이 연구는 미국 국립과학재단(NSF)의 RUI Award(DMR-2203791)의 지원을 받아 J.S. 정렬 과정에서 Bin Yang 박사와 Manish Kumar 박사가 제공한 지도에 감사드립니다. Kinesin 모터의 준비 지침을 제공해 주신 Jenny Ross 박사와 K. Alice Lindsay 박사님께 감사드립니다.

세포골격 네트워크를 시각화하기 위한 맞춤형 형광 현미경

<ol>
	<li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter.">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834 (2021).</li><li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+confocally-aligned+planar+excitation+(SCAPE)+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms.">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li><li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy.">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution.">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy.">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li><li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peeping+in+on+the+cytoskeleton:+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization.">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li><li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+(SOPi)+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging.">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals.">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li><li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics.">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681 (2020).</li><li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo.">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li><li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton.">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, (2016).</li><li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. 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Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023)</li><li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023)</li><li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossbill:+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform.">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+microscopy:+A+tutorial.">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li><li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenSPIM:+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform.">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li><li>Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab Available from: <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023)</li><li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data.">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li><li>. Harvard University. Mitchison Lab Available from: <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023)</li><li>Watkins, S. C., St. Croix, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+imaging+comes+of+age.">Light sheet imaging comes of age.</a> Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).</li><li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+microtubules+and+motors.">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li><li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter.">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li><li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes.">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119 (2022).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors.">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002 (2016).</li><li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High NA single-objective lightsheet. , (2019).</li><li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope.">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li><li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy.">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969 (2022).</li><li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy.">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다. 모든 연구는 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었습니다.

이 프로토콜과 관련된 두 가지 중요한 세부 사항은 시스템의 전체 비용과 예상 빌드 및 정렬 시간입니다. 정확한 비용은 가변적이지만 이 SOLS 또는 유사한 DIY 시스템의 토토 비용은 $85,000 USD 범위에 속할 것이라고 편안하게 추정할 수 있습니다. 이 견적은 모든 구성 요소의 소매 가격을 고려하므로 중고 구성 요소를 소싱하면 이 전체 가격이 크게 낮아질 수 있습니다. 구축 시간 측면에서 광학 경험이 거의 없는 사용자가 모든 구성 요소를 사용할 수 있고 준비된 경우 1-2개월 이내에 이 전체 SOLS 시스템을 구축하고 정렬할 것으로 예상하는 것이 합리적입니다. 프로토콜의 길이와 복잡성에도 불구하고, 우리는 비디오 프로토콜과 짝을 이루는 서면 원고의 세부 사항의 양이 이 프로토콜을 간단하고 빠르게 따라갈 수 있도록 해야 한다고 믿습니다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 갈보의 배치는 3개의 개별 4f 렌즈 쌍의 일부이므로 많은 렌즈의 배치를 결정합니다. 갈보가 O1 및 O2의 후면 초점면과 결합되고 기울기 불변 스캔을 보장하기 위해 올바르게 중앙에 위치하는 것이 중요합니다. 둘째, 이미지 품질은 서로에 대한 O2와 O3의 정렬에 매우 민감합니다. 여기서 먼저 O3 대 O2의 정렬 각도가 여기 광시트의 기울기와 일치하여 유사하게 기울어진 FoV에서 최대한 평평한 조명을 제공하도록 주의를 기울여야 합니다. 둘째, O3는 가능한 한 큰 면적의 평평한 FoV를 유지하기 위해 올바른 축 거리에 배치되어야 합니다. 셋째, O3는 O2-O2 인터페이스를 통과하는 신호를 최대화하기 위해 O3에서 올바른 측면 거리에 배치되어야 합니다.

사용 가능한 FoV 측면에서 이 시스템은 80μm x 80μm 영역에서 일관된 조명으로 평평하고 안정적인 필드를 달성했습니다. 이 영역은 카메라에서 제공하는 최대 FoV보다 작기 때문에 사용 가능한 FoV는 그림 13의 노란색 상자로 표시됩니다. 분해능 측면에서 이 시스템은 x축을 따라 432nm, y축을 따라 421nm의 최소 분해능 거리를 달성했으며, 이는 양호한 FoV에서 가우스 피팅 대 점 확산 함수(PSF)의 평균 시그마 x 및 y를 찾고 2를 곱하여 측정되었습니다. 이 시스템은 총 NA 측면에서 최적화되지 않았으며, 이는 사용자가 이 시스템이 달성한 것보다 더 높은 분해능을 원할 경우 상당한 개선의 여지가 있음을 의미합니다. 이러한 유형의 SOLS 빌드에는 호환 가능한 대물렌즈 옵션이 많이 있으며, 그 중 다수는 더 높은 시스템 해상도에 기여하지만 릴레이 인터페이스 8,11,13,20에서 더 높은 비용, 더 작은 FoV 또는 더 복잡한 정렬 기술의 단점이 있습니다. 이와는 별도로, 사용자가 더 큰 FoV를 원하는 경우, 2D 스캐닝을 허용하기 위해 두 번째 갈보를 통합하면 이러한 목표를 달성할 수 있지만, 추가적인 광학 및 제어 메카니즘이 설계(32)에 통합될 것을 요구할 것이다. 우리는 디자인 프로세스23에 관한 다른 유용한 리소스에 대한 링크와 함께 웹 사이트 페이지에서 시스템 수정에 대한 자세한 내용을 제공했습니다.

이 특정 설계에 대한 특정 구성 요소를 개선하는 것 외에도 이 빌드에 다른 고해상도 현미경 기술이나 양식을 추가하는 것이 매우 실현 가능할 것입니다. 이러한 개선 사항 중 하나는 다중 파장 조명을 통합하는 것인데, 이는 추가 여기 레이저를 원래의 여기 경로8에 정렬하는 것을 포함합니다. 또한 이러한 유형의 SOLS 설계는 샘플에 접근할 수 있기 때문에 광학 핀셋, 미세유체역학 및 유변 물성 측정을 포함하되 이에 국한되지 않는 추가 기능을 현미경에 추가하는 것은 비교적 간단합니다 2,33.

지금까지 공개된 수많은 라이트 시트 가이드와 비교했을 때, 이 프로토콜은 광학 경험이 많지 않은 사용자도 도움이 될 수 있는 수준의 지침을 제공합니다. 기존의 시료 슬라이드 장착 기능을 갖춘 사용자 친화적인 SOLS 빌드를 더 많은 청중이 이용할 수 있도록 함으로써 장비가 활용되었거나 활용될 수 있는 모든 분야에서 SOLS 기반 연구의 응용 분야를 더욱 확장할 수 있기를 바랍니다. SOLS 기기의 응용 분야가 2,34,35 번으로 빠르게 성장하고 있음에도 불구하고 SOLS 유형 기기의 많은 이점과 활용이 아직 탐구되지 않은 상태로 남아 있다고 생각하며 이러한 유형의 기기가 앞으로 나아갈 가능성에 대한 흥분을 표현합니다.

광시트 형광 현미경(LSFM)은 여기광이 시트 1,2로 형성되는 고해상도 형광 이미징 기술 제품군을 나타내며, 여기에는 SPIM(Selective Plane Illumination Microscopy), SCAPE(Swept Confocally-Aligned Planar Excitation) 및 OPM(Oblique-Plane Microscopy)3,4,5,6,7이 포함됩니다. epi-fluorescence, total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) 또는 confocal microscopy와 같은 다른 현미경 방식과 달리 LSFM에서는 광독성이 최소화되며 활발하게 이미징되는 샘플의 평면만 조명되기 때문에 더 긴 시간 척도에 걸쳐 샘플을 이미징할 수 있습니다 8,9,10. 따라서 LSFM 기법은 장기간에 걸쳐 3D 샘플을 이미징하는 데 매우 유용하며, 특히 컨포칼 현미경 기법을 사용하기에는 너무 두꺼운 샘플도 유용합니다. 이러한 이유로 LSFM은 2004년 최초 개발 이후 많은 생리학자, 발달 생물학자 및 신경과학자가 살아있는 제브라피시 및 초파리 배아와 같은 전체 유기체의 시각화를 위해 선택하는 이미징 기술이 되었습니다 3,4,6,11 . 지난 20년 동안 LSFM의 장점은 생체 내 및 시험관내 13,14,15,17 모두에서 조직11,12, 세포 및 세포 내 규모를 포함하여 점진적으로 더 작은 규모에서 구조와 역학을 시각화하는 데 활용되었습니다.
문헌에서 성공적인 사용 사례에 대한 보고에도 불구하고 상용 LSFM 시스템의 높은 비용(작성 당시 ~25만 달러)18,19은 이 기술의 광범위한 사용을 방해합니다. DIY 빌드를 연구자에게 실현 가능한 대안으로 만들기 위해 오픈 액세스 노력인 OpenSPIM22를 포함하여 여러 빌드 가이드 8,13,20,21이 게시되었습니다. 그러나 현재까지 광학 경험이 거의 없는 연구자들은 기존의 슬라이드 장착 샘플과 호환되지 않는 초기 LSFM 설계만 사용할 수 있습니다(그림 1A). 최근의 단일 대물렌즈, 광시트(SOLS) 구현은 여기와 검출 모두에 단일 대물렌즈를 사용하므로(그림 1C) 호환성 5,6,8,13,20과 관련된 한계를 극복했습니다. 그러나 SOLS 설계의 다양성에 대한 비용은 이미징을 위해 물체 평면을 카메라에 릴레이, 틸트 해제 및 이미지로 다시 이미지화하기 위한 두 가지 추가 대물렌즈가 필요하기 때문에 빌드의 복잡성이 크게 증가한다는 것입니다(그림 1D). 복잡한 SOLS 스타일 설정에 쉽게 액세스할 수 있도록 이 백서는 슬라이드 호환 SOLS 시스템의 설계, 구축, 정렬 프로세스 및 사용에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 이는 초급 광학 교육 과정만 알고 있는 연구자에게 유용합니다.
프로토콜 자체는 간결하지만 독자는 준비 단계에서 다른 리소스를 참조하여 디자인 또는 하드웨어 고려 사항의 특정 부분에 대해 자세히 알아보아야 합니다. 그러나 독자가 이 설계의 사양을 따르려는 경우 특정 광학 부품을 선택하는 방법을 이해할 필요가 없을 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> 그림 1: 다양한 LSFM 구성의 특성. (A) 초기 LSFM 설계에서 공통적으로 사용되는 두 개의 직교 대물렌즈를 사용한 설정. 이 구성에서는 모세관 또는 겔 실린더를 사용하여 시료를 담는데, 이는 기존의 슬라이드 장착 기술과 호환되지 않습니다. (B) 다음을 보여주는 SOLS 광시트 설계의 개략도: (C) 샘플 평면(O1)에서 여기 및 방출 수집 모두에 사용되는 단일 대물렌즈; 이를 통해 기존 슬라이드를 상단에 장착할 수 있으며 (D) SOLS 방출 경로에 릴레이 대물렌즈 시스템을 장착할 수 있습니다. O2는 방출광을 수집하고 이미지를 확대합니다. O3는 카메라 센서에 올바른 기울기 각도로 평면을 이미지화합니다. 약어: LSFM = light-sheet fluorescence microscopy; SOLS = 단일 대물렌즈 광시트; O1-O3 = 목적. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#34; Plano-Concave Lens f = -50 mm</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>LC1715-A-ML</td>
			<td>For alignment laser 
			Estimated Cost: $49.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 100 mm (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-100-A-ML</td>
			<td>L2, L4 and alignment laser 
			Estimated Cost: $342.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 125 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-125-A-ML</td>
			<td>SL2 
			Estimated Cost: $114.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 150 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>L3 
			Estimated Cost: $114.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 150 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>TL2 
			Estimated Cost: $114.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 45 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-045-A-ML</td>
			<td>L1 
			Estimated Cost: $114.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 75 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-075-A-ML</td>
			<td>SL1 
			Estimated Cost: $114.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Cylindrical Lens f = 100 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1567RM</td>
			<td>CL3 
			Estimated Cost: $117.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Cylindrical Lens f = 200 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1653RM</td>
			<td>CL2 
			Estimated Cost: $111.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Cylindrical Lens f = 50 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1695RM</td>
			<td>CL1 
			Estimated Cost: $117.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Mounted Pinhole, 30 &#181;m Pinhole Diameter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30K</td>
			<td>Estimated Cost: $77.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Silver Mirror (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td>M1, M2, one for alignment 
			Estimated Cost: $168.78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#34; Elliptical Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PFE20-P01</td>
			<td>M3 
			Estimated Cost: $179.98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#34; Post Holder (x11)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH2</td>
			<td>For custom laser mount, ND wheel, safety screens 
			Estimated Cost: $98.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#34; Posts (x47)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR2</td>
			<td>For custom laser mount and optical components 
			Estimated Cost: $277.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; Posts (x4)&#160;</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>TR3</td>
			<td>For M3 supports and other mounts 
			Estimated Cost: $24.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; Post Holder (x4)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>PH3</td>
			<td>Estimated Cost: $38.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 to 60 mm Cage Adapter&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LCP33</td>
			<td>To mount O1 
			Estimated Cost: $45.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mm Cage Filter Wheel</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFW6</td>
			<td>To mount ND filters 
			Estimated Cost: $172.36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mm Cage Plate (x6)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td>To build alignment cage and alignment laser 
			Estimated Cost: $114.54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB1</td>
			<td>To mount M1 and M2 and for alignment laser 
			Estimated Cost: $463.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Post Holder (x30)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH4</td>
			<td>Estimated Cost: $320.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm Laser and Power Supply&#160;</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td>MGL-FN-561-100mW</td>
			<td>Excitation laser 
			Estimated Cost: $6000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm Cage Plate (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LCP01</td>
			<td>To mount TL1 and M3 mount 
			Estimated Cost: $88.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB2</td>
			<td>To mount M3 
			Estimated Cost: $187.26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90&#176; Flip Mount</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>TRF90</td>
			<td>For alignment laser 
			Estimated Cost: $95.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td>To connect lens tube to camera 
			Estimated Cost: $20.96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>SM1A10</td>
			<td>To connect tube lens to lens mount 
			Estimated Cost: $21.82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A12</td>
			<td>To mount O1 and O2 
			Estimated Cost: $47.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A27</td>
			<td>To mount O3 
			Estimated Cost: $22.38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment Disk</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>SM1A7</td>
			<td>Estimated Cost: $20.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment Laser</td>
			<td>BISKEE</td>
			<td></td>
			<td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM 
			Estimated Cost: $16.98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoluorescent Plastic Slide, Red&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>92001</td>
			<td>Estimated Cost: $20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Shutter&#160;</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>SM1SH1</td>
			<td>To block laser light 
			Estimated Cost: $65.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Rotation Mount (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CRM1T</td>
			<td>To mount CL1-3 
			Estimated Cost: $282.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage System Rods 1&#34; (x8)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>ER1</td>
			<td>To mount M3 and O1 
			Estimated Cost: $44.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage System Rods 3&#34; (x2)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>ER3</td>
			<td>To mount O3 
			Estimated Cost: $14.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage System Rods 4&#34; (x4)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>ER4</td>
			<td>To mount slit 
			Estimated Cost: $30.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage System Rods 8&#34; (x2)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>ER8</td>
			<td>For tube lens alignment 
			Estimated Cost: $25.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage System Rods 12&#34; (x8)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER12</td>
			<td>For alignment cage 
			Estimated Cost: $145.36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS</td>
			<td>Estimated Cost: ~$14,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping Fork (x35)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CF125</td>
			<td>To clamp down post mounts 
			Estimated Cost: $338.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, 22 x 22 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td>For slide samples 
			Estimated Cost: $265</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic&#160;</td>
			<td>AVR</td>
			<td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td>
			<td>To split exciation/emission paths 
			Estimated Cost: $965</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DT12</td>
			<td>To translate pinhole 
			Estimated Cost: $90.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELHO600</td>
			<td>Estimated Cost: $140.99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Glass Alignment Disk (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DG10-1500-H1</td>
			<td>For alignment cage and intermediate plane 
			Estimated Cost: $75.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>HP 33120A 15 MHz</td>
			<td>To control galvo 
			Estimated Cost: $900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometer - 1D Large Beam Diameter System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS011</td>
			<td>Estimated Cost: $1715.78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometer Power Supply</td>
			<td>Siglent</td>
			<td>SPD3303C</td>
			<td>Estimated Cost: $300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelrite</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G35020-100.0</td>
			<td>Gellan gum for 3D bead sample 
			Estimated Cost: $68.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>Open-source</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads 
			Estimated Cost: Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate/ Stirrer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td>For preparing sample solutions 
			Estimated Cost: $550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Cube Brushed Motor Controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td>Drives Z825B 
			Estimated Cost: $757.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100S</td>
			<td>To mount dichroic 
			Estimated Cost: $92.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinesis Software</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 
			Estimated Cost: Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Light Blocker&#160;</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>LB1</td>
			<td>For ND filter reflections 
			Estimated Cost: $57.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Mount</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed 
			Estimated Cost: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Safety Screen (x2)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>TPS4</td>
			<td>For blocking stray laser light 
			Estimated Cost: $92.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Tube Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200MP</td>
			<td>TL1 
			Estimated Cost: $1491</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Mount (x10)&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMR1</td>
			<td>To mount all lens and extra alignment mirror. 
			Estimated Cost: $164.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ruler</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BHM4</td>
			<td>To check alignment 
			Estimated Cost: $52.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager Software&#160;</td>
			<td>Open-source</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release 
			Estimated Cost: Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12550400</td>
			<td>For slide samples 
			Estimated Cost: $123.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage&#160;</td>
			<td>ASI</td>
			<td>FTP-2000 with custom parts</td>
			<td>To fine-translate samples 
			Estimated Cost: ~$16,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-688</td>
			<td>For sample preparation 
			Estimated Cost: $152.64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Actuator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z825B</td>
			<td>To fine-translate M1 
			Estimated Cost: $729.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Standard Iris (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ID20</td>
			<td>At least 2 for alignment 
			Estimated Cost: $118.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ND Filter Set&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NDK01&#160;</td>
			<td>To reduce excitation intensity 
			Estimated Cost: $726.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Lens 1</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Plan Apo 60X/ 1.20 WI</td>
			<td>O1 
			Estimated Cost: ~$15,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Lens 2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TU Plan Fluor 100X/0.90&#160;</td>
			<td>O2 
			Estimated Cost: ~$6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Lens 3</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>Plan Apo HR 50X/0.75</td>
			<td>O3 
			Estimated Cost: ~$6,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM Deskewing Software</td>
			<td>Open-source</td>
			<td></td>
			<td>For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM 
			Estimated Cost: Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>S121C</td>
			<td>For measuring laser intensity 
			Estimated Cost: $379.68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Grid Distortion Target</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>R1L3S3P</td>
			<td>Brightfield alignment 
			Estimated Cost: $267.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter Digital Console</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>For measuring laser intensity 
			Estimated Cost: $1245.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J62315.14</td>
			<td>For fluorescent coated slide sample 
			Estimated Cost: $27.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for Posts</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>RA90</td>
			<td>For M3 support and flip down mirror 
			Estimated Cost: $32.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMS-Threaded Cage Plate (x2)&#160;</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>CP42</td>
			<td>For alignment laser 
			Estimated Cost: $70.56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shear Plate 2.5-5.0 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SI050P&#160;</td>
			<td>Estimated Cost: $182.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shear Plate 5.0-10.0 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SI100P</td>
			<td>Estimated Cost: $201.47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shear Plate 10.0-25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SI254P</td>
			<td>Estimated Cost: $236.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shear Plate Viewing Screen</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SIVS</td>
			<td>Estimated Cost: $337.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SI035</td>
			<td>For checking collimation 
			Estimated Cost: $465.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slip-On Post Collar (x35)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>R2</td>
			<td>To maintain post height 
			Estimated Cost: $208.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VA100</td>
			<td>Estimated Cost: $294.64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted Lens Tube, 3&#34;</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>SM1L30C</td>
			<td>For alignment laser 
			Estimated Cost: $77.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mirror, 1 x 1&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0&#38;hva 
			did=642191768069&#38;hvpos=&#38;hvne 
			tw=g&#38;hvrand=1336734911900437 
			4691&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvqmt= 
			&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint=&#38; 
			hvlocphy=9031212&#38;hvtargid=pla-1 
			943952718742&#38;gclid=Cj0KCQiA6L 
			yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL 
			q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA 
			Lw_wcB&#38;th=1 
			Estimated Cost: $14.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable Lens Tube 1/2&#34; (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
			<td>To mount CL1-3 
			Estimated Cost: $40.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable Lens Tube 1&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td>To mount O3 
			Estimated Cost: $15.41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable Lens Tube 2&#34; (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L20</td>
			<td>For camera path 
			Estimated Cost: $35.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studded Pedestal Base Adapter (x37)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>BE1</td>
			<td>To attach post mounts to table 
			Estimated Cost: $400.71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translating Lens Mount (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LM1XY</td>
			<td>To fine-translate pinhole, O2 and O3 
			Estimated Cost: $441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stage with Standard Micrometer (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1/M</td>
			<td>TS1-2 
			Estimated Cost: $647.54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Manual Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CT1A</td>
			<td>O3 cage translation mount 
			Estimated Cost: $497.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA20696</td>
			<td>TL3 
			Estimated Cost: $359</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Mounted LED</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>MNWHL4</td>
			<td>Brightfield light source 
			Estimated Cost: $171.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTIONAL COMPONENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grasshopper3 USB3</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>&#160;GS3-U3-23S6C-C</td>
			<td>For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. 
			Estimated Cost: $1089</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and building of a customizable, single-objective, light-sheet fluorescence microscope for the visualization of cytoskeleton networks

재구성된 세포골격 복합체는 비평형 연성 물질을 연구하기 위한 귀중한 모델 시스템으로 부상했습니다. 이러한 3D 조밀한 네트워크의 역학을 충실하게 포착하려면 종종 형광 컨포칼 현미경과 관련된 광학 절편이 필요합니다. 그러나 최근 광시트 형광 현미경(LSFM)의 발전으로 비용 효율적이고 때로는 우수한 대안으로 자리 잡았습니다. 광학에 익숙하지 않은 세포골격 연구자들이 LSFM을 이용할 수 있도록 기성 부품으로 다용도 광시트 형광 현미경을 제작하는 단계별 초보자 가이드를 제공합니다. 기존 슬라이드 시료로 시료를 장착할 수 있도록 이 LSFM은 여기 및 방출 수집 모두에 단일 대물렌즈를 활용하는 단일 대물렌즈 광시트(SOLS) 설계를 따릅니다. 독자가 기기를 수정하고 특정 요구 사항에 맞게 설계할 수 있도록 SOLS의 각 구성 요소의 기능을 충분히 자세히 설명합니다. 마지막으로, 키네신 구동 미세소관 네트워크에서 과꽃을 시각화하여 이 맞춤형 SOLS 기기의 사용을 시연합니다.

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) represents a family of high-resolution fluorescence imaging techniques in which the excitation light is shaped into a sheet1,2, including selective plane illumination microscopy (SPIM), swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE), and oblique-plane microscopy (OPM)3,4,5,6,7. Unlike other microscopy modalities such as epi-fluorescence, total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), or confocal microscopy, phototoxicity is minimal in LSFM and samples can be imaged over longer timescales because only the plane of the sample being actively imaged is illuminated8,9,10. Therefore, LSFM techniques are extremely useful for imaging 3D samples over extended time periods, notably even those too thick for confocal microscopy techniques. Due to these reasons, since its original development in 2004, LSFM has become the imaging technique of choice for many physiologists, developmental biologists, and neuroscientists for the visualization of entire organisms such as live zebrafish and Drosophila embryos3,4,6,11. In these last two decades, the advantages of LSFM have been leveraged to visualize structure and dynamics at progressively smaller scales, including the tissue11,12, cellular, and subcellular scales, both in vivo and in vitro13,14,15,17.
Despite the reports of successful use cases in the literature, the high cost of commercial LSFM systems (~0.25 million USD as of the time of writing)18,19 prevents the widespread use of the technique. To make DIY builds a feasible alternative for researchers, multiple build guides have been published8,13,20,21, including the open-access effort OpenSPIM22. However, to date, researchers with minimal optics experience can only use earlier LSFM designs, which are incompatible with traditional slide-mounted samples (Figure 1A). Recent single-objective, light-sheet (SOLS) implementation use a single objective for both the excitation and detection (Figure 1C), thereby overcoming the limitation related to compatibility5,6,8,13,20. However, the cost for the versatility of the SOLS design is a substantial increase in the complexity of the build due to the requirement of two additional objectives to relay, de-tilt, and reimage the object plane onto the camera for imaging (Figure 1D). To facilitate access to the complex SOLS-style setups, this paper presents step-by-step guide on the design, build, alignment process, and use of a slide-compatible SOLS system, which would be useful to researchers with knowledge of only an entry-level optics course.
Although the protocol itself is succinct, readers must refer to other resources during the preparation steps to learn more about particular parts of the design or hardware considerations. However, if a reader intends to follow the specifications of this design, it may not be necessary to understand how to select particular optical components.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg" /> 
Figure 1: Characteristics of different LSFM configurations. (A) The setup with two orthogonal objectives common in early LSFM designs. In this configuration, a capillary tube or a cylinder of gel is used to contain the sample, which is not compatible with traditional slide mounting techniques. (B) A schematic of an SOLS light-sheet design showing the following: (C) the single objective used for both the excitation and emission collection at the sample plane (O1); this allows a traditional slide to be mounted on top, and (D) the relay objective system in the SOLS emission path. O2 collects the emission light and demagnifies the image. O3 images the plane at the correct tilt angle onto the camera sensor. Abbreviations: LSFM = light-sheet fluorescence microscopy; SOLS = single-objective light-sheet; O1-O3 = objectives. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

저자 스포트라이트: Advancing Knowledge in Far-From-Equilibrium Materials Through Light-Sheet Microscopy (광시트 현미경을 통한 평형에서 멀리 떨어진 재료에 대한 지식 발전)

세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축

Our work aims to advance knowledge on the relationship between trans work dynamics, local structure, and mechanical properties in far-from-equilibrium materials. Visualizing far-from-equilibrium materials such as cytoskeleton networks requires an ability to image dense, three-dimensional samples with comparable image quality throughout the volume of the sample, while causing minimal damage via photobleaching, a technically challenging task that fluorescence light-sheet microscopy is best suited for. Fluorescence light-sheet microscope systems provide excellent optical sectioning capabilities, which allows for imaging of these thick, three-dimensional samples for long time scales with minimal photobleaching.In particular, the single objective light-sheet system we will present is compatible with traditional slide-mounted samples, making it a very versatile tool. The overwhelming majority of single objective light-sheet guides are written for users with extensive optics experience. To make the complex single objective light-sheet style setup more accessible, this detailed guide provides steps that a user with an entry-level optics course depth of knowledge can follow.

우리는 gellan 검에서 끼워넣어진 1개 μm 구슬의 부피 측정 검사를 실행했습니다. 그림 14 는 x, y, z 방향에 따른 기울기 보정 체적 스캔의 최대 강도 투영을 보여줍니다.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> 그림 14: 겔란 검에서 1μm 형광 비드의 체적 이미징. 기울기 보정된 체적 스캔의 최대 강도 투영이 표시됩니다. 스케일 바 = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
우리는 단일 대물렌즈 광시트 현미경을 사용하여 미세소관 과꽃 샘플의 체적 스캔을 수행하여 재구성된 세포골격 네트워크를 특성화하는 방법을 시연했습니다. 간단히 말해서, 로다민-표지된, 탁솔-안정화된 미세소관은 GTP에 의해 재구성된 이량체로부터 중합되었다; 그런 다음 중합 후 스트렙타비딘 기반 키네신 모터 클러스터를 ATP와 함께 샘플에 혼합하여 6μM 미세소관, 0.5μM 키네신 이량체 및 10mM ATP의 최종 농도를 높였습니다. 탁솔-안정화된 미세소관 및 키네신 운동 클러스터의 제조를 위한 광범위한 프로토콜 및 가이드는 Mitchson Lab 및 Dogic Lab 웹사이트25,26에서 찾을 수 있습니다. 샘플을 현미경 슬라이드에 부드럽게 피펫으로 넣고 밀봉한 다음 이미징하기 전에 8시간 동안 그대로 두어 운동 활동이 중지되도록 하여 샘플이 과꽃과 유사한 안정적인 구조 상태에 도달하도록 했습니다.
재구성된 세포골격 시스템에 대한 연구는 이미지 라벨링 필라멘트에 컨포칼 또는 에피형광 현미경을 가장 자주 사용합니다. 그러나, 이들 두 기술 모두 조밀한 3D 샘플을 이미지화하는 능력에 있어서 제한된다(27). 샘플을 준2D 28,29로 제한함으로써 체외 세포골격 기반 활성 물질 연구에서 많은 진전이 이루어졌지만, 세포골격 네트워크는 본질적으로 3D이며, 3D 샘플에서만 발생할 수 있는 효과를 이해하는 데 현재의 많은 노력이 놓여 있습니다(29,30), 따라서 고해상도 3D 이미징의 필요성이 대두되고 있습니다.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> 그림 15: 단일 대물렌즈 광시트 현미경을 통한 재구성된 세포골격 샘플의 3D 시각화 촉진. (A) Leica DMi8 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 획득한 형광 미세소관 과꽃의 이미지. 이미지는 z-스캔의 다른 평면을 보여줍니다. 스케일 바 = 30 μm. (B) 동일한 샘플의 단일 대물렌즈 광시트 설정에서 수행된 체적 스캔에서 디컨볼루션된 기울기 보정 이미지. 눈금 막대 = 30μm. 여기서 기울기 보정된 이미지 영역은 그림 13B에 표시된 사용 가능한 FoV(노란색 상자)에 해당합니다. 공초점은 커버슬립 근처의 단일 평면을 이미징하는 데 탁월하지만, 형광 샘플의 밀도는 이미징 평면 아래에서 오는 추가 신호로 인해 더 높은 평면에서 이미징할 때 복잡성을 유발합니다. 광시트는 이미징 평면만 비추어 이 문제를 피하므로 z의 다른 평면에서 균일하게 선명한 이미징을 허용합니다. 약어: SOLS = 단일 목표 라이트 시트; FoV = 시야. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 15에서는 키네신 운동 클러스터에 의해 과꽃과 같은 구조로 수축된 재구성된 미세소관 네트워크의 체적 이미징을 보여줍니다. 이전 연구28,31에서 볼 수 있듯이 이러한 3D 구조는 중앙으로 갈수록 조밀해지는 경향이 있어 신호에서 우세한 밝은 형광 영역이 생성됩니다. 커버슬립(낮은 z 레벨) 근처의 이미징 평면에서 컨포칼 현미경(그림 15A)은 과꽃 주변부의 단일 필라멘트를 분해할 수 있으며, 위쪽의 초점이 맞지 않는 형광 신호로 인해 중앙을 향한 추가 배경을 확인할 수 있습니다. 그러나 z에서 몇 미크론을 움직이면 과꽃의 초점이 맞지 않는 조밀한 부분이 이미징 평면의 신호에서 우세하기 때문에 이미지 품질이 빠르게 저하됩니다. 광시트의 단면 조명(그림 15B)은 이미징 평면 위와 아래의 과꽃의 조밀한 부분에서 초점이 맞지 않는 신호를 제거하여 평면 간에 유사한 이미지 품질을 허용합니다. 고품질의 신뢰할 수 있는 체적 스캔 데이터를 생성하는 광시트의 기능은 재구성된 세포골격 시스템에서 3D 현상을 시각화하고 특성화할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

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이 프로토콜은 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경을 구축하는 방법과 세포골격 네트워크 시각화를 위한 사용법에 대해 자세히 설명합니다.

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

우리의 연구는 트랜스 작업 역학, 국소 구조 및 평형에서 멀리 떨어진 재료의 기계적 특성 간의 관계에 대한 지식을 발전시키는 것을 목표로 합니다. 세포골격 네트워크와 같이 평형에서 멀리 떨어진 물질을 시각화하려면 형광 광시트 현미경이 가장 적합한 기술적으로 어려운 작업인 광표백을 통해 손상을 최소화하면서 시료 부피 전체에 걸쳐 유사한 이미지 품질로 조밀한 3차원 시료를 이미지화할 수 있는 기능이 필요합니다. 형광 광시트 현미경 시스템은 뛰어난 광학 절편 기능을 제공하여 광표백을 최소화하면서 장시간 동안 이러한 두꺼운 3차원 샘플을 이미징할 수 있습니다.특히, 우리가 소개할 단일 대물렌즈 광시트 시스템은 기존의 슬라이드 장착 샘플과 호환되므로 매우 다재다능한 도구입니다. 대다수의 단일 대물렌즈 광시트 가이드는 광범위한 광학 경험을 가진 사용자를 위해 작성되었습니다. 복잡한 단일 대물렌즈 라이트 시트 스타일 설정에 더 쉽게 접근할 수 있도록 이 상세 가이드는 초급 수준의 광학 교육 과정을 갖춘 사용자가 따라할 수 있는 단계를 제공합니다.

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Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

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1.1K 조회수.  Scripps College. 우리의 연구는 트랜스 작업 역학, 국소 구조 및 평형에서 멀리 떨어진 재료의 기계적 특성 간의 관계에 대한 지식을 발전시키는 것을 목표로 합니다. 세포골격 네트워크와 같이 평형에서 멀리 떨어진 물질을 시각화하려면 형광 광시트 현미경이 가장 적합한 기술적으로 어려운 작업인 광표백을 통해 손상을 최소화하면서 시료 부피 전체에 걸쳐 유사한 이미지 품질로 조밀한 3...