다이어프램을 얕은 설정으로 조정하여 현미경의 피사계 심도를 줄입니다. 그런 다음 최대 강도로 현미경 UV 램프를 켭니다.
그 후, 눈에서 발현되는 형광 단백질에 따라 현미경의 형광 필터 세트를 선택하고, 현미경 장착형 카메라를 향한 광 경로를 설정한다. 소프트웨어 내의 라이브 이미징 기능을 사용하여 노출 시간과 이득 값을 높여 눈에서 특정 신호만 감지하는 설정으로 이미지 밝기를 조정합니다. 현미경 초점을 눈에 다시 조정하여 DPP의 중첩 된 이미지를 생성합니다.
그런 다음, 형광 DPP의 스냅샷을 찍는다. 치명적인 변형으로 파리를 준비하려면 Plasticine 조각을 물체 슬라이드에 붙이고 다른 조각을 페트리 접시의 중앙에 부착하십시오. 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 증류수와 얼음 조각으로 채우십시오.
그런 다음, 얼음 마취 플라이 하나를 스테레오 현미경 아래에 올려 놓고 Plasticine-coated object 슬라이드 위에 올려 놓습니다. 파리를 등에 돌리고 흉부의 중심을 통해 곤충 핀을 관통하십시오. Plasticine 코팅 오브젝트 슬라이드에서 핀을 수평으로 고정하고 플라이의 왼쪽 또는 오른쪽 눈의 방향을 위쪽으로 향하게 합니다.
그런 다음 페트리 접시에서 Plasticine-free 면이 아래로 향하도록 물체 슬라이드를 조심스럽게 고정하여 플라이 헤드의 회전을 방지합니다. 플라이 눈이 물로 덮여 있는지 확인하십시오. 대안적으로, 치명적이지 않은 변형으로 파리를 제조하기 위해, 얼음 마취된 플라이 헤드를 먼저 200 마이크로리터 피펫 팁으로 옮기고, 조심스럽게 파리를 압축 공기로 팁 쪽으로 밀어 넣는다.
그런 다음 메스를 사용하여 머리 바로 앞에있는 피펫 팁을 자르고 핀셋을 사용하여 조심스럽게 파리를 피펫 팁으로 몇 밀리미터 밀어 넣으십시오. 피펫 팁을 다시 차단하고 플라이를 압축 공기로 팁 쪽으로 다시 밀어 피펫 팁에서 플라이의 헤드만 돌출되도록 합니다. Plasticine 조각을 개체 슬라이드에 붙인 후 피펫 팁을 눌러 왼쪽 또는 오른쪽 눈이 위쪽을 향하도록 합니다.
눈이 현미경 아래에서 올바르게 향하고 있는지 확인하십시오. 이미지 수집의 경우 침수 목표를 선택합니다. 치명적이지 않은 변형의 경우, 실험실 피펫을 사용하여 물 침수 목표의 아래쪽에 차가운 물의 큰 방울을 부착하십시오.
준비된 파리와 함께 물체 슬라이드를 현미경 스테이지에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 물 표면에 닿거나 파리의 눈이 방울에 닿을 때까지 수동으로 침수 목표를 낮 춥니 다. 그런 다음 조명 경로를 현미경 카메라쪽으로 전환하고 라이브 이미지를 생성합니다.
카메라의 초점을 다시 조정하고 눈이 현미경 목표를 방사상으로 향해야한다는 점을 고려하여 눈의 방향을 평가하십시오. 조회 테이블 소프트웨어를 사용하여 과채도를 감지합니다. 색소가 묻지 않은 파리의 경우 가장 밝은 픽셀이 모든 이미지의 채도 한계보다 약간 낮도록 노출 시간을 조정합니다.
이미지를 기록하고 원시 파일로 저장하여 녹화의 모든 해당 메타데이터를 보관합니다. 그런 다음 이미지를 tif 형식으로 내보냅니다. 침지 현미경 사진의 횡문근에서 상대적 eGFP 형광을 정량화하려면 분석(Analyze)을 클릭한 다음 측정 설정(Set Measurements)을 클릭하여 ImageJ 설정을 조정하고 평균 회색 값 상자만 선택합니다.
파일을 클릭하여 tif 이미지를 가져온 다음 열기를 클릭합니다. 초점이 맞춰진 이미지의 대표 영역을 선택하고 Control을 반복해서 누르고 함께 눌러 200 ~ 300 %로 확대하십시오. 다음으로, 타원형 도구를 선택하고 Shift 키를 누른 상태에서 하나의 형광 횡문턱보다 훨씬 작은 원형 선택을 이미지에서 생성합니다.
그런 다음 ImageJ 주 창에서 도구 모음 아래에 표시된 정확한 크기를 찾습니다. 원형 선택 영역 내의 형광 강도를 측정하려면 키보드의 화살표 키를 사용하여 원을 첫 번째 횡문근으로 이동하고 분석(Analyze)을 클릭한 다음 측정(Measure)을 클릭합니다. 측정된 회색 값을 나열하는 결과 창이 나타납니다.
횡문근 두 개에서 여섯 개까지 계속 측정하고 배경 신호를 측정하십시오. 색소가 묻지 않은 파리의 경우 해당 세포체 영역을 추가로 측정하십시오. 두 번 더 옴마티디아의 형광을 측정하여 세 번의 기술적 반복실험이 발생합니다.
연필 도구를 사용하여 분석된 옴마티디아를 표시하고 문서화를 위해 이 이미지를 저장합니다. 결과 창에서 측정된 회색 값을 선택하여 복사한 다음 추가 계산을 위해 스프레드시트 소프트웨어에 붙여넣습니다. 형광 강도 값을 그 기원에 따라 횡문근, 세포체 및 배경의 범주로 분류하고 각 범주에서 평균 강도를 계산합니다.
그런 다음, 색소가 나지 않은 눈의 경우 첫 번째 공식을 사용하고 색소 침착 된 눈의 경우 두 번째 공식을 사용하여 횡문관에 존재하는 eGFP의 상대적 양을 계산하십시오. 대안적으로, 수침 현미경 사진에서 eGFP 형광에 의한 눈 형태를 정량화하기 위해, 초점이 맞춰진 이미지의 대표적인 영역에서 인접한 세 개의 옴마티디아를 선택하십시오. 주변 배경 신호에 대한 eGFP 강도, 가장자리 선명도 및 대비에 따라 선택 항목의 18 개의 횡문근을 개별적으로 평가하십시오.
마지막으로, 명확하게 보이는 횡문근을 두 개의 값으로 채점하고, 매주 볼 수있는 횡문근을 하나의 값으로 채점하고, 0의 값을 가진 횡문근이없는 횡문근을 점수화하여 퇴행 지수를 생성합니다. eGFP TRPL 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 초파리 파리에서, 횡문근 형광은 eGFP TRPL의 전좌로 인해 빛에서 사라진다. 이는 eGFP TRPL의 내재화에 결함이 있는 돌연변이체를 확인하기 위해 유전자 스크린을 수행하는 것을 허용한다.
대조군 파리에서, eGFP TRPL은 16시간의 조명 후에 횡문근에서 세포체로 전좌하여, 어두운 적응 상태에 비해 횡문근 형광의 현저한 감소를 초래한다. 두 번째 어두운 인큐베이션은 횡문근 형광을 다시 초기 값으로 올립니다. 그러나, TRPL 전좌 결함 돌연변이체 vps35MH20에서, 형광 패턴은 16시간의 조명 및 24시간 동안 후속적인 어두운 적응 후에 크게 변화하지 않는다.
이러한 정량화 방법은 통계적으로 매우 유의한 재활용 결함을 검출할 수 있다. 흰 눈의 파리는 횡문근과 세포 몸체 모두에서 형광 신호를 검출 할 수 있습니다. 대조적으로, 적목 파리에서 형광 신호는 횡문관에서만 검출 할 수 있지만 세포체에서는 검출 할 수 없습니다.
망막 변성의 정량화와 관련하여, eGFP TRP 형광은 수주에 걸쳐 평가될 수 있다. 2 주 동안 12 시간 빛, 12 시간의 암흑주기에 보관하면 돌연변이 파리에서는 퇴행 지수가 감소했지만 통제 파리에서는 감소하지 않았습니다. 이 프로토콜에서는 색소 침착 된 눈과 비 색소 눈을 구별해야합니다.
색소 침착은 형광 신호에 영향을 미치기 때문에 정량적 침지 현미경은 두 경우 모두에 개별적으로 최적화되었습니다. DPP 이미징 및 침수 현미경은 해상도가 제한된 고처리량 방법입니다. 세포 내 국소화를 조사하려면 조직 절편에 대한 면역 형광 현미경 검사를 권장합니다.
퇴행성 표현형의 상세한 분석을 위해, 전자 현미경이 수행될 수 있다.
