이 기술의 주요 장점은 자극 전에 세포가 균등하게 분산된 다음 탠덤 세포 접착에서 균등하게 자극된다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실대학원생 인 기무라 아즈마(Azuma Kimura)가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 RPMI 1640의 6 밀리리터를 얼음에서 섭씨 4도까지 냉각된 튜브로 옮긴다.
냉각된 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 지하 멤브레인 매트릭스 2밀리그램을 추가합니다. 밀리리터당 0.33 밀리그램의 농도를 가진 지하 막 매트릭스로 만들기 위해 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞으세요. 다음으로, 파이펫을 사용하여 희석된 지하 멤브레인 매트릭스의 2밀리리터를 6웰 세포 배양 판의 각 웰로 옮킨다.
60~90분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 이 후, 사용할 준비가 될 때까지 최대 3 시간 동안 실온에서 접시를 유지합니다. 첫째, 사용된 매체를 흡습하고 파이펫을 사용하여 각 웰에 0.5 밀리미터 EDTA의 2밀리리터를 추가하여 6웰 플레이트에서 배양된 hPCS를 세척한다.
그런 다음 우물에서 EDTA를 흡입하고 각각 의 2 밀리리터를 각각 의 0.5 밀리롤라 EDTA에 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 이 후, 각 우물에서 EDTA를 흡인.
실온에서 hPSC 유지 보수 매체 1밀리리터를 추가하여 각 웰에 10 개의 마이크로 몰러 Y27632로 보충하십시오. 파이펫은 부드럽고 빠르게 플레이트에 부착 된 세포를 날려 단일 세포로 응집 된 세포를 해리합니다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 셀 서스펜션을 전달하여 4밀리리터의 hPSC 유지 보수 매체를 함유하고 있으며, 10마이크로몰러 Y27632로 보충하고 파이펫팅으로 혼합한다.
다음으로, 튜브에 15 마이크로리터의 셀 서스펜션을 15 마이크로리터와 혼합합니다. 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 희석된 셀 서스펜션의 10 마이크로리터를 셀 카운팅 슬라이드로 중복으로 전송합니다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산하고 셀 서스펜션의 세포 밀도를 계산합니다.
셀 현탁액을 50 밀리리터 튜브에 할당하여 각 웰에 대해 1~100만 개의 세포밀도로 배분한다. 원심 분리는 200 배 G와 실온에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 그 후, 파이펫을 사용하여 수퍼내를 흡인하고 1A 단계 배지의 1밀리리터를 사용하여 세포를 다시 일시 중단한다.
셀 서스펜션을 부드럽게 피펫한 다음 1A 단계 중간크기의 1밀리리터를 더 잘 넣습니다. 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여, 이전에 준비된 세포 배양판의 우물에서 희석된 지하 막 매트릭스를 흡인한다. 즉시 튜브의 서스펜션을 부드럽게 피펫하고 두 밀리리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 옮기습니다.
알루미늄 호일로 접시를 덮고 빛으로부터 보호하고 10~15분 동안 실온에서 깨끗한 벤치에 접시를 놓습니다. 그 후, 플레이트를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소와 가습된 대기로 24시간 동안 조심스럽게 배양식에 옮기는 다. 먼저 플레이트를 부드럽게 흔들고 파이펫을 사용하여 사용된 매체를 흡인시합니다.
그런 다음 각 웰에 DPBS 2 밀리리터를 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 사용 된 DPBS를 흡인합니다. 37°C까지 미리 데워진 스테이지 1B 배지 4밀리리터를 각 웰에 추가합니다.
플레이트를 섭씨 37도에서 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 이산화탄소 5%와 가습된 분위기를 48시간 동안 배양시합니다. 그 후, 접시를 부드럽게 흔들고 사용된 매체를 흡인시합니다. 각 웰에 DPBS의 2 밀리리터를 추가합니다.
이 포부를 반복하고 DPBS를 한 번 더 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들고 사용된 DPBS를 흡인시합니다. 37°C까지 미리 데워진 스테이지 1B 배지 4밀리리터를 각 웰에 추가합니다.
플레이트를 37도의 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고, 이산화탄소는 5%, 가습된 대기를 24시간 동안 배양합니다. 첫째, 접시를 부드럽게 흔들고 사용된 매체를 흡인시합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 DPBS 2밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 접시를 부드럽게 흔들고 사용된 DPBS를 흡인시합니다. 37°C까지 미리 따뜻하게 된 스테이지 2 배지의 밀리리터 4밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소와 가습된 대기로 4일 동안 배양하도록 조심스럽게 옮기습니다.
접시를 부드럽게 흔들고 사용된 매체를 흡인시합니다. 각 웰에 DPBS의 2 밀리리터를 추가합니다. 민국당을 한 번 더 평가하고 추가하는 과정을 반복한다.
그 후, 부드럽게 접시를 흔들고 사용 된 DPBS를 흡인. 3단계 3밀리리터를 37°C로 미리 데워서 각 웰에 넣습니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 이산화탄소 5%와 가습된 대기를 3일 동안 배양합니다.
이 연구에서는 hIPSEs를 전파하는 것이 응축되고 분화에 적합한 균질 한 단층을 형성합니다. 미분화 hIPSEs는 낮은 세포 밀도에서 단일 세포로 해리되고 재시드됩니다. 1 시간 이내에 세포가 접시에 부착되어 돌출을 보이기 시작합니다.
첫날, 세포는 증식되고 표면적의 80~90%를 커버하기 위하여 잘 분포됩니다. 3일과 4일에, 세포는 조약돌 모양으로 설명할 수 있는 균질한 단층 시트를 형성한다. 이 시점에서, 대부분의 세포는 미분화 된 세포에 대한 마커인 SOX2를 발현하는 것을 중단하고, 대신 90% 이상에서 SOX17-양성 세포가 FOXA2를 발현하는 최종 엔도름 마커인 SOX17을 발현한다.
그런 다음 세포는 원시 고프투페 마커, HNF1 베타 및 HNF4-알파를 발현하기 시작하고, 결국 90% 이상에서 췌장 선조 마커PDX1을 발현하고, PDX1양성 세포 유도는 다른 hIPSE 라인, 1231A3, HES 라인, 1231A3 및 HES 라인에서 재현할 수 있다. 단계 마커의 MRNA 발현의 QRTPCR 결과는 면역스테인링과 일치하며 PDX1의 MRNA 발현은 3단계에서 분명하고 그 이후에 실질적으로 증가한다. 미분화 된 ESIPS 세포는 식민지로 재배되기 때문에 개별 세포는 다른 상태로 국각적입니다.
이 프로토콜은 선출된 분화를 위해 세포를 균등하게 자극하는 방법을 제공합니다.
