이 프로토콜에 대한 자금은 NICHD 교내 프로그램에서 KWR(ZIA HD009002-01)에 제공했습니다. 제프 파렐(Jeff Farrell)과 그의 연구실의 유용한 피드백, 윌 앤더슨(Will Anderson)의 탁월한 기술 지원, 프로토콜의 스트레스 테스트 및 방사 조도 측정에 대한 리앤 이아누치(Leanne Iannucci), 제브라피시를 건강하게 유지하기 위해 노력한 NIH 공유 제브라피시 시설에 감사드립니다.

제브라피시에서 광유전학적 신호전달 조작을 이용한 개발 조사

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mRNA 주입은 bOpto-BMP/Nodal을 제브라피시 배아에 전달하기 위한 현재 전략입니다. 이 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, mRNA의 적절한 양은 실험실마다 다릅니다. 사용되는 양은 빛에 노출되어 신호를 강력하게 활성화하기에 충분해야 하지만 의도하지 않은 어두운 활성화 없이 작동해야 합니다. 최적의 mRNA 수준을 찾기 위해 여러 양을 테스트하는 것이 좋으며, 일단 확립되면 동일한 양의 mRNA를 재현성 있게 도입하기 위해 마스터 믹스의 부분 표본을 생성합니다. 둘째, 주입된 mRNA의 불균일한 분포는 불균일한 신호 활성화로 이어질 수 있습니다. 난황이 아닌 세포의 중앙에 주입하면 mRNA 분포도 촉진되는 것으로 생각됩니다. 마지막으로, 주입된 mRNA는 시간이 지남에 따라 분해되기 때문에 이 접근법은 오래된 배아의 실험에 적합하지 않을 수 있습니다. 미래에는 이러한 문제를 모계 또는 약물 유도 프로모터와 함께 bOpto-BMP/Nodal을 유비쿼터스로 발현하는 형질전환 제브라피시 계통에 의해 해결될 수 있습니다. 이러한 맥락에서 잠재적으로 빛에 민감한 성인 제브라피시로 작업하는 것은 어려울 수 있지만 광유전학 도구를 포함하는 제브라피시 61,62 및 초파리 22,34,35,63 형질전환이 성공적으로 개발되었습니다.
의도하지 않은 광활성화를 피하는 것은 광유전학 도구의 일반적인 과제입니다. 단순화를 위해 1.5hpf보다 오래된 주입된 배아는 빛에 민감한 배아로 취급하십시오. 부주의한 빛 노출은 종종 알루미늄 호일로 접시나 접시를 감싸는 것만으로도 피할 수 있습니다. 그러나 1.5hpf 이상의 살아있는 배아를 육안으로 관찰해야 하는 실험의 경우 적색 광원을 사용하거나 LOV-이합체 파장을 차단하는 저렴한 겔 여과지로 백색 광원을 덮을 수 있습니다(재료 표).
여기에 설명된 라이트 박스는 광사 조도 수준, 역학 및 파장을 정밀하게 제어해야 하는 특정 응용 분야를 위해 설계되었습니다(그림 2). 이 라이트 박스의 다른 이점으로는 균일한 광 노출, 무시할 수 있는 부주의한 시료 가열, 여러 개의 6웰 플레이트를 위한 충분한 공간, 수명이 길고 스펙트럼이 잘 특성화된 광원 등이 있습니다. 그러나, 연구 용도에 따라 상이한 광 노광 전략이 바람직할 수 있다. 많은 실험실에서 LED 스트립이 있는 라이닝 인큐베이터, 샘플 위에 LED 패널을 매달거나 배양 접시 뚜껑에 LED를 통합하는 것을 포함하여 더 작은 설치 공간을 가진 더 간단하고 비용 효율적인 균일한 광 노광 시스템을 개발했습니다 32,38,39,40,64,65,66. 중요한 것은 이 프로토콜에 사용된 라이트 박스는 사용자가 개별 웰을 독립적으로 조절하거나(Bugaj et al.52와 대조적으로) 빛 노출에 대한 공간 제어를 제공할 수 없다는 것입니다. 공간적으로 국소화된 광유전학적 활성화는 SPIM 또는 공초점 시스템에서 레이저를 사용하여 각각 bOpto-BMP38 및 bOpto-Nodal39로 입증되었으며, 다양한 모델 시스템에서 다른 많은 광유전학 전략으로도 실현되었습니다(Rogers 및 Müller12에서 논의됨). 일부 접근법은 심지어 세포 내 공간 분해능 29,30,31을 달성했습니다. 공간적으로 국소화된 광 노광 시스템의 구현은 이 프로토콜의 범위를 벗어나지만, bOpto-BMP/Nodal을 사용한 공간 활성화 실험은 디지털 마이크로미러 장치 또는 마스킹 접근 방식과 같은 특수 장비를 사용하여 이론적으로 가능합니다. 독자는 빛 노출 전략을 사용하기 전에 광유전학 실험을 위한 DIY 라이트 박스에 대한 광범위한 문헌을 탐색하는 것이 좋습니다(예: Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar 및 Khammash 53 및 https://www.optobase.org/materials/ 참조).
분자 광유전학 전략은 종종 돌연변이, 이소성 유전자 발현, 재조합 단백질 및 약물과 같은 역사적 접근 방식에 비해 생물학적 과정에 대한 더 높은 수준의 시공간 제어를 제공합니다. 광유전학적 접근법의 이점에 관심이 있는 독자는 제브라피시 및 기타 유기체에서 사용할 수 있는 다른 출판된 도구를 탐색할 수 있습니다. 여기에는 추가적인 신호전달 경로(32,65,67,68)를 조작하고, 유전자 발현(61,64,66,69,70,71)을 조절하고, 단백질 국소화(31,72)를 변경하고, 세포사멸(apoptosis)62을 활성화하는 도구들이 포함된다 . 이러한 도구들과 다른 많은 도구들은 분자 광유전학 접근법28을 위한 선별된 웹 리소스인 OptoBase에 편리하게 분류되어 있다. 새로운 광유전학 도구를 만들고자 하는 사람들을 위해 이 리소스에는 녹색, 적색 및 근적외선 파장에 반응하는 빛에 반응하는 단백질을 포함하여 광범위한 전략에 사용된 빛에 반응하는 단백질에 대한 유용한 설명도 포함되어 있습니다. 우리는 과학계가 분자 광유전학적 접근법의 완전한 잠재력을 깨닫게 되어 기쁩니다.

신호 전달 경로를 통해 세포는 환경에 반응하고 조직 및 유기체 전체 규모에서 활동을 조정할 수 있습니다. 배아 발달에 중요한 신호에는 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원, 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 및 결절 1,2,3이 포함됩니다. 배아 발생 과정에서 이러한 신호와 다른 신호에 의해 조절되는 경로는 유전자 발현과 추가 과정을 제어하여 다양한 조직과 기관이 적절하게 발달하고 상호 작용하도록 함으로써 신체 계획을 패턴화합니다. 선천적 기형과 암을 포함한 병리학은 신호전달 또는 신호전달에 대한 반응이 교란될 때 발생할 수 있다 4,5,6,7. 시그널링에 대한 엄격한 조사에도 불구하고, 레벨과 동역학이 다양한 맥락 8,9,10,11, 특히 개발 과정에서 어떻게 디코딩되는지에 대해서는 훨씬 더 많은 것이 발견되어야 한다 12,13,14,15,16,17,18,19.
시그널링이 디코딩되는 방식을 이해하기 위한 이상적인 실험은 높은 수준의 공간적, 시간적 제어를 통해 시그널링 레벨, 타이밍 및/또는 역학을 조작하고 결과를 평가하는 것입니다. 예를 들어, 발달 조직(20,21)을 패턴화하기 위해 정확한 공간 신호 구배가 제안된다. 신호 기울기 공간 분포를 변경하면 이 가설을 테스트하는 데 도움이 될 것입니다22. 또한, 다양한 세포 반응을 생성하는 데 있어 신호전달 역학의 중요성이 더욱 명확해지고 있다: 동일한 신호전달 경로는 세포가 신호전달 주파수에 따라 분화하거나 증식하도록 지시할 수 있다(예: 9,23). 신호전달 역학을 쉽게 조작할 수 있는 실험적 패러다임은 역학과 세포 운명 결정사이의 관계를 탐구하는 데 유용할 것이다 8,12,13,14,15.
역사적으로, 발달 맥락에서 신호 전달을 조작하기 위해 여러 가지 방법이 사용되어 왔으며, 이는 근본적인 발견으로 이어졌습니다 1,2,3. 신호전달은 pathway loss-loss-of-function mutant, ectopic inhibitor expression 또는 antagonist drugs를 사용하여 차단할 수 있습니다. 신호전달을 활성화하는 방법으로는 작용제 약물, 재조합 리간드, 리간드 또는 구성적으로 활성화된 수용체의 이소성 발현, 및 경로 억제제 기능 상실 돌연변이체가 있습니다. 이러한 방법은 실험 제어의 연속체를 따라 다양합니다. 예를 들어, 돌연변이와 이소성 발현은 연속체의 큰 망치 쪽에 속할 수 있습니다: 이러한 접근법을 사용하면 경로 활성의 극적이고 체계적인 변화로 인해 조기 사망이 발생하고 후기 단계에서 조사가 불가능할 수 있으며, 시간이 지남에 따라 풀기 어려운 다원성 효과가 발생할 수 있습니다. 또한 레벨 또는 지속 시간과 같은 한 번에 하나의 신호 기능을 독립적으로 조작하는 것이 어려운 경우가 많습니다. 연속체의 다른 쪽 끝으로, 시간적 및 때로는 공간적 제어가 있는 약물 또는 재조합 단백질에 샘플을 노출시키는 미세유체 장치 18,24,25 또는 유사한 이점을 제공할 수 있는 열 충격 유도 및 조직 특이적 프로모터를 포함하는 유전적 방법과 같은 일부 방법은 보다 정밀한 실험 제어를 제공합니다16,26,27. 그러나 이러한 방법은 실행하기 어렵고, 가역적이지 않을 수 있으며, 상대적으로 느린 역학 또는 불량한 분해능을 가질 수 있으며, 일부 모델 시스템에서는 사용하지 못할 수 있습니다.
분자 광유전학적 접근법은 이 툴킷에 추가된 강력한 기능입니다. 이러한 접근법은 신호 전달 8,12,13,14,15를 포함한 생물학적 과정을 조작하기 위해 다양한 광 파장에 반응하는 단백질을 사용하며, 세포 배양에서 전체 동물에 이르기까지 다양한 시스템에서 사용하기 위해 수십 년에 걸쳐 개발 되었습니다12,13,28. 과거의 접근법과 비교했을 때, 분자 광유전학은 종종 생물학적 과정에 대한 더 높은 수준의 시공간 제어를 제공할 수 있습니다: 광유전학 시스템의 컨트롤러는 빛이며, 빛의 파장, 강도, 지속 시간 및 노출 주파수의 제어는 비교적 간단합니다. 공초점 및 이광자 현미경과 같은 정교한 시스템을 사용하면 세포 내 범위의 공간 제어가 가능합니다 29,30,31. 신호전달을 광유전학적으로 조작하는 도구들은 Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 및 Huang et al.34에 기술된 것을 포함하여 여러 시스템에서 개발되고 적용되었다. 예를 들어, 광유전학(optogenetics)이 제공하는 공간적 제어(spatial control)를 이용하여, 이 전략은 최근 초파리 배아(Drosophila embryos)의 신호 구배(signaling gradient)를 수정하는 데 사용되었으며, 이는 파리 배아발생(fly embryogenesis)이 이 구배(gradient)의 변화에 놀라울 정도로 견고하다는 것을 보여주었다22. 광유전학적 신호전달 활성제의 가역성 및 빠른 온/오프 동역학은 또한 신호전달 역학 8,12,13,14,15,34,35,36의 디코딩을 조사하기 위한 매력적인 도구가 되었습니다.
초기 제브라피시 배아는 외부 수정이 가능하고, 투명하며, 현미경 검사 친화적이고, 유전적으로 다루기 쉽기 때문에 광유전학 연구에 매우 적합한 생체 내 시스템입니다. 빛에 노출되면 모체 밖에서 발달하는 배아에 전달하기가 더 쉽고, 빛은 불투명하지 않은 조직을 관통하여 접근할 수 있으며, 살아있는 제브라피시 배아는 이미징을 잘 견디며(투명할 뿐만 아니라), 기존의 유전적 방법은 유용한 형질전환유전자의 개발 외에도 녹다운(knockdown) 및 과발현 실험을 위한 직접적인 기회를 제공한다37.
최근에는 청색광에 노출된 제브라피시 배아에서 BMP38 및 Nodal39 신호 전달을 활성화하기 위한 광유전학 도구가 개발되었습니다(그림 1). 이러한 도구를 bOpto-BMP 및 bOpto-Nodal(b는 청색광 활성화, Opto는 광유전학)이라고 합니다. bOpto-BMP/Nodal은 유사한 경로 활성화 메커니즘을 기반으로 합니다. 각각의 수용체 세린-트레오닌 키나아제에 대한 BMP 또는 결절 리간드의 결합은 신호 효과기(BMP의 경우 Smad1/5/9 및 결절의 경우 Smad2/3)의 인산화로 이어지는 수용체 키나아제 도메인 상호 작용을 유도합니다. 그런 다음 인산화된 신호 전달 효과기는 핵으로 전위되어 표적 유전자 발현3을 조절합니다(그림 1A,D). 이러한 수용체 키나아제 상호작용은 수용체 키나아제를 빛에 반응하는 이합체 단백질에 결합시킴으로써 빛에 반응하게 할 수 있습니다: 빛에 노출되면 이러한 키메라 단백질이 이합체화되어 수용체 키나아제 도메인이 상호 작용하고 신호를 활성화해야 합니다(그림 1B,C,E,F). 중요한 것은 내인성 수용체와 달리 bOpto-BMP/Nodal은 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하지 않아 리간드 독립적 활성을 보장한다는 것입니다(그림 1C,F). 이 광유전학적 활성화 전략은 수용체 티로신 키나아제40,41,42로 먼저 달성된 다음 수용체 세린-트레오닌 키나아제에 적용되었습니다.
bOpto-BMP/Nodal은 조류 Vaucheria fridiga AUREO450 단백질(VfLOV)의 청색광 반응성(~1nm) 호모다이머화 광-산소-전압 감지(LOV) 도메인을 사용합니다.43,44. 이러한 구성물은 막-표적화 미리스토일화 모티프와 LOV 도메인에 융합된 BMP 또는 Nodal 수용체 키나아제 도메인으로 구성됩니다(그림 1B,E). 청색광 노출은 LOV 동질화(homodimerization)를 일으켜 각각의 Smad 인산화 및 경로 활성화로 이어지는 수용체 키나아제 도메인 상호 작용을 초래합니다(그림 1C,F). bOpto-BMP의 경우, Acvr1l(Alk8이라고도 함) 및 BMPR1aa(Alk3라고도 함)의 I형 수용체 키나아제 도메인과 BMPR2a의 II형 수용체 키나제 도메인과의 구축물의 조합이 신호전달38(Addgene #207614, #207615 및 #207616)을 최적으로 활성화하는 것으로 밝혀졌습니다. bOpto-Nodal의 경우, Acvr1ba로부터의 유형 I 수용체 키나제 도메인 및 Acvr2ba로부터의 유형 II 수용체 키나제 도메인과의 구축물의 조합이사용된다 39.
bOpto-BMP/Nodal은 단세포 단계에서 mRNA를 주입하여 초기 제브라피시 배아에 도입되었으며, Nodal 해석39에서 신호 지속 시간의 역할을 조사하고, 제브라피시가 Nodal45에 반응하는 능력을 상실하는 이유를 결정하고, BMP 표적 유전자가 다양한 BMP 신호 수준38에 어떻게 반응하는지 조사하는 데 사용되었습니다. 이러한 도구는 향후 다양한 조사에서 계속 유용할 것입니다. 그러나 광유전학적 신호 활성제의 강점은 약점이기도 합니다: 빛에 민감한 샘플은 의도하지 않은 이소성 신호 활성을 피하기 위해 주의해서 처리해야 합니다. 실내 조명이나 햇빛에 노출되면 bOpto-BMP/Nodal이 활성화될 수 있습니다.
이 프로토콜은 초기 제브라피시 배아에서 mRNA 인코딩 LOV 기반 BMP 및 Nodal 활성제를 사용하기 위한 실용적인 제안을 제공합니다. 균일한 빛 노출과 온도를 제어하기 위해 라이트 박스를 구축하는 한 가지 전략을 자세히 설명하는 것으로 시작합니다(그림 2, 보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3, 보충 파일 4, 보충 파일 5, 보충 파일 6, 보충 파일 7, 보충 파일 8). 그런 다음 광유전학적 신호 활성제가 예상대로 작용하는지, 즉 빛에 노출되었을 때만 경로 활성을 활성화하는지 여부를 결정하는 두 가지 주요 제어 실험에 대해 설명합니다(그림 3). 첫 번째 대조군 분석은 빛에 노출된 배아와 노출되지 않은 배아에서 수정 후 1일에 표현형을 검사하는 것입니다(그림 3A). mRNA가 주입된 빛에 노출된 배아(노출되지 않은 배아는 아님)는 표현형 BMP 또는 결절 과발현(그림 4A,B; 특히 BMP 표현형은 이 시점(46)에서 명확하게 구별할 수 있다. 이 분석은 빠른 활성 판독을 제공합니다. 제2 대조군 분석에서, 표현형이 특이적으로 과도한 BMP 또는 결절 신호전달에 의해 유발되는지 여부를 결정하고 신호전달 수준의 변화를 직접 관찰하기 위해, 면역형광 염색을 사용하여 후기/초기 배반기/초기 위축단계 부근에서 20분 동안 빛에 노출된 후 인산화된 신호전달 효과기(각각 pSmad1/5/9 또는 pSmad2/3)를 검출하고, 신호전달 활성이 잘 기술된 경우12, 16,17,47,48,49,50 (그림 3B 및 그림 4C). (bOpto-BMP38 및 bOpto-Nodal39 모두에 대해 공간적으로 국소화된 활성화가 입증되었지만, 이 프로토콜은 균일한 광 노출 및 신호 활성화 전략만 설명합니다.) 이상적인 국소 실험 조건을 결정하기 위해 특정 연구 질문에 bOpto-BMP/Nodal을 적용하기 전에 이러한 대조 실험을 실행하는 것이 좋습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Building a light box &#38; Light exposure protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#8 x 1&#34; Hex Self-drilling Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>99663A222</td>
			<td>1.4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (142 liters)</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>139400</td>
			<td>1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Panel Mount (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Incubator_panel</td>
			<td>1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit</td>
			<td>CO-Z</td>
			<td>SDB0001TA</td>
			<td>1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32&#34; thick black silicone</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5812T12</td>
			<td>1.4.3 
			1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED microplate illuminator</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.1 
			1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 10mm Cube Standoff</td>
			<td>Newark Eletronics</td>
			<td>005.60.533</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A156</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A305</td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memory card thermometer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-081-111</td>
			<td>1.9 
			3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW)</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S170C</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red gel filter paper #E106</td>
			<td>Rosco / B&#38;H Foto &#38; Electronics</td>
			<td>110084014805-E106</td>
			<td>4.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Side Brackets (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Side_bracket</td>
			<td>1.4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Bracket (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Vertical_bracket</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2&#34; wd 1/4&#34; tk</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8694K12</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generating mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZNA MicroElute Cycle Pure Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6293-02</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-30-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-34-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R3189L</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207614</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk8</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207615</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-BMPR2a</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207616</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250 rxns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injecting mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (UltraPure)</td>
			<td>Invitrogen / Thermo Fisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml glass beakers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB100250</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dishes (case of 50)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08 772 1B</td>
			<td>3.1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-8A ball joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>B-8A</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back pressure unit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>BPU</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot switch (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>FWS</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GJ-1 magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish bottoms (for dechorionating)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>08-748A</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (5 3/4&#34; with wide tip)</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>3.1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection dish molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>tu1</td>
			<td>3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP iron plate</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IP</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-152 micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipette holder kit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MIMPH-MPIP-Kit</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometers</td>
			<td>Meiji Techno America</td>
			<td>MA285</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td>3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (10 ml, green)</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottles (500 ml)</td>
			<td>Nalgene / Thermo Scientific</td>
			<td>2402-0500</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic signaling activation in zebrafish embryos

신호 전달 경로는 발달, 재생, 항상성 및 질병을 포함한 기본적인 생물학적 과정을 조율합니다. 시그널링을 실험적으로 조작하는 방법은 이러한 광범위한 컨텍스트에서 시그널링이 어떻게 해석되는지 이해하는 데 필요합니다. 분자 광유전학 도구는 높은 수준의 시공간 제어로 신호 전달 경로 활성의 가역적이고 조정 가능한 조작을 제공할 수 있으며 in vitro, ex vivo 및 in vivo에 적용되었습니다. 이 도구는 청색광 동질화 광-산소-전압 감지(LOV) 도메인과 같은 빛에 반응하는 단백질 도메인을 신호 효과기와 결합하여 신호 전달에 대한 빛에 의존하는 실험 제어를 제공합니다. 이 프로토콜은 광학적으로 접근 가능한 초기 제브라피시 배아에서 LOV 기반 뼈 형태 형성 단백질(BMP)과 결절 신호 활성제인 bOpto-BMP 및 bOpto-Nodal을 사용하기 위한 실용적인 지침을 제공합니다. 적절한 실험 조건을 결정하기 위한 빠른 표현형 분석과 신호 전달을 직접 평가하기 위한 면역형광 분석의 두 가지 대조군 실험에 대해 설명합니다. 이러한 대조군 실험은 초기 제브라피시 배아에서 광유전학 도구를 사용하기 위한 파이프라인을 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 전략은 발달, 건강 및 생리학에서 신호 전달의 역할을 조사할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

Signaling pathways allow cells to respond to their environment and coordinate activities at tissue- and organism-wide scales. Signals crucial for embryonic development include the TGF-beta superfamily members&#160;bone morphogenetic protein (BMP)&#160;and Nodal1,2,3. During embryogenesis, the pathways regulated by these signals and others pattern the body plan by controlling gene expression and additional processes to ensure that diverse tissues and organs develop and interface properly. Pathologies, including birth defects and cancer, can occur when signaling or responses to signaling are perturbed4,5,6,7. Despite&#160;rigorous investigation into signaling, much more remains to be discovered about how levels and dynamics are decoded in a variety of contexts8,9,10,11, especially during development12,13,14,15,16,17,18,19.
To understand how signaling is decoded, an ideal experiment would be to manipulate signaling levels, timing, and/or dynamics-with a high degree of spatial and temporal control-and assess outcomes. For example, precise spatial signaling gradients are proposed to pattern developing tissues20,21. Altering signaling gradient spatial distributions would help test this hypothesis22. Additionally, the importance of signaling dynamics in generating diverse cellular responses is becoming clearer: The same signaling pathway can instruct cells to differentiate or proliferate depending on signaling frequency, for example9,23. Experimental paradigms in which signaling dynamics can be easily manipulated will be valuable to explore the relationship between dynamics and cell fate decisions8,12,13,14,15.
Historically, multiple methods have been used to manipulate signaling in developmental contexts, leading to fundamental discoveries1,2,3. Signaling can be blocked using pathway loss-of-function mutants, ectopic inhibitor expression, or antagonist drugs. Methods to activate signaling include agonist drugs, recombinant ligands, ectopic expression of ligands or constitutively active receptors, and pathway inhibitor loss-of-function mutants. These methods range along a continuum of experimental control. For example, mutants and ectopic expression may fall on the sledgehammer side of the continuum: With these approaches, dramatic, systemic changes in pathway activity may cause early death and preclude investigations at later stages, or over time may result in pleiotropic effects that are difficult to disentangle. Additionally, it is often challenging to independently manipulate one signaling feature at a time, such as level or duration. Toward the other end of the continuum, some methods offer more precise experimental control, such as microfluidic devices that expose samples to drugs or recombinant proteins with temporal and sometimes spatial control18,24,25, or genetic methods, including heat shock-inducible and tissue-specific promoters that can offer similar benefits16,26,27. However, these methods can be difficult to execute, may not be reversible, may have relatively slow kinetics or poor resolution, and may be unavailable in some model systems.
Molecular optogenetic approaches are a powerful addition to this toolkit. These approaches use proteins that respond to different light wavelengths to manipulate biological processes, including signaling8,12,13,14,15, and have been developed over decades for use in a variety of systems from cell culture to whole animals12,13,28. Compared to historical approaches, molecular optogenetics can often offer a higher degree of spatiotemporal control over biological processes: The controller in optogenetic systems is light, and control of light wavelength, intensity, duration, and exposure frequency is relatively straightforward. With sophisticated systems such as confocal and two-photon microscopes, spatial control in the subcellular range is possible29,30,31. Tools to optogenetically manipulate signaling have been developed and applied in several systems, including those described in Johnson et al.22, &#268;apek et al.32, Krishnamurthy et al.33, and Huang et al.34. For example, exploiting the spatial control afforded by optogenetics, this strategy was recently used to modify a signaling gradient in Drosophila embryos, demonstrating that fly embryogenesis is surprisingly robust to changes in this gradient22. The reversibility and fast on/off kinetics of optogenetic signaling activators have also made them attractive tools for investigating the decoding of signaling dynamics8,12,13,14,15,34,35,36.
The early zebrafish embryo is an in vivo system well-suited for optogenetic studies because it is externally fertilized, transparent, microscopy-friendly, and genetically tractable. Light exposure is easier to deliver to embryos that develop outside of the mother, light can penetrate and access their non-opaque tissues, live zebrafish embryos tolerate imaging well (in addition to being transparent), and existing genetic methods provide straightforward opportunities for knockdown and overexpression experiments, in addition to the development of useful transgenics37.
Recently, optogenetic tools were developed to activate BMP38 and Nodal39 signaling in zebrafish embryos with blue light exposure (Figure 1). We refer to these tools as bOpto-BMP and bOpto-Nodal (b for blue light-activated and Opto for optogenetic). bOpto-BMP/Nodal are based on similar pathway activation mechanisms. The binding of BMP or Nodal ligands to their respective receptor serine-threonine kinases drives receptor kinase domain interactions that lead to the phosphorylation of signaling effectors (Smad1/5/9 for BMP and Smad2/3 for Nodal). Phosphorylated signaling effectors then translocate to the nucleus and regulate target gene expression3 (Figure 1A,D). These receptor kinase interactions can be made light-responsive by coupling receptor kinases to light-responsive dimerizing proteins: With light exposure, these chimeric proteins should dimerize, causing the receptor kinase domains to interact and activate signaling (Figure 1B,C,E,F). Importantly, in contrast to endogenous receptors, bOpto-BMP/Nodal do not contain extracellular ligand-binding domains, ensuring ligand-independent activity (Figure 1C,F). This optogenetic activation strategy was first achieved with receptor tyrosine kinases40,41,42 and then applied to receptor serine-threonine kinases.
bOpto-BMP/Nodal use the blue light-responsive (~450 nm) homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain from the algae Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. These constructs consist of a membrane-targeting myristoylation motif followed by either BMP or Nodal receptor kinase domains, fused to a LOV domain (Figure 1B,E). Blue light exposure should cause LOV homodimerization, resulting in receptor kinase domain interactions that lead to respective Smad phosphorylation and pathway activation (Figure 1C,F). For bOpto-BMP, a combination of constructs with the type I receptor kinase domains from Acvr1l (also known as Alk8) and BMPR1aa (also known as Alk3) and the type II receptor kinase domain from BMPR2a was found to optimally activate signaling38 (Addgene #207614, #207615, and #207616). For bOpto-Nodal, a combination of constructs with the type I receptor kinase domain from Acvr1ba and the type II receptor kinase domain from Acvr2ba is used39.
bOpto-BMP/Nodal have been introduced into early zebrafish embryos by injecting mRNA at the one-cell stage, and used to investigate the role of signaling duration in Nodal interpretation39, to determine why zebrafish lose the ability to respond to Nodal45, and to examine how BMP target genes respond to different BMP signaling levels38. It is likely that these tools will continue to be useful in a diverse range of future investigations. However, the strength of optogenetic signaling activators is also their weakness: light-sensitive samples must be treated with care to avoid inadvertent ectopic signaling activity. Exposure to room light or sunlight can activate bOpto-BMP/Nodal.
This protocol provides practical suggestions for using mRNA-encoded LOV-based BMP and Nodal activators in early zebrafish embryos. It begins by detailing one strategy to build a light box to control uniform light exposure and temperature (Figure 2, Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, Supplementary File 5, Supplementary File 6, Supplementary File 7, Supplementary File 8). It then describes two key control experiments that determine whether an optogenetic signaling activator is behaving as expected-i.e., activating pathway activity only when exposed to light (Figure 3). The first control assay involves examining phenotypes at one day post-fertilization in light-exposed and unexposed embryos (Figure 3A). mRNA-injected light-exposed embryos, but not unexposed embryos, should phenocopy BMP or Nodal overexpression (Figure 4A,B; BMP phenotypes in particular are clearly distinguishable at this time point46). This assay provides a fast activity readout. In the second control assay, to determine whether phenotypes are caused specifically by excess BMP or Nodal signaling and to directly observe the change in signaling levels, immunofluorescence staining is used to detect phosphorylated signaling effectors (pSmad1/5/9 or pSmad2/3, respectively) after a 20 min light exposure around late blastula / early gastrulation stage, when signaling activity has been well described12,16,17,47,48,49,50 (Figure 3B and Figure 4C). (Note that, although spatially localized activation has been demonstrated for both bOpto-BMP38 and bOpto-Nodal39, this protocol only describes uniform light exposure and signaling activation strategies.) It is advisable to execute these control experiments prior to applying bOpto-BMP/Nodal to specific research questions in order to determine ideal local experimental conditions.

저자 스포트라이트: 세포 운명 결정을 해독하기 위해 제브라피시 배아의 신호 전달 조작 

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

To establish the embryo's body plan during development cells are thought to decode signaling intensities dynamics and combinations. We are using optogenetics to manipulate these signaling features in zebrafish embryos. This approach will help us understand how embryonic cells decode signaling to make some of the earliest sulfate decisions The optogenetic approaches discussed here use light as a remote control to activate BMP or nodal signaling rapidly and reversibly.Because light exposure is easy to direct, these approaches can offer improved experimental control over signaling. Our protocol introduces using these light sensitive tools in zebrafish embryos. With this improved temporal and spatial control, it should now be possible to perform precise signaling modifications during zebrafish developments.We expect this to deepen our understanding of how cells decode signaling to make faint decisions, which will help reveal how the embryonic body plan develops.

여기에 설명된 두 가지 대조 실험의 목표는 bOpto-BMP/Nodal이 예상대로 빛이 없을 때 신호에 영향을 주지 않고 청색광 노출에 대한 반응으로 각각의 경로를 활성화하는지 여부를 결정하는 것입니다. 관심 있는 연구 질문에 bOpto-BMP/Nodal을 적용하기 전에 이러한 컨트롤을 사용하여 실험실에서 적절한 실험 워크플로우를 설정할 수 있습니다.
표현형 분석은 단 2일 만에 완료할 수 있으며 신호 활성 및 광독성에 대한 유용한 지표를 제공합니다(그림 3A). 주입된 청색광에 노출된 배아는 과도한 BMP 신호전달을 표현해야 한다(ventralization46; 그림 4A, 왼쪽 패널) 또는 결절 신호전달(여분의 중배엽 1,3,47,57,58,59,60(그림 4A, 오른쪽 패널)과 관련된 발달 결함). 주입된 경우 빛에 노출된 배아는 세포성(aphenotypic)이므로 mRNA의 품질을 테스트하고 더 많은 주입을 고려하고 밝은 빛에 지속적으로 노출되도록 광 노출 전략을 다시 확인하십시오(조도가 45W/m2인 ~450nm 빛은 신호 전달을 강력하게 활성화해야 함). 대조적으로, 주입된 노출되지 않은 배아는 주입되지 않은 형제자매와 동일하게 보여야 합니다. 주입된 경우 노출되지 않은 배아는 표현형을 나타내고, 주입된 mRNA의 양을 줄이고, 노출되지 않은 배아가 빛 노출로부터 보호되도록 실험 설정을 재평가합니다. 그림 4B에 표시된 데이터는 적절한 mRNA 양과 노출 조건을 사용한 일반적인 표현형 실험의 결과를 보여줍니다: 주입된 광노출 배아에서 강한 신호 활성이 분명하며, 주입된 노출되지 않은 배아의 극히 일부만이 표현형을 나타냅니다.
표현형 분석은 또한 광독성을 평가할 수 있는 기회를 제공합니다. 광독성이 무시할 수 있는 수준인 경우, 주입되지 않고 빛에 노출된 배아는 주입되지 않고 노출되지 않은 배아와 유사한 야생형으로 나타나야 합니다. 주입되지 않고 빛에 노출된 배아에는 결함이 있지만 주입되지 않은 노출되지 않은 배아에는 결함이 없는 경우 빛 방사 조도를 줄이는 것을 고려하십시오. 45W/m2 의 방사 조도는 명백한 광독성 없이 신호 전달을 강력하게 활성화합니다. 그림 4B 에 나타낸 데이터는 주입되지 않은 광노출된 배아와 주입되지 않은 노출되지 않은 배아 사이에 우려되는 차이를 보여주지 않았으며, 이는 무시할 수 있는 광독성을 나타낸다.
면역형광 분석은 표현형 분석(2일)에 비해 더 많은 시간과 노력(~1주일)이 필요하지만, 면역형광 염색은 신호 전달 경로 활성을 직접 판독할 수 있으며 총 형태학에 반영되지 않을 수 있는 미묘한 신호 변화를 나타낼 수 있습니다. 면역형광은 bOpto-Nodal에 대한 반응을 평가하는 데 특히 중요한데, 과도한 결절 신호전달은 종종 배아가 1 dpf에 의해 용해되는 결과를 초래하기 때문이며, 이는 과잉 BMP 신호전달의 특징인 특정 복화(ventralization) 표현형과 대조적으로 많은 원인이 있을 수 있기 때문입니다(그림 4A). 주입된 청색광 노출 배아는 주입되지 않은 빛에 노출된 배아에 비해 Smad1/5/9 또는 Smad2/3 인산화가 균일하게 증가해야 합니다. 수치가 증가하지 않거나 약간만 증가하면 mRNA의 품질을 테스트하고 더 많은 주입을 고려하고 광 노출 전략을 다시 확인하십시오. 45W/m2 약 40%의 에피볼리(epiboly)의 조도에서 청색광에 20분 동안 노출되면 신호가 강하게 활성화되어야 합니다. pSmad 염색이 균일하지 않은 경우 mRNA를 난황이 아닌 세포 중앙에 주입하면 mRNA 분포가 더 균일해질 수 있습니다.
주입된 노출되지 않은 배아는 주입되지 않은 배아와 비슷한 pSmad 수준을 가져야 합니다. 일화적으로, 우리는 bOpto-BMP보다 bOpto-Nodal에서 더 누출되는 Smad 인산화를 관찰했습니다. 주입된 노출되지 않은 배아에서 pSmad 수준이 증가하면 주입되는 mRNA의 양을 줄이십시오. 또한 1) 노출되지 않은 배아가 실수로 빛에 노출되지 않고 2) 고정 중 빛 노출이 최소화되도록 실험 설정을 재평가합니다. 고정 단계에서는 라이트 박스에서 제거하고 포름알데히드에 담그기까지 45초 이하가 경과하도록 하는 것이 중요합니다. 또한 이 단계에서는 창문 블라인드를 닫거나, 백색 광원을 끄거나, 적색광을 사용하거나, 청색광 차단 젤 여과지로 백색 광원을 덮어 실내 빛과 햇빛에 대한 노출을 최소화합니다(재료 표).
그림 4C의 데이터는 적절한 mRNA 양과 빛 노출 조건을 사용한 일반적인 면역형광 염색 실험의 결과를 보여줍니다: pSmad 수준은 주입되지 않은 배아와 노출되지 않은 배아에서 유사한 반면, 주입된 빛에 노출된 배아는 더 높은 수준의 Smad 인산화를 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig01.jpg"> 그림 1: bOpto-BMP 및 -Nodal 신호 활성화 전략 . (A) 내인성 BMP 신호 전달 경로는 BMP 리간드 결합에 의해 활성화되어 유형 I/II 수용체 복합체의 형성, Smad1/5/9의 인산화 및 BMP 표적 유전자의 발현으로 이어집니다. 유형 I 수용체 BMPR1aa 및 Acvr1l은 각각 Alk3 및 Alk8로도 알려져 있습니다. BMPR2a는 II형 수용체입니다. (B) bOpto-BMP 구성물38. BMPR1aa 및 Acvr1l의 추정 키나아제 도메인은 LOV에 융합됩니다. BMPR2a-LOV 융합은 추정 키나아제 도메인과 수용체 C-말단 도메인(CTD)을 포함합니다. 모든 융합체는 미리스토일화 모티프(Myr)로 막을 표적으로 합니다. 도메인은 글리신-세린(GS) 링커로 구분됩니다. 구성은 CTD에서 HA 에피토프 태그로 태그가 지정됩니다. 이러한 세 가지 구성물의 조합은 BMP 시그널링을 최적으로 활성화하는 것으로 밝혀졌다. (C) bOpto-BMP-매개 BMP 신호 활성화. 청색광에 노출되면 LOV 도메인이 이합체화되어 복잡한 형성 및 신호 활성화를 유발하는 것으로 생각됩니다. (D) 내인성 결절 신호 전달 경로는 결절 리간드 결합에 의해 활성화되어 유형 I/II 수용체 복합체의 형성, Smad2/3의 인산화 및 결절 표적 유전자의 발현으로 이어집니다. 유형 I 수용체 Acvr1ba 및 유형 II 수용체 Acvr2ba는 각각 Acvr1b 및 Acvr2b로도 알려져 있습니다. (E) bOpto-Nodal 구성39. Acvr1ba 및 Acvr2ba의 추정 키나아제 도메인은 LOV에 융합됩니다. 모든 융합체는 미리스토일화 모티프(Myr)로 막을 표적으로 합니다. 도메인은 GS 링커로 구분됩니다. 구성은 CTD에서 HA 에피토프 태그로 태그가 지정됩니다. (F) bOpto-Nodal-mediated Nodal 신호전달 활성화. 청색광에 노출되면 LOV 도메인이 이합체화되어 복잡한 형성 및 신호 활성화를 유발하는 것으로 생각됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig02.jpg"> 그림 2: 광유전학 실험을 위한 온도 제어 라이트 박스 . (A) LED 마이크로플레이트 조명기는 맞춤형 LED 홀더를 사용하여 인큐베이터 상단에 장착됩니다. 첫 번째 선반의 6웰 플레이트에 있는 제브라피시 배아는 인큐베이터 상단에 뚫린 구멍을 통해 빛에 노출됩니다. 하단 선반에는 알루미늄 호일로 감싼 6웰 플레이트에 노출되지 않은 대조군 배아의 두 번째 세트가 들어 있습니다. 인큐베이터 도어에는 실내 조명이나 햇빛에 부주의하게 노출되는 것을 방지하기 위해 웨더 스트리핑이 늘어서 있습니다. (B) 스텝 드릴을 사용하여 인큐베이터에 구멍을 만드는 절차의 세부 사항. 여기에 사용된 인큐베이터 모델에는 두 번째로 더 큰 구멍을 뚫어야 하는 내부 패널이 있습니다(재료 표). (C) 3파장 조명 시스템용으로 설계된 맞춤형 LED 홀더의 세부 사항. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig03.jpg"> 그림 3: bOpto-BMP/Nodal 실험 워크플로우. bOpto-BMP/Nodal의 활성을 테스트하기 위한 표현형 분석 및 pSmad 면역형광 염색. 배아는 단세포 단계에서 mRNA를 주입하고 수정 후 1.5시간(hpf)에 라이트 박스로 옮깁니다. (A) 표현형 분석. 주입된 배아와 주입되지 않은 형제자매는 어둠 속에서 사육되거나 수정 후 1일(dpf)까지 1.5hpf에서 시작하여 균일한 청색광에 노출됩니다. 광유전학적 신호 전달 활성은 과도한 경로 활성과 일치하는 표현형에 대해 배아를 채점하여 평가할 수 있습니다. (B) pSmad 면역형광 염색. 주입된 배아와 주입되지 않은 형제자매는 40% 에피볼리(~6hpf)가 될 때까지 어둠 속에서 사육됩니다. 주입된 배아의 절반과 주입되지 않은 배아의 절반은 20분 동안 균일한 청색광에 노출됩니다. 노출 후 모든 배아는 고정되고 pSmad에 대한 면역 형광 염색을 받습니다. pSmad1/5/9 또는 pSmad2/3의 높은 수치는 각각 BMP 또는 결절 신호의 광유전학적 활성화를 반영합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig04.jpg"> 그림 4: 제브라피시 배아의 빛 활성화 신호 반응 평가. 제브라피시 배아를 bOpto-BMP/Nodal을 인코딩하는 mRNA를 단세포 단계에서 주입했습니다. (A) 배아는 어둠 속에서 사육되거나 수정 후 1.5시간(hpf)부터 균일한 청색광에 노출되었습니다. 표현형은 수정 후 1일(dpf)에 점수가 매겨졌습니다. 대표적인 표현형이 표시됩니다. 과도한 BMP 신호전달은 복부화(왼쪽 패널)로 이어지고, 과도한 결절 신호전달은 여분의 중배엽과 관련된 발달적 결함을 유발합니다(오른쪽 패널). 스케일 바 = 500 μm. (B) 표현형 정량화. 주입된 배아와 주입되지 않은 형제자매는 1.5hpf(검은색 전구)에서 시작하여 어둠 속에서 사육되었습니다. 주입된 배아의 절반과 주입되지 않은 배아의 절반은 균일한 청색광(청색 전구)에 노출되었습니다. (C) 주입된 배아와 주입되지 않은 형제자매는 1.5hpf(검은색 전구)에서 시작하여 어둠 속에서 사육되었습니다. 40% 에피볼리(~6hpf)에서 주입된 배아의 절반과 주입되지 않은 배아의 절반이 균일한 청색광(청색 전구)에 노출되었습니다. 20분 후, 모든 배아를 고정하고 인산화된 Smad1/5/9 또는 Smad2/3에 대한 면역형광 염색을 실시했습니다. pSmad 강도가 높을수록 BMP/노드 신호가 각각 증가했음을 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 라이트 박스 전체 조립. 전체 라이트 박스 어셈블리의 3D 뷰를 보여주는 3D PDF 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_1_Light_box_full_assembly_2023-08-15.PDF" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 라이트 박스 분해도. 분해된 라이트 박스 어셈블리의 3D 뷰를 보여주는 3D PDF 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_2_Light_box_exploded_view_2023-08-15.PDF" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: 대형 경량 개스킷. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더용 대형 조명 개스킷을 제작할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_3_Large_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4: 소형 경량 개스킷. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더용 소형 조명 개스킷을 제작할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_4_Small_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 5: 아크릴 플랫폼 베이스. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더 아크릴 플랫폼 베이스를 제작합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_5_Acrylic_platform_base_2023-08-15.DWG" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 6: 아크릴 플랫폼 수직. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더 아크릴 플랫폼 수직으로 제작합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_6_Acrylic_platform_vertical_2023-08-15.DWG" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 7: 아크릴 지지대 왼쪽. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더 아크릴 좌측 지지대를 제작합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_7_Acrylic_support_left_2023-08-15.DWG" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 8 : 아크릴 지지권. CAD 도면 파일(. DWG 형식)을 사용하여 레이저 절단기를 사용하여 LED 홀더 아크릴 오른쪽 지지대를 제작합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_8_Acrylic_support_right_2023-08-15.DWG" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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신호 전달 경로의 광유전학적 조작은 발달, 재생, 항상성 및 질병에서 신호전달이 어떻게 해독되는지 조사하는 강력한 전략이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 제브라피시 배아에서 광-산소-전압 감지 도메인 기반 결절 및 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 신호 활성제를 사용하기 위한 실용적인 지침을 제공합니다.

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

발달 과정에서 배아의 신체 계획을 수립하기 위해 세포는 신호 강도, 역학 및 조합을 해독하는 것으로 생각됩니다. 우리는 제브라피시 배아에서 이러한 신호 전달 기능을 조작하기 위해 광유전학을 사용하고 있습니다. 이 접근법은 배아 세포가 가장 초기의 황산염 결정을 내리기 위해 신호를 해독하는 방법을 이해하는 데 도움이 될 것입니다 여기에서 논의된 광유전학적 접근법은 빛을 원격 제어로 사용하여 BMP 또는 결절 신호를 빠르고 가역적으로 활성화합니다.빛 노출은 지시하기 쉽기 때문에 이러한 접근 방식은 신호에 대한 향상된 실험 제어를 제공할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 제브라피시 배아에서 이러한 감광성 도구를 사용하는 것을 소개합니다. 이렇게 시간적, 공간적 제어가 개선됨에 따라 이제 제브라피시가 발달하는 동안 정확한 신호 수정을 수행할 수 있습니다.이를 통해 세포가 신호를 해독하여 희미한 결정을 내리는 방법에 대한 이해가 깊어질 것으로 기대하며, 이는 배아체 계획이 어떻게 발달하는지 밝히는 데 도움이 될 것입니다.

optogenetic-signaling-activation-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

1.5K 조회수.  NIH. 발달 과정에서 배아의 신체 계획을 수립하기 위해 세포는 신호 강도, 역학 및 조합을 해독하는 것으로 생각됩니다. 우리는 제브라피시 배아에서 이러한 신호 전달 기능을 조작하기 위해 광유전학을 사용하고 있습니다. 이 접근법은 배아 세포가 가장 초기의 황산염 결정을 내리기 위해 신호를 해독하는 방법을 이해하는 데 도움이 될 것입니다 여기에서 논의된 광유전학적 접?...

비디오: 저자 스포트라이트: 세포 운명 결정을 해독하기 위해 제브라피시 배아의 신호 전달 조작 

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

연구

발생학

Injecting bOpto-BMP&#47;Nodal Constructs into Zebrafish Embryos 

Injecting bOpto-BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos   

To begin, use an incubator and an LED Microplate Illuminator to create a light box for controlling light exposure and temperature. Then, position a six well plate on the upper shelf of the incubator, and check whether the light beam evenly encompasses it. Use a sheet of paper to visualize the distribution of light coverage.Use a light meter to measure irradiance and spatial uniformity. At least one day before injections, make injection dishes and agarose-coated six well plates. Rinse an injection dish mold with embryo medium, and place gently onto molt and agarose.Once the agarose has solidified, delicately use the tab to remove the mold. Next, prepare flamed glass pipettes for immunofluorescence experiments on dechlorinated embryos. Place the end of a glass pipette into a bun and burner flame, and rotate continuously until the edges become smooth.Prepare an injection mix using the mRNAs shown here. For the phenotyping assay, introduce the needle through the corion directly into the center of the cell at the one cell stage, and inject one nanoliter of the injection mix. If conducting an immunofluorescence assay, target the center of the cell of coated embryos at the one cell stage.For both assays, prepare enough embryos for the unexposed non-injected, unexposed injected, exposed non-injected, and exposed injected embryos. Select at least 30 embryos per condition. For the immunofluorescence assay, prepare an additional dish containing non-injected embryos as a proxy to assess the progression of developmental stages.After injection, incubate the embryos in Petri dishes at 28 degrees Celsius.

bOpto-BMP/Nodal Constructs를 Zebrafish 배아에 주입 

Light Exposure Experiment to Activate BMP or Nodal Signaling in Zebrafish

To begin, incubate the injected zebrafish embryos at 28 degrees Celsius. Around 1.5 HPF at the four to 16 cell stage, remove unfertilized and unhealthy embryos. For the phenotyping assay, wrap the unexposed control plate with noninjected and injected embryos in aluminum foil.Position the foil covered plate on the lower shelf, and the exposed plate on the upper shelf of the 28 degrees Celsius light box. After confirming that the dish cover is in place, activate the blue light, and shut the light box door to prevent unintended room light exposure. For the immunofluorescence assay around 1.5 HPF, individually wrap the exposed and unexposed dishes in aluminum foil while keeping the proxy dish unwrapped.Put all the dishes in the 28 degrees Celsius light box without activating the LED. Close the light box door to prevent inadvertent exposure to room light. At approximately five HPF, use a dissecting scope to evaluate the developmental stage of the proxy embryos.Also remove the wrapped dishes to ensure uniform temperature exposure across all dishes. Once the proxy embryos reach 40%epiboly, uncover the exposed dish and place it on the upper shelf of the light box. Keep the unexposed dish covered on the lower shelf.Immediately activate the blue light, close the door, and set a timer for 20 minutes. To prepare for fixation, eliminate as much room light as possible. Just before fixation, take tubes containing 4%formaldehyde from four degrees Celsius and position them beside the light box.After 20 minutes, open the door of the light box and remove the dish that wasn't exposed to light. Use a flamed glass pipette tip to remove the light sensitive embryos from the dish. Then to immerse the embryos in 4%formaldehyde, submerge the flamed glass pipette tip in the formaldehyde, and allow the embryos to sink into the liquid.Store fixed embryos at four degrees Celsius overnight.

제브라피시에서 BMP 또는 결절 신호전달을 활성화하기 위한 빛 노출 실험

Evaluation of bOpto-BMP&#47;Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment

Evaluation of bOpto-BMP/Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment  

For the phenotyping assay, perform the light exposure experiment on bOpto-BMP bOpto-Nodal expressing zebrafish embryos, and remove them from the light box at one day post-fertilization between 24 to 32 HPF. Using a dissecting scope, evaluate phenotypes and establish a scoring rubric. Assess embryos while they remain within the chorion for convenience.Utilize a pipette to probe to reposition embryos for viewing from different angles. For the immunofluorescence assay, after incubating embryos in 4%formaldehyde at four degrees Celsius overnight, remove the formaldehyde and rinse them three to five times with PBST. Discard the PBST and add 100%methanol.Seal the tubes and gently invert them to mix residual PBST and methanol. After washing the embryos two more times with methanol, store them at minus 20 degrees Celsius for at least two hours up to several years. Using a microscope equipped for optical sectioning, capture images of immunostained embryos.Immunofluorescent staining experiments with appropriate mRNA amounts and light exposure conditions showed that the pSmad levels were similar and non-injected in unexposed embryos, whereas injected light exposed embryos exhibited higher levels of Smad phosphorylation.