Zeiss 컨포칼 시스템을 사용해 주신 NEI(National Eye Institute) 조직학 핵심에 감사드립니다. 이 작업은 NEI IRP 기금(보조금 번호 ZIA EY000533-04)의 지원을 받았습니다.

망막 변성 모델링 및 분석

<ol>
	<li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899 (2017).</li><li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis.">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration:+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies.">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li><li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch's+membrane+and+choroid.">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li><li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy.">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li><li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration.">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model.">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+(Y402H)+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure.">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li><li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).</li><li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization.">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li><li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years,+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020:+the+Right+to+Sight:+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li></ol>

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이 프로토콜은 퇴행성 안구 질환에 대한 단일 유전자 및 다유전자 체외 질환 모델에서 지질 침착물을 효율적으로 라벨링, 이미지 및 정량화하는 방법을 제공합니다. AI 기반 소프트웨어인 LipidUNet은 세 가지 일반적인 지질 마커인 APOE, Nile Red 및 BODIPY에 적용할 수 있으며, 정량화를 표준화하고 편향되지 않은 빠른 자동 분석 방법을 제공합니다.
LipidUNet의 주요 한계는 AI에 대한 훈련 데이터 세트가 96웰 플레이트에서 배양된 세포의 40배 배율 이미지로 제한되었다는 사실입니다. 훈련 이미지 세트의 결과로, 현재 형태의 LipidUNet은 40x 배율 이미지 분석으로 제한됩니다. 이 소프트웨어는 96웰 플레이트 이외의 다른 배양 표면에서 배양된 세포의 40x 이미지를 분석하는 데 사용할 수 있지만, 소프트웨어에 의한 정확한 임계값을 확인하기 위해 생성된 출력 마스크를 검사하는 데 주의를 기울여야 합니다. 분석할 수 있는 샘플/이미지의 범위를 확장하려면 더 많은 이미지 세트(다른 배율)가 필요합니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 지질 마커 단계에서 사용자는 선택한 라벨링 컴파운드(BODIPY, APOE, Nile Red)가 샘플을 효과적으로 라벨링했는지 확인해야 합니다. 성숙한 RPE 세포는 종종 심하게 착색되어 항체 면역염색의 형광 신호를 손상시킬 수 있습니다. 형광 신호가 약하거나 배경 염색이 너무 많으면 LipidUNet은 지질 방울을 정확하게 식별할 수 없습니다. 유사한 이유로, 프로토콜의 자동 이미징 단계를 위해 적절하게 선택된 획득 설정이 사용되어야 한다. 획득한 이미지의 품질이 좋지 않으면 LipidUNet이 이미지를 적절하게 마스킹하는 데 어려움을 겪을 수 있으므로 정량화가 부정확합니다(그림 6A-L). 마지막으로, LipidUNet은 소프트웨어가 작동하기 위한 특정 요구 사항을 가지고 있기 때문에 이미지의 후처리는 중요한 단계입니다.
수동 임계값 지정을 사용하는 지질 분석 워크플로우 또는 Fiji와 같은 소프트웨어에서 자동 임계값 설정을 포함하는 기술과 비교할 때, LipidUNet은 지질 입자 식별 시 작은 오류율로 반영되는 가변 지질 증착을 사용하여 이미지 전반에 걸쳐 편향되지 않고 신뢰할 수 있는 분할을 제공합니다(그림 7). 이 소프트웨어를 사용하면 사용자가 추가 훈련 이미지를 입력할 수 있으므로 프로토콜에 설명된 대로 40배 배율 대물렌즈를 사용하는 이미지 세트 또는 다른 지질 마커를 사용하는 이미지 세트를 넘어 분석할 수 있습니다. 앞으로 이 소프트웨어는 지질 침전물의 정량화가 가능하도록 3D 이미지를 분석하도록 훈련될 것입니다. 병리학의 주요 원인으로 지질 침착을 수반하는 퇴행성 안질환이 만연하고 있으며, 노인 인구가 증가함에 따라 사례가 증가할 것으로 예상된다13. 이 프로토콜에 설명된 대로 정확한 질병 모델과 효율적인 분석 도구를 사용하면 새로운 치료 개입을 개발할 수 있습니다.

망막 색소 상피(RPE)는 망막 광수용체에 인접한 눈 뒤쪽에 위치한 세포의 단층입니다. RPE는 광수용체에 대사 및 구조적 지원을 제공하여 적절한 시력을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 건강한 RPE 세포는 뚜렷한 육각형 형태가 특징입니다. 그것들은 긴밀한 접합부로 연결되어 RPE가 기저부에 위치한 융모막 모세 혈관과 정점에 위치한 광 수용체 사이의 장벽 역할을 할 수 있습니다. 망막 생태계를 유지하기 위해 RPE는 RPE1에서 포도당 소비를 최소화하는 방식으로 포도당과 같은 주요 대사 산물을 광수용체로 셔틀합니다. 이러한 제한으로 인해 RPE는 지방산을 포함한 대사 요구를 유지하기 위해 다른 대사 산물에 의존하며, RPE는 β 산화를 통해 케톤으로 전환됩니다2. 광수용체 외분절(POS) 소화에서 재활용될 가능성이 있는 지방산을 에너지원으로 활용하는 RPE의 성향을 감안할 때, RPE의 지질 처리 경로에 대한 해로운 변화는 종종 단일 유전자 및 다유전자 퇴행성 망막 질환을 유발하거나 연루됩니다3.
RPE 변성을 유발하는 다유전자성 퇴행성 안구 질환인 연령 관련 황반변성(AMD)도 RPE 단층의 비정상적인 자가포식 및 지질 대사와 관련이 있습니다. 기능 장애가 있는 RPE 단층이 POS를 처리하고 다른 중요한 기능을 수행하지 못하면 RPE와 Bruch 막 사이에 위치한 기저 선형 침전물(BLinD)이라고 하는 세포외(하위 RPE) 침전물이 발생하며, 이는 AMD 병리의 특징입니다. BLinD의 주요 성분에는 지단백질이 포함되며, 그 중 가장 풍부한 것은 아포지단백 E(APOE)4입니다. BLinD의 얇은 층이 축적되면 AMD 5,6의 임상 증상으로 인식되는 부드러운 드루젠이 발생할 수 있습니다.
몇몇 그룹은 RPE 기능장애를 유발하는 줄기 세포 유래 시험관내 질환 모델이 서브-RPE 지질 축적을 특징으로 한다는 것을 보여주었다 7,8,9. Hallam et al. (2017)은 CFH 유전자의 다형성으로 인해 AMD 위험이 높은 환자로부터 유도 만능 줄기 세포 유래 RPE(iRPE)를 생성했습니다. iRPE는 APOE에 의해 표시된 바와 같이 드루젠 축적을 보였고, 고위험 RPE는 저위험 환자로부터 생성된 iRPE보다 더 많은 침전물을 축적했다10.
지질 방울 및 드루젠 침착과 같은 AMD의 세포 특징을 요약하는 시험관 내 모델을 만들기 위해 이전에 발표된 발달 유도 프로토콜11을 사용하여 환자 혈액 샘플에서 생성된 iRPE 라인을 설정했습니다. iRPE는 AMD의 가능한 원인 중 하나를 모방하는 아나필라톡신을 함유한 용액인 보체 적격 인간 혈청(CC-HS)에 노출되었다: 증가된 대체 보체 신호 전달8. 지질 침전물의 결과적인 세포 및 세포 내 침착은 일반적으로 사용되는 지질 및 지단백질 마커인 APOE, Nile Red 및 BODIPY를 사용하여 측정되었습니다. 이들 마커를 통해, CC-HS를 통한 활성화된 보체 신호전달이 iRPE 세포에서 지질 축적을 악화시킨다는 것을 보여주었다8.
단일 유전자 망막 퇴행성 질환에 대한 질병 모델을 개발하기 위해 RPE의 ABCA4 유전자 돌연변이로 인해 발생하는 질병인 스타가르트병 환자로부터 iRPE 라인을 개발했습니다. ABCA4 가 녹아웃되면 높은 수준의 인지질과 광 의존성 지질 과산화 생성물을 포함하는 것으로 알려진 세포 내 침전물인 A2E 리포푸신이 RPE12 내부에 축적되는 것으로 나타났습니다. ABCA4 녹아웃 라인은 환자 라인과 함께 개발되었으며 둘 다 POS 공급을 받았습니다. Stargardt iRPE는 BODIPY 염색으로 정량화된 증가된 지질 축적을 나타내는 POS 식균 작용 유발 병리를 입증했습니다. ABCA4 KO iPSC에서 유래한 RPE는 CC-HS 처리를 받았습니다. BODIPY 신호의 정량화는 스타가르트병 모델에서도 지질 처리에 결함이 있는 것으로 나타났다9.
이러한 질병의 유병률과 효과적인 치료법의 필요성을 감안할 때, 위에서 설명한 관련 질병 모델과 함께 잠재적 치료법의 효능을 정량화하기 위한 강력한 방법을 확립할 필요가 있습니다. 객관적이고 자동화되고 표준화된 방식으로 지질 침전물을 정량화하기 위해 머신 러닝 기반 소프트웨어인 LipidUNet이 만들어져 마스크 분석 도구와 함께 사용할 때 일반적인 마커인 Nile Red, BODIPY 및 APOE를 사용하여 지질 침착을 빠르고 효과적으로 식별할 수 있습니다. 그런 다음 이 분석 파이프라인을 사용하여 얻은 요약 통계를 분석하고 그래픽으로 표시하여 치료 조건을 쉽게 비교할 수 있습니다. 프로토콜의 회로도는 그림 1에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> 그림 1: 프로토콜 개략도: RPE 세포는 96웰 플레이트에서 성장되고 활성 인간 혈청 또는 정제된 소 외부 세그먼트로 챌린지되어 시험관 내에서 다양한 유형의 망막 변성을 모델링합니다. RPE 세포는 Nile Red, BODIPY 및 APOE를 사용하여 지단백질 침전물을 위해 고정되고 염색됩니다. 컨포칼 현미경은 형광 표지된 지질 입자의 Z 스택을 획득하는 데 사용되며, 이후 2D 최대 강도 투영으로 처리됩니다. 기계 학습 알고리즘은 지단백질 입자를 인식하고 정확하게 분할하도록 훈련되었습니다. 입자 수 및 다양한 형상 메트릭이 포함된 요약 테이블이 생성되며 후속 플로팅 및 통계 분석에 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Steriflip filter system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine, Fraction V</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21431</td>
			<td>APOE secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOE primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complement competent human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1-LITER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71870-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod Outer Segments (OS)</td>
			<td>InVision Bioresources</td>
			<td>98740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Ultrapure</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14701SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidunet-machine learning-based method of characterization and quantification of lipid deposits using ipsc-derived retinal pigment epithelium

망막 색소 상피(RPE)는 눈 뒤쪽에 위치한 육각형 세포의 단층입니다. 광수용체와 맥락막 모세혈관에 영양과 지원을 제공하고, 광수용체 외분절(POS)의 식균작용을 수행하며, 외망막의 항상성을 유지하기 위해 분극화된 방식으로 사이토카인을 분비합니다. 돌연변이, 노화 및 환경적 요인으로 인한 기능 장애 RPE는 다른 망막층의 퇴행을 초래하고 시력 상실을 유발합니다. 퇴행성 RPE의 특징적인 표현형 특징은 세포 내 및 세포 내 지질이 풍부한 침전물입니다. 이러한 침전물은 다양한 망막 퇴행성 질환에 걸쳐 공통적인 표현형입니다. 시험관 내에서 단일 유전자 망막 변성의 지질 침착 표현형을 재현하기 위해 환자의 섬유아세포에서 유도 만능 줄기 세포 유래 RPE(iRPE)를 생성했습니다. Stargardt 및 후기 발병 망막 변성(L-ORD) 질환 환자에서 생성된 세포주를 7일 동안 POS를 공급하여 RPE 생리 기능을 복제하여 이러한 질병에서 POS 식균 작용 유발 병리를 유발했습니다. 대체 보체 활성화와 관련된 다원성 질환인 연령 관련 황반변성(AMD)에 대한 모델을 생성하기 위해 iRPE는 대체 보체 아나필라톡신에 도전했습니다. 세포 내 및 세포 내 지질 침전물은 나일 레드, 붕소-디피로메텐(BODIPY) 및 아포지단백 E(APOE)를 사용하여 특성화되었습니다. 지질 침전물의 밀도를 정량화하기 위해 기계 학습 기반 소프트웨어인 LipidUNet이 개발되었습니다. 이 소프트웨어는 배양 표면에서 iRPE의 최대 강도 투영 이미지에 대해 훈련되었습니다. 앞으로는 3차원(3D) 이미지를 분석하고 지질 방울의 부피를 정량화하는 훈련을 받을 예정입니다. LipidUNet 소프트웨어는 질병 모델에서 지질 축적을 감소시키는 약물을 발견하는 데 유용한 리소스가 될 것입니다.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of cells located in the back of the eye adjacent to retinal photoreceptors. RPE plays a vital role in maintaining proper vision by providing metabolic and structural support to the photoreceptors. Healthy RPE cells are characterized by a distinct hexagonal morphology. They are connected by tight junctions, which allow the RPE to act as a barrier between the choriocapillaris located on its basal side and photoreceptors located apically. To maintain the retinal ecosystem, RPE shuttles key metabolites, e.g., glucose, to photoreceptors in a way that minimizes glucose consumption in the RPE1. Due to this limitation, RPE depends on other metabolites to maintain their metabolic needs, including fatty acids, which RPE converts to ketones through &#946;-oxidation2. Given the propensity of RPE to utilize fatty acids, which are likely recycled from photoreceptor outer segment (POS) digestion, as an energy source, detrimental changes to the lipid processing pathways in RPE often lead to, or are implicated in, both monogenic and polygenic degenerative retinal diseases3.
Age-related macular degeneration (AMD), a polygenic degenerative eye disease that causes RPE degeneration, has also been linked to aberrant autophagy and lipid metabolism in the RPE monolayer. The failure of a dysfunctional RPE monolayer to process POS and perform other critical functions leads to extracellular (sub-RPE) deposits called basal linear deposits (BLinD) located between the RPE and Bruch&#39;s membrane - a hallmark of AMD pathologies. Major components of BLinD include lipoproteins, the most abundant of which is apolipoprotein E (APOE)4. Accumulation of thin layers of BLinD can lead to soft drusen, which is recognized as a clinical symptom of AMD5,6.
Several groups have shown that stem cell-derived in vitro disease models that cause RPE dysfunction feature sub-RPE lipid accumulation7,8,9. Hallam et al. (2017) generated induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) from patients with a high risk for AMD due to a polymorphism of the CFH gene. The iRPE showed drusen accumulation, as marked by APOE, and the high-risk RPE accumulated larger deposits than iRPE generated from low-risk patients10.
To create an in vitro model that recapitulates cellular hallmarks of AMD, such as lipid droplets and drusen deposition, iRPE lines generated from patient blood samples were established using a previously published developmentally guided protocol11. The iRPE were subjected to complement-competent human serum (CC-HS), a solution containing anaphylatoxins that mimic one possible cause of AMD: increased alternate complement signaling8. The resulting cellular and sub-cellular deposition of lipid deposits was measured using commonly used lipid and lipoprotein markers, APOE, Nile Red, and&#160;BODIPY. Through these markers, it was shown that activated complement signaling via CC-HS exacerbated lipid accumulation in iRPE cells8.
To develop a disease model for a monogenic retinal degenerative disease, iRPE lines were developed from patients with Stargardt disease, a disease caused by mutations to the ABCA4 gene in RPE. It has previously been shown that when ABCA4 is knocked out, A2E lipofuscin, an intracellular deposit known to contain high levels of phospholipids and light-dependent lipid peroxidation products, accumulates inside the RPE12. ABCA4 knockout lines were developed alongside the patient lines, and both were subjected to POS feeding. The Stargardt iRPE demonstrated POS phagocytosis-induced pathology, exhibiting increased lipid accumulation quantified by BODIPY staining. RPE derived from ABCA4 KO iPSCs were subjected to CC-HS treatment; quantification of the BODIPY signal showed a defect in lipid handling in the Stargardt disease model as well9.
Given the prevalence of these diseases and the need for effective therapeutics, along with the relevant disease models described above, there is a need to establish robust methods for quantifying the efficacy of potential treatments. To quantify lipid deposits in a way that is objective, automated, and standardized, a machine-learning-based software, LipidUNet, was created so that, when paired with mask analysis tools, lipid deposition can quickly and effectively be identified using the common markers Nile Red, BODIPY, and APOE. The summary statistics obtained using this analysis pipeline can then be analyzed and displayed graphically, allowing for easy comparison of treatment conditions. The schematic of the protocol is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic of the protocol: RPE cells are grown on a 96-well plate and challenged with active human serum or purified bovine outer segments to model different types of retinal degenerations in vitro. RPE cells are fixed and stained for lipoprotein deposits with Nile Red, BODIPY, and APOE. A confocal microscope is used to acquire Z-stacks of fluorescently-labeled lipid particles, which are subsequently processed into 2D maximum intensity projections. A machine-learning algorithm was trained to recognize and correctly segment lipoprotein particles. Summary tables containing particle count and various shape metrics are generated and can be used for subsequent plotting and statistical analysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

저자 스포트라이트: 연령 관련 황반변성의 발병기전 규명 및 잠재적 치료법 발견 

LipidUNet-iPSC 유래 망막 색소 상피를 이용한 지질 침전물의 특성화 및 정량화의 기계 학습 기반 방법

In this study, we aim to understand the age-related macro degeneration pathogenesis and find the potential treatment for it. This semi-automated pipeline for lipid droplet analysis provides a robust system to study metabolism and aging diseases. Our lab focuses on finding drug targets for the treatment of AMD either using genetic or small molecule screens that aimed at reducing the accumulation of lipid deposits.

이 프로토콜은 나일 레드, BODIPY 및 APOE로 염색된 지질 침전물을 식별하는 워크플로우를 제공합니다. 개발된 소프트웨어는 지질 침전물을 자동으로 식별하고 정량화할 수 있으며 요약된 프로토콜이 최적화될 때 최상의 성능을 발휘합니다. 셀 모델의 품질이 적절한 이미지 분할의 품질에 큰 영향을 미치기 때문에 성공적으로 차별화된 RPE(그림 3A)와 제대로 분화되지 않은 RPE(그림 3B)의 예가 포함됩니다.
프로토콜에 설명된 세 가지 마커 중 두 가지인 Nile Red와 BODIPY는 형광 이미지에서 뚜렷하게 밝은 작은 원형 점으로 식별됩니다(그림 5 및 그림 6). 프로토콜의 "긍정적인" 이미지는 이러한 별개의 퇴적물의 적절한 식별이 될 것입니다(그림 5A-D 및 그림 5E-H). "부정적인" 결과는 약한 염색(그림 6A-C 및 그림 6D-F) 또는 높은 배경 강도(그림 6G-I)로 인해 배경 형광을 침전물로 착각하여 이미지의 잘못된 분할을 보여줍니다.
APOE 퇴적물은 다양한 크기와 모양을 가지고 있으며, 나일 레드와 BODIPY의 원형 퇴적물보다는 타원형 또는 불규칙하게 보입니다. 이러한 침전물은 또한 덜 점착적이며, 신호 강도는 샘플의 투과화의 변화로 인해 침전물 간에 다를 수 있습니다. 정확한 식별은 덜 포화된 퇴적물을 포함하여 각 퇴적물을 식별하지만(그림 5I-L), 잘못된 분할은 이러한 퇴적물을 포착하지 않습니다(그림 6J-L). 따라서 급격한 변화를 피하기 위해 염색 및 이미징 방법을 최적화하는 것이 중요합니다. 이를 수행하는 한 가지 방법은 면역염색을 하는 동안 샘플 투과화 단계에 주의를 기울이는 것입니다. 형광 신호를 최적화하기 위해 APOE에 대한 고정 및 면역염색 전에 세포를 용해할 수 있으며, 그 결과 APOE 침전물이 균일하게 포화되고 더 잘 분할됩니다.
또한 96 웰 플레이트 이외의 배양 플랫폼 상에서 성숙된 세포의 분할된 이미지도 제공된다. LipidUNet 소프트웨어는 트랜스웰에서 배양된 세포의 이미지에서 실행되었으며, 지질 침전물이 임계값이 되는 동안 트랜스웰 멤브레인의 기공도 임계값이 됩니다(그림 6M-O). 모양과 크기의 유사성으로 인해 현재 형태의 LipidUNet 소프트웨어는 지질 침전물과 트랜스웰 기공을 무차별적으로 마스킹합니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> 그림 5: 대표 결과. (A,E,I) 96웰 도금 RPE는 Hoechst 핵 염색(파란색)과 나일 레드(자홍색), BODIPY(녹색) 또는 APOE(주황색)로 염색되며 Z-스택의 최대 강도 투영입니다. (비, 에프, 제) 이미지 처리 후 LipidUNet 소프트웨어에 대한 그레이스케일 입력 이미지입니다. (씨, 지, 케이) 모든 침전물이 올바르게 식별되는 LipidUNet에 의해 생성된 마스크입니다. (D, H, L) 마스킹된 각 파티클의 윤곽선에는 번호가 매겨져 있습니다. 이 레이블을 사용하면 이미지의 각 입자를 원시 데이터가 있는 스프레드 히트의 항목에 연결할 수 있습니다. (A-D)는 나일 레드 염색을 보여주며, 소프트웨어는 약한 신호에도 불구하고 배경에 대한 침전물을 정확하게 인식할 수 있습니다. (EH)는 BODIPY 신호와 배경 사이에 강한 대비를 보여 이상적입니다. LipidUNet은 이미지의 모든 침전물을 정확하게 식별합니다. (I-L)은 강한 APOE 신호를 나타내며 이 염색에서 종종 볼 수 있는 신호 포화의 가변성을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고 이미지 분할은 각 APOE 퇴적물의 경계를 식별할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> 그림 6: 최적이 아닌 결과. (A,D,G,J,M) 96웰 도금 RPE는 Hoechst 핵 염색(파란색)과 나일 레드(자홍색), BODIPY(녹색) 또는 APOE(주황색)로 염색되며 Z-스택의 최대 강도 투영입니다. (비, E, H, K, N) 이미지 처리 후 LipidUNet 소프트웨어에 대한 그레이스케일 입력 이미지입니다. (씨, 에프, 나, 리, 오) LipidUNet에 의해 생성된 잘못된 마스크입니다. 빨간색 원은 소프트웨어가 지질 침전물을 잘못 식별한 위치를 나타냅니다. (ᄀ씨) Nile Red 처리는 소프트웨어가 배경 염색을 침전물로 식별했기 때문에 올바르지 않습니다. 이것은 배경이 높지만 이미지에 지질 침전물이 거의 없을 때 더 자주 발생할 수 있습니다. BODIPY 염색의 두 가지 예가 표시됩니다: (D-F) 약한 BODIPY 염색으로 인한 저품질 이미지 및 (G - I) 높은 배경의 강한 BODIPY 신호. 두 경우 모두 소프트웨어는 핵을 둘러싼 배경 원형 고리와 작은 원형 지질 침전물을 구별할 수 없습니다. 이러한 오류를 방지하기 위해 염색 및 이미징을 최적화해야 하지만 최신 버전의 LipidUNet은 이러한 이미지에 대해 크게 개선되었습니다. (J-L) APOE 세그멘테이션이 잘못되었습니다. 침전물은 신호의 크기와 포화도가 더 다양하기 때문에 소프트웨어는 일부 침전물을 인식하는 데 어려움이 있습니다. (모) RPE는 트랜스웰에 씨를 뿌리고 나일 레드로 염색했습니다. Z 스택의 한 조각은 나일 레드 지질 침전물과 트랜스웰 기공과 함께 여기에 표시됩니다. 소프트웨어는 트랜스웰 기공을 포함하는 빨간색 원과 나일강 적색 퇴적물을 가리키는 녹색 화살표로 표시된 것처럼 둘을 구별할 수 없습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> 그림 7: 마스크 도구 비교. (A,B,C) 다양한 양의 지질 침착이 있는 96웰 도금 RPE는 나일 레드(빨간색)로 식별됩니다. 이미지는 세 가지 일반적인 마스킹 방법인 Find Maxima, Max Entropy 및 Renyi Entropy를 사용하여 마스킹되고 LipidUNet 생성 마스크와 비교됩니다. 원본 이미지에는 지질 침전물의 수동 카운트가 수반되는 반면, 마스크는 각 분할 방법에 따라 예측된 카운트를 표시합니다. 평균 오류율은 다음 공식을 사용하여 각 분할 방법에 대해 계산되었습니다: mean[(|예측 카운트 - 수동 카운트|/수동 카운트) x 100]. LipidUNet 생성 마스크는 다른 마스킹 방법과 비교할 때 가변 증착을 사용하여 이미지에서 지질 침전물을 보다 정확하게 식별합니다(평균 오류율: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropy, 203% Renyi Entropy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>구성 요소</td>
			<td>고양이 번호</td>
			<td>주식 Conc.</td>
			<td>최종 결론.</td>
			<td>mL</td>
		</tr><tr><td>MEM 알파</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>해당 없음</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>N2 보충제</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>해당 없음</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>해당 없음</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10m엠</td>
			<td>0.01 밀리엠</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>소듐 피루브산</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100mM</td>
			<td>1mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/mL</td>
			<td>100U/mL</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>황소자리</td>
			<td>T4571 시리즈</td>
			<td>50mg/mL</td>
			<td>250ug/mL</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>하이드로코르티손</td>
			<td>H6909 시리즈</td>
			<td>18.1mg/리터</td>
			<td>20ug/리터</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516 시리즈</td>
			<td>20ug/리터</td>
			<td>0.013ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">총 부피, mL</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>표 1: RPE-MM 시약 조성. RPE-MM에 대한 시약 및 최적 농도 목록.

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눈의 망막 색소 상피층에 영향을 미치는 퇴행성 안구 질환은 단일 유전자 및 다유전자 기원을 가지고 있습니다. 여러 질병 모델과 소프트웨어 응용 프로그램인 LipidUNet이 질병의 메커니즘과 잠재적인 치료 개입을 연구하기 위해 개발되었습니다.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

이 연구에서는 노화와 관련된 거대 변성 발병 기전을 이해하고 이에 대한 잠재적인 치료법을 찾는 것을 목표로 합니다. 지질 액적 분석을 위한 이 반자동 파이프라인은 대사 및 노화 질환을 연구할 수 있는 강력한 시스템을 제공합니다. 우리 연구실은 지질 침전물의 축적을 줄이기 위한 유전자 또는 저분자 스크리닝을 사용하여 AMD 치료를 위한 약물 표적을 찾는 데 중점을 둡니다.

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

1.7K 조회수.  National Institutes of Health (NIH). 이 연구에서는 노화와 관련된 거대 변성 발병 기전을 이해하고 이에 대한 잠재적인 치료법을 찾는 것을 목표로 합니다. 지질 액적 분석을 위한 이 반자동 파이프라인은 대사 및 노화 질환을 연구할 수 있는 강력한 시스템을 제공합니다. 우리 연구실은 지질 침전물의 축적을 줄이기 위한 유전자 또는 저분자 스크리닝을 사용하여 AMD 치료를 위한 약물 표적을 찾는 데 중점을 둡...

비디오: 저자 스포트라이트: 연령 관련 황반변성의 발병기전 규명 및 잠재적 치료법 발견 

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.

연구

생물학

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits

To begin, dissolve Nile Red powder in acetone at three milligrams per milliliter concentration. Incubate the solution for 15 minutes at room temperature with periodic mixing. Filter the solution using a 0.22-micrometer filter once or twice depending on the amount of precipitate remaining in the solution.Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-500 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution to the paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate for 30 minutes at room temperature on a shaker protecting from light. After incubation, wash the samples twice with DPBS, then add 200 microliters of DPBS, and store them at four degrees Celsius.For BODIPY staining, prepare a 3.8-millimolar stock concentration by dissolving BODIPY in anhydrous DMSO. Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-300 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution of BODIPY to paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate overnight on a rocker at room temperature.The next day, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius. For APOE immunostaining, prepare a buffer solution by combining DPBS with 1%BSA, 0.5%Tween 20, and 0.5%Triton X-100. Block and permeabilize the paraformaldehyde-fixed RPE cells in 200 microliters of buffer solution for one hour.After incubation, add APPLE primary antibody diluted at one-to-100 in the buffer solution and incubate overnight at room temperature. The following day, wash the samples twice with DPBS. Then add 200 microliters of secondary antibody solution diluted at one-to-1000 for one hour at room temperature.After incubation, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius.

망막하 색소 상피(RPE) 침전물의 염색

Image Processing of REP Deposits, Segmentation, and Quantification

Using a confocal microscope and a 40X objective, create a scan profile with the appropriate fluorescent channels for the lipid marker used. After setting up the acquisition mode and channels, optimize the focus strategy by clicking on Software Autofocus. Then set the range of the Z Stack to 20 microns.After this, optimize tiles and open the viewer to select the tile positions. Next, using a batch image processing method, create maximum projections of each Z Stack with the extended depth of focus method. Before exporting the images, set the compression to none and ensure original data is checked.The resulting image is a maximum projection gray scale TIFF of only the fluorescence channel, expressing the lipid marker. Identify the TIFF images representing either Nile Red, BODIPY, or APOE and move them into the Images folder within a directory named either Nile Red, BODIPY, or APOE, depending on the method being used. Open the lipid unit software.In the Predict tab, select the relevant directory by clicking on the ellipsis and navigating to the named directory. Confirm that lipid unit has identified the images correctly by checking the class entry. Click Predict to observe the task progress, then using the Mask Analysis tool, iterate through the generated masks and provide a quantitative count of the threshold lipid deposits from the mask images.Successful differentiation and maturation of RPE showed a confluent monolayer with pigmentation and polygonal morphology. In contrast, unsuccessful differentiation showed clusters of dying cells. In fluorescent images, Nile Red and BODIPY deposits appeared as small, bright circular points.A negative result shows incorrect image segmentation by mistaking background fluorescence as a deposit, either due to weak staining or high background intensity. APOE deposits varying in size, shape, and signal intensity and requiring optimization of staining and imaging methods to minimize variation are shown.