이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute)의 지원을 받아 수상 번호 R01HL167877에 따라 수행되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 National Institutes of Health의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

아래에 언급된 모든 방법은 IRB(Institutional Review Board) 프로토콜 및 기관 인간 연구 윤리 위원회(Institutional Human Research Ethics Committee)를 따릅니다. 모든 건강한 자원봉사자는 헌혈 전에 서면 동의서를 제출했습니다. 참고로, 프로토콜 내에서 참조되는 모든 자료는 재료 목차에서 찾을 수 있습니다. 인간 WB 및 혈장이 이 프로토콜 전반에 걸쳐 논의되는 동안, 연구 동물 혈액 및 인자 고갈 혈액 제제의 사용을 구매하고 대체할 수 있습니다.
1. 전혈 채취
<ol><li>표준 정맥 절개술 기술을 사용하여 동의한 건강한 지원자로부터 정맥 전혈(WB)을 수집합니다. 주의: 이 프로토콜 전체에서 혈액 또는 기타 잠재적으로 감염될 수 있는 물질과의 접촉 위험을 줄이기 위해 보편적인 예방 조치를 따라야 합니다. 장갑, 실험실 가운 및 안면 보호대를 사용해야 합니다.</li>
	<li>~50mL의 WB를 3.2% 구연산나트륨 튜브에 직접 모으고 후속 사용을 위해 즉시 50mL 튜브에 고입니다. 알림: 구연산염 튜브에 혈액을 수집하기 전에 튜브를 버리는 것은 튜브가 제조업체에서 권장하는 양만큼 채워지도록 하는 것 외에도 필요합니다. 갓 수집된 WB는 숙주의 응고 역학을 가장 잘 요약합니다. WB는 실온(사용 전 ≤4시간 전)에서 단기간 보관할 수 있습니다. WB는 혈전탄성조영술(thromboelastography15)을 통해 검사할 때 응고 역학에 영향을 미치는 것으로 나타났으므로 하룻밤 동안 보관되지 않는다.</li>
</ol>2. 응고 형성
<ol><li>구연산 전혈 3mL에 형광(플루오레세인 이소티오시아네이트[FITC]) 표지 피브리노겐(FITC-Fg)을 최종 농도 60μg/mL(내인성 혈장 피브리노겐 농도가 3mg/mL라고 가정할 때 1:50 형광 표지 피브리노겐과 비변형 피브리노겐의 비율)로 첨가합니다. 참고: 이 비율은 응고 형태에 미치는 영향을 최소화하면서 1:10까지 높일 수 있습니다. 13,14 형광 태그가 지정된 피브리노겐은 피브리노겐을 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)와 반응시켜 구매하거나 생성할 수 있습니다. 피브리노겐 혼합은 실행이 시작되기 ≤5분 전에 수행해야 합니다.<ol><li>피브리노겐이 이전에 분주되어 동결된 경우 해동된 FITC-Fg를 검사하여 중합이 조기에 시작되어 사용할 수 없게 되지 않았는지 확인합니다(용액에 미립자 또는 섬유가 없는지 확인).</li>
	</ol></li>
	<li>37°C 수조에서 120mm 직경의 드럼으로 Chandler 루프 설정을 준비합니다(그림 1). 챈들러 루프 장치가 전체 응고 형성 과정에서 0-90rpm의 고정된 회전 속도로 회전할 수 있는지 확인하십시오. 참고 : 추가 챈들러 루프 설정 및 수정 사항은 Zeng et al.에서 찾을 수 있습니다.16.</li>
	<li>튜브(내경 5/32", 외경 7/32")를 자르고 드럼 주위에 단단히 맞지만 단단히 맞지 않는 루프를 형성합니다. 여기에 설명된 권장 튜빙 크기의 경우 튜빙 끝을 연결하여 폐쇄 루프를 형성하는 피팅으로 사용하기 위해 표준 200μL PCR 튜브를 절단합니다. 참고: 다양한 크기의 응고를 생성하기 위해 다양한 크기의 튜브 크기를 사용할 수 있습니다16.</li>
	<li>전혈에 1:17 칼슘 용액 200mM 염화칼슘 용액을 첨가하여 혈액 응고를 시작합니다. 3mL 주사기를 사용하여 혈액을 튜브에 넣고(튜브 부피의 ~50% 채우기). 즉시 루프를 끝을 연결하는 Chandler 루프 드럼에 놓고 회전을 시작합니다.<ol><li>WB 구성 요소의 침전으로 인한 문제를 방지하기 위해 적재하기 전에 부드러운 반전으로 적절한 혼합을 확인하십시오.</li>
		<li>일정하게 유지되지 않으면 혈전 크기에 영향을 줄 수 있으므로 매 실행마다 각 튜브에 동일한 양의 혈액을 추가해야 합니다.</li>
		<li>혈액 기둥 내의 기포도 혈액 응고에 영향을 줄 수 있으므로 드럼에 적재하기 전에 기포가 쉽게 빠져나갈 수 있도록 튜브를 "시소"와 같은 방식으로 부드럽게 움직여 기포를 제거하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>수조에 부분적으로 잠긴 드럼을 40RPM의 회전 속도로 회전시켜 ~450s-1의 계산된 전단 속도를 얻습니다. 참고: 튜빙 크기 및 회전 속도(20 - 60 RPM)16를 기준으로 계산된 전단기에 대한 정보는 Zeng et al.을 참조하십시오. 일반적인 정맥 및 동맥 전단 속도는 각각 20-200 s-1 및 300-1,000 s-1이며, ~ 400-500 s-1 은 폐 동맥을 대표합니다.</li>
	<li>형광 태그가 부착된 피브리노겐의 광표백을 최소화하기 위해 저조도 조건에서 40-60분 동안 혈전이 형성되도록 합니다.</li>
	<li>원하는 응고 시간에 도달한 후에는 튜브에서 응고를 제거하고 즉시 사용하십시오. 구조를 손상시키지 않고 혈전을 부드럽게 제거하려면 튜브를 부드럽게 뒤집어 혈전이 튜브에서 작은 용기로 천천히 미끄러져 나올 수 있도록 합니다. 참고: 형성된 응고를 4°C에서 밤새 구연산 혈장 또는 PBS에 보관하면 흐름 루프에서 혈전 분해의 후속 분석에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
</ol>3. RT-FluFF 기기 설정
<ol><li>그림 2와 같이 흐름 루프 장치가 연결되어 있고 모든 연결이 안전한지 확인하십시오. 요컨대, 흐름 루프 장치에는 펌프 > 댐퍼 > 입구 압력 센서 > 응고 > 출구 압력 센서 > 형광 측정기 > 가열 저장소 > 펌프가 포함됩니다. 펌프 용량, 실험 유속, 튜빙 직경 및 길이, 온도, 저장소 부피 및 응고 크기/형상의 선택을 각 연구에 고유한 실험 요구 사항에 맞게 조정합니다. 참고: 이 예에서는 챈들러 루프에 사용된 것과 동일한 직경의 튜브가 RT-FluFF에 사용되었습니다. 튜브는 같은 날에 여러 번 실행할 수 있지만 성능 저하 또는 누출 여부를 모니터링하고 필요에 따라 교체/헹굼해야 합니다. 실행 사이에 따뜻한 증류수로 헹구는 것이 좋습니다. 실험 설계에 따라 모든 실행 후에 튜브를 교체해야 할 수도 있습니다.</li>
	<li>모든 튜브가 고정되면 압력 모니터를 켭니다. 압력 모니터가 입구 및 출구 센서 모두에 대해 0mmHg를 읽는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 밸브를 열어 압력 센서가 대기압에 대해 열려 있는지 확인하고 센서를 영점으로 만듭니다.</li>
	<li>사용 중인 가열 블록 또는 수조를 켜고 실험이 진행되는 동안 온도를 모니터링합니다. 생리적 인체 온도를 모방하기 위해 온도를 37°C에 가깝게 유지하십시오.</li>
	<li>원하는 유량으로 펌프를 켜서 누출을 확인하고 압력 센서가 작동하는지 확인하십시오. 참고: 이 튜빙 크기에서 ~160mL/min의 유속은 ~500s-1의 전단 속도를 나타냅니다.</li>
	<li>응고 로딩을 용이하게 하기 위해 펌프를 끄십시오.</li>
</ol>4. 플로우 루프에 응고 로딩
<ol><li>이전에 만들어진 응고를 사용하는 경우 혈전을 플로우 루프 시스템에 로드하기 전에 응고를 실온으로 가져와야 합니다.</li>
	<li>혈전 질량 손실은 혈전용해 분석을 위한 중요한 종말점 측정입니다. 사전 측정에 의존하는 대신 응고 질량을 흐름 루프에 로드하기 직전에 측정하는 것이 가장 좋습니다.<ol><li>응고 질량 측정은 혈전 내부 및 응고 위의 액체 함량이 혈전의 질량에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 샘플 전체와 분석 일 전반에 걸쳐 일관성을 보장하기 위해 항상 동일한 방식으로 수행해야 합니다. 가장 좋은 방법은 측정 과정 전반에 걸쳐 혈전이 압박되지 않도록 주의하면서 더 이상 물티슈에 상당한 양의 액체를 방출하지 않을 때까지 실험실 물티슈의 응고를 부드럽게 닦아내는 것입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>혈장(자가 또는 유형 일치) 또는 유동 루프에 사용되는 기타 이동상 용액(예: PBS 또는 정의된 매체)에 응고를 칭량 접시와 같은 얕은 용기에 담그십시오. 이동상 용액은 전체 시스템 부피를 제어하기 위해 50mL 시스템 저장소에서 직접 가져와야 합니다. 혈전 로딩 단계에서는 혈전 용해제 또는 약물 검사제가 없어야 합니다. flow loop를 실행하기 위한 이동상의 총 부피는 ≥50mL로 권장되며 모든 샘플에서 일관되어야 합니다.</li>
	<li>플로우 루프 튜빙의 중앙 부분(입구와 출구 센서 사이)을 제거하고 튜브의 한쪽 끝에 10mL 주사기를 부착합니다.</li>
	<li>튜빙의 다른 쪽 끝을 사용하여 플라즈마(또는 이동상)에 놓고 소량의 용액을 취하여 튜빙을 프라이밍합니다. 그런 다음 튜브 입구를 혈전 근처에 놓고 혈전을 주의 깊게 검사하여 머리(일반적으로 혈전의 약간 두꺼운 끝)와 꼬리(머리 반대쪽 끝)를 식별합니다. 응고의 머리는 입구 압력 센서 쪽으로 위치해야 하며 출구에서 멀리 떨어져 있어야 합니다. 튜브를 응고의 "꼬리" 끝에 놓고 주사기로 튜브에 흡입합니다. 알림: 응고 머리/꼬리 방향성을 시각적으로 결정할 수 없는 경우, 챈들러 루프의 회전 방향(응고 머리가 드럼 회전 반대 방향을 향함)을 아는 것을 기반으로 방향성을 가장 잘 할당할 수 있습니다.</li>
	<li>응고가 출구 압력 센서에 가장 가깝도록 튜브를 주 장치에 다시 부착합니다(혈전의 머리는 출구 센서에서 반대쪽을 향해야 함). 튜브와 응고 머리를 두 개의 30G 바늘로 "X"자 모양으로 구멍을 뚫어 혈전을 제자리에 고정합니다. 달리는 동안 이 바늘을 그대로 두십시오. 알림: d에 따라ampener 및 펌프 설정, 혈전이 조기에 파편화되지 않도록 하기 위해 추가 바늘이 필요할 수 있습니다. 필요한 경우, 혈전 조각이 시스템에서 순환하는 것을 방지하기 위해 혈전의 하류에 있는 튜브에 스크린을 추가할 수 있습니다. 혈전을 유지하기 위해 정해진 수의 바늘이 설정되면 조건에 따라 일관되게 유지하십시오.</li>
	<li>나머지 이동상 용액을 50mL 튜브에 저장소로 넣습니다.</li>
	<li>저장소를 수조에 넣고 입구와 출구 튜브를 넣습니다(출구는 형광계에서 나오고 입구는 펌프 헤드로 들어갑니다).</li>
	<li>사용 중인 형광측정기가 연결되어 있고 모니터링되고 있는지 확인하십시오. 실험 시작 시 초기 값이 이동상 전용 시스템 기준선과 비교하여 적절한지 확인합니다. 참고: 인라인 형광측정기를 사용할 수 없는 경우, 유량 루프 분석 기간 동안 정의된 간격으로 저장소의 연속 주기적 샘플링을 수행할 수 있습니다. 수집된 분획은 시중에서 판매되는 분광 광도계에서 실험 완료 직후 96웰 플레이트를 사용하여 판독할 수 있습니다.</li>
	<li>500μL의 100,000ng/mL tPA를 저장소 부피에 직접 추가하여 50mL에서 최종 1,000ng/mL tPA 농도를 달성합니다. 첨가되는 부피, 농도 및 특정 약물은 원하는 목표 순환 농도 및 시스템 저장소 부피에 따라 달라집니다.</li>
	<li>펌프를 시작하기 전에 다음 사항을 확인하십시오.<ol><li>모든 교차로는 안전합니다.</li>
		<li>압력 센서 위에 있는 두 개의 밸브는 적절한 닫힌 위치에 있습니다.</li>
		<li>저장소에 남아 있는 모든 플라즈마(또는 유체)가 교체되었습니다.</li>
		<li>혈전용해제를 저장소에 첨가하고 적절하게 혼합했습니다.</li>
		<li>입구 튜브는 저장소 바닥 근처에 있습니다(이렇게 하면 기포가 최소화됨).</li>
		<li>출구 튜브는 고정되어 있고 원하는 압력에 적합한 높이에 있습니다(모델링되는 용기 위치에 따라 다름).</li>
		<li>펌프 회전 방향이 정확합니다(흐름 순서: 펌프 > Dampener > 응고 > 형광측정기 > 저장소 > 펌프).</li>
		<li>펌프 RPM이 매우 높게 설정된 경우(>150rpm) 더 느린 속도로 시작하여 급격한 압력 변화로 인해 응고가 파편화되거나 튜브 누출이 발생하지 않도록 합니다.</li>
		<li>시스템이 형광측정기의 데이터를 적절하게 기록하고 있는지 및/또는 실험 후 시점 판독을 위해 이동상의 주기적인 샘플링을 위한 공급품이 준비되어 있는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>펌프를 켜고 원하는 체적 유량인 160mL/분에 도달하도록 설정하거나 원하는 압력에 도달할 때까지 유량을 높입니다. 시스템은 유체와 기포로 채워집니다. 기포는 인위적으로 형광 측정 수치를 높이므로 기포가 제거될 때까지 주의하십시오. 그런 다음 조명을 끄고 데이터 수집을 시작하십시오.</li>
	<li>응고가 현저히 저하되거나 원하는 실험 시간(≥60분)이 경과할 때까지 펌프를 계속 작동시킵니다. 필요에 따라 저장소를 통해 실험 전반에 걸쳐 시스템에 시약을 추가하여 다양한 혈전 용해 변형을 테스트하는 고유한 실험 조건을 생성합니다. 알림: 실험 시간은 펌프 유량(전단 수준)과 혈전용해제의 농도에 따라 다릅니다.</li>
	<li>분석이 완료되면 체적 유량을 줄이고 펌프가 작동하는 동안 입구 튜브를 제거하여 시스템의 대부분의 유체를 저장소로 밀어 넣습니다(일부 이동상은 튜브에 남아 있음). 튜브의 출구 압력 센서 쪽에서 응고가 포함된 튜브 섹션을 분리하고 계량 보트로 내립니다.</li>
	<li>혈전을 제자리에 고정하고 있는 바늘을 제거하여 시스템 내부에 남아 있는 액체와 응고/응고 조각을 수집합니다. 필요에 따라 주사기를 사용하여 시스템을 청소합니다.</li>
	<li>손실된 질량 퍼센트 계산 또는 조직학과 같은 추가 분석을 위해 남아 있는 응고를 계량하고 처리합니다.</li>
</ol>5. 시스템 청소
<ol><li>샘플 사이에 높은 rpm(>150rpm)의 따뜻한 물로 전체 시스템을 헹굽니다. 물통에 물을 넣고 최소 2분 동안 시스템을 통과시키고 비우고 다시 실행하여 두 번의 완전한 시스템 헹굼을 수행합니다. 이러한 헹굼 후에도 형광측정기 판독값이 기준선으로 돌아오지 않으면 추가 주기 동안 헹굼 과정을 반복합니다. 여전히 기준선으로 돌아가지 않으면 다음 샘플을 분석하기 전에 튜브를 완전히 교체하십시오. 참고: 실험 중에는 샘플 간에 튜브를 재사용할 수 있습니다. 그러나 혈전을 제자리에 고정하는 데 사용되는 바늘로 구멍을 뚫기 때문에 입구와 출구 압력 센서 사이의 튜브 부분은 각 실행 후에 교체해야 합니다. 일부 실험 조건에서는 시료 교차 오염을 제거하기 위해 각 실행 또는 클러스터링 분석 후 전체 튜브 세트를 교체해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>그날의 실험을 위해 모든 샘플을 실행한 후 모든 튜브를 제거하고 폐기합니다. T-접합부를 뜨거운 물과 강모 브러시로 깨끗해질 때까지 문지른 다음 주사기 댐퍼를 건조시키고 뜨거운 물로 헹굽니다. 멸균에 도움이 되는 70% EtOH를 사용하십시오.</li>
</ol>

Chandler Loop와 RT-FluFF를 결합하여 Ex vivo 응고 용해 모니터링

<ol>
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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

응고 형성 및 라벨링 챈들러 루프(Chandler loop)는 생체 내 혈전16을 모방한 혈전을 재현성 있게 생성하는 쉽고 효과적인 수단을 제공하는 것으로 입증되었습니다. 튜빙 크기, 회전 속도, 드럼 직경 및 응고 시간과 같은 매개변수를 미세 조정하면 다양한 전단 조건에서 혈전을 빠르게 생성할 수 있으며, 동맥 및 정맥 소스를 모두 모방하는 다양한 혈전에서 높이 ...

근본적으로 혈전색전증 병인에서 비롯된 질병은 현대 사회에서 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 혈전색전증의 발병기전으로는 심근경색, 허혈성 뇌졸중, 심부 정맥 혈전증, 폐색전증 등이 있으나 이에 국한되지 않는다1. 병원성 혈전증을 치료하기 위한 안전하고 효과적인 방법의 개발을 중심으로 여러 분야에 걸쳐 엄청난 양의 지속적인 연구가 진행되고 있습니다. 혈전증의 동맥 및 정맥 증상의 변화와 다양한 해부학적 위치로 인해 다양한 치료 접근법이 개발되었습니다. 그러나 급성 치료는 일반적으로 플라스미노겐 활성제를 통한 약물적 혈전용해술에 의존하며, 특정 임상 상황에서 기계적 혈전절제술을 시행할 수 있다2.
새로운 약리학적 치료 전략의 개발은 근본적으로 전임상 시험을 위한 체내 동물 모델과 체외 소화 모델 모두에 의존합니다 3,4. 생체 내 모델은 의약품의 제거뿐만 아니라 약물과의 세포 상호 작용을 포함하여 치료 효능에 대한 다양한 생리학적 매개변수의 복잡한 상호 작용을 포착할 수 있는 능력의 이점을 자연스럽게 누릴 수 있습니다. 그러나 이와 동일한 복잡성으로 인해 이러한 모델은 종종 상당한 비용이 들고 인간의 생리학과 크게 다른 동물에서 근본적인 약력역학/동역학을 분리하려고 할 때 추가적인 문제가 발생합니다. 체외 모델의 개발은 약물 개발 및 스크리닝을 수행할 수 있는 증류 테스트 환경을 촉진하는 데 도움이 되었지만 연구 중인 질병 상태를 재현하는 데 필요한 충실도가 부족한 경우가 많습니다.
새로운 혈전용해제를 테스트하기 위해 일반적으로 발견되는 시험관 내 프로토콜은 잔류 혈전 질량이 1차 종점 역할을 하는 정적 조건에서 형성되고 용해된 혈전의 활용에 의존합니다 5,6. 불행히도, 이러한 기술은 시험 약물의 약력학을 크게 변화시킬 수 있는 난류 및 트랜스 혈전 압력 강하와 같은 혈전 용해의 기계적 측면을 설명하지 못합니다. 또한, 정적 조건에서 형성된 혈전은 생리적 혈전과 다른 미세구조를 포함하고 있습니다. 혈전 형성 중 전단의 존재는 혈소판 활성화 및 피브린 교차결합과 같은 결과적인 응고 특성에 영향을 미치는 것으로 재현 가능한 것으로 나타났습니다. 전단 흐름 하에서 생성되는 응고는 정적으로 형성된 응고 7,8에는 없는 팁에서 꼬리까지 복잡한 이질성을 나타냅니다. 이러한 생리적 응고 구조로부터의 이탈은 혈전 내 약물 침투 및 후속 용해 효율을 포함하는 중요한 약물 개발 특성 분석에 영향을 미칠 수 있다9.
정적 응고/응고-용해 모델의 사용과 관련된 이러한 제한 사항 중 일부를 해결하기 위해, 전단이 있는 상태에서 응고 형성 및 응고 용해 모두에 대해 챈들러 루프(Chandler loop)를 채택하면서10이 부활했다. 이러한 시스템은 유동 역학을 더 잘 표현하고 상대적으로 정적인 분석에 비해 생리학적으로 더 관련성이 높은 구조를 가진 응고를 생성할 수 있지만, 단순화된 유동 조건은 여전히 생리학적 조건과의 편차를 나타냅니다. 마지막으로, microfluidic 접근은 또한 화상 진찰의 그들의 용이함 및 획일한 교류 본 때문에 착수되었습니다; 그러나, 이는 임상적으로 가장 관련성이 높은 혈전색전증 질환에서 주로 영향을 받는 더 큰 혈관 내에서 예상되는 생리적 조건으로부터 상당한 제거로 남아 있다11,12.
위의 논의를 염두에 두고 우리는 전임상 혈전용해제 약물 스크리닝을 위한 충실도가 높은 체외 혈전용해 모델을 개발했습니다. 이 모델은 새로운 혈전용해 요법 스크리닝 영역에서 위에서 자세히 설명한 현재의 일부 위험을 해결하는 것을 목표로 하며 다양한 농도의 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)에서 재현성 및 민감도에 대해 검증되었습니다. 본 명세서에 기술된 시스템은 연동 펌프, 압력 댐퍼, 가열 저장소, 2개의 압력 센서, 인라인 형광측정기, 및 형광 표지된 챈들러 루프 전단 성형 응고 아날로그를 활용하여 생리학적 전단 흐름을 제공하여 섬유소 용해증의 실시간 추적을 용이하게 한다13. 종합하면, 전체 시스템을 RT-FluFF Assay(Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay)14 라고 하며, 이 원고에서는 이 고충실도 체 외 혈전용해 모델에서 어세이를 성공적으로 설정하고 실행하는 복잡성에 대해 설명합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G&#160;Disposable Hypodermic Needles</td>
			<td>Exel International&#160;</td>
			<td>26439</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>B07SXGSQ82</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>MLB3</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus , dampeners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans HemoMed Pod</td>
			<td>Drager</td>
			<td>5588822</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans Patient Monitor</td>
			<td>Drager</td>
			<td>SC 7000</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chandler loop,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield</td>
			<td>Moxe</td>
			<td>SHIELDS10</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>30600-04</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (FITC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>119245000</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2839</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate 4 &#215; 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1152016H</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-SPL</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Whole Blood&#160;</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-WB-SDS&#160;</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>77200-62</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7528-10</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor Speed Controller</td>
			<td>CoCocina</td>
			<td>ZK-MG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6151-0312</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump tubing&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06424-15&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching Power Supply</td>
			<td>SoulBay</td>
			<td>UC03U</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S751010</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue plasminogen activator, human</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0831</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 1/4&#39;&#39;, OD 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AGL00017</td>
			<td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 5/32&#34;, OD 7/32&#34;</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ND-100-65, ADF 00009&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td>
			<td>uvBeast</td>
			<td>uvB-V3-365-MINI</td>
			<td>Chandler loop, used to check completed clots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td>
			<td>Pangyoo</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking fibrinolysis of chandler loop-formed whole blood clots under shear flow in an in-vitro thrombolysis model

혈전색전증 및 관련 합병증은 전 세계적으로 이환율 및 사망률의 주요 원인이며, in vitro 및 in vivo 모두에서 혈전용해제 약물 효과를 테스트하기 위해 다양한 분석법이 개발되었습니다. 인간 생리학으로의 번역성이 부족한 경우가 많을 뿐만 아니라 동물 모델과 관련된 복잡성과 비용으로 인해 약물 개발을 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 체외 혈전 모델에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 유량, 압력 및 전단 속도는 순환계의 중요한 특성이며, 흐름에 따라 형성된 응고는 정적으로 형성된 혈전과 다른 형태 및 소화 특성을 나타냅니다. 이러한 요인은 기존의 체외 혈전 분해 분석에서는 나타나지 않는 경우가 많으며, 이는 약물 번역 성공률에 영향을 미치는 약리학적 영향을 미칠 수 있습니다.
RT-FluFF(Real-T ime Flu Fluorometric Flowing Fibrinolysis) 분석은 전단 흐름 하에서 형성된 형광 태그 응고를 사용하는 고충실도 혈전 용해 검사 플랫폼으로 개발되었으며, 이 혈전은 섬유소 용해제의 유무에 관계없이 순환 플라즈마를 사용하여 분해됩니다. 혈전 형성 및 혈전 소화 단계의 유속을 수정하면 시스템이 매우 다양한 실험 설정에서 동맥, 폐 및 정맥 상태를 모방할 수 있습니다. 측정은 인라인 형광측정기를 사용하거나 이산 시점을 사용하여 연속적으로 수행할 수 있으며, 기존의 종말점 응고 질량 측정도 수행할 수 있습니다. RT-FluFF assay는 체외 검사 시스템의 제어 및 재현성을 유지하면서 생체 내 생리학적 조건을 보다 정확하게 나타내는 유동 조건에서 혈전 분해를 실시간으로 추적할 수 있는 유연한 시스템입니다.

Diseases fundamentally stemming from thrombo-embolic etiologies present a major source of morbidity and mortality in present-day society. Manifestations of thrombo-embolic pathogenesis include, but are not limited to, myocardial infarctions, ischemic strokes, deep venous thromboses, and pulmonary emboli1. A tremendous amount of ongoing research, spanning multiple disciplines, revolves around the development of safe and effective methods for dealing with pathogenic thrombosis. Variations in arterial and venous manifestations of thrombosis and varying anatomic locations have resulted in the development of different treatment approaches. However, acute treatment generally relies on the use of pharmacologic thrombolysis via plasminogen activators with the potential for mechanical thrombectomy under certain clinical circumstances2.
The development of novel pharmacologic treatment strategies fundamentally relies on both in-vivo animal models and in-vitro digestion models for preclinical testing3,4. In-vivo models naturally benefit from their ability to capture the complex interaction of various physiologic parameters on treatment efficacy that include clearance of pharmaceutical agents as well as cellular interactions with drugs. However, this same complexity often makes such models quite costly and introduces additional issues when attempting to isolate underlying pharmaco-dynamics/kinetics in animals that significantly differ from human physiology. The development of in-vitro models has helped by facilitating a distilled testing setting in which drug development and screening can be performed but often lacks the fidelity necessary to recapitulate the disease state being studied. 
Commonly found in-vitro protocols for testing novel thrombolytics rely on the utilization of clots formed and lysed under static conditions whereby the residual clot mass serves as the primary endpoint5,6. Unfortunately, such techniques fail to account for the mechanical aspects of clot lysis such as turbulent flow and trans-thrombus pressure drops that can significantly alter the pharmacodynamics of test drugs. Additionally, clots formed under static conditions contain microarchitecture that differs from physiologic clots. The presence of shear during clot formation has reproducibly been shown to impact the resulting clot characteristics such as platelet activation and fibrin-crosslinking. Clots being produced under shear flow exhibit complex heterogeneity from tip-to-tail that is absent in statically formed clots7,8. Such departures from physiologic clot architecture may impact important drug development characterization that includes drug penetration within a thrombus and subsequent lysis efficiency9. 
To address some of these limitations associated with the use of static clotting/clot-lysis models, the adoption of the Chandler loop for both clot formation and clot lysis in the presence of shear has seen a resurgence10. Although such systems allow for a better representation of flow dynamics and generate clots with more physiologically relevant architecture compared to relatively static assays, their simplified flow conditions still represent a deviation from physiologic conditions. Lastly, microfluidic approaches have also been undertaken due to their ease of imaging and uniform flow patterns; however, they remain a significant removal from the physiologic conditions expected within the larger vessels primarily affected in most clinically relevant thrombo-embolic disorders11,12. 
With the above discussion in mind, we developed a high-fidelity, in-vitro thrombolysis model for preclinical thrombolytic drug screening. The model aims at addressing some of the current pitfalls detailed above in the realm of novel thrombolytic therapy screening and was validated for reproducibility and sensitivity at varying concentrations of tissue plasminogen activator (tPA). The system described herein offers physiological shear flows utilizing a peristaltic pump, a pressure dampener, a heated reservoir, two pressure sensors, an in-line fluorometer, and a fluorescently labeled Chandler loop shear-formed clot analog to facilitate real-time tracking of fibrinolysis13. Taken together, the overall system is called the Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 and this manuscript will discuss the intricacies of successfully setting up and running assays in this high-fidelity in-vitro thrombolysis model.

저자 스포트라이트: In Vitro 모델에 유동 역학을 통합하여 혈전용해 검사의 발전

체외 혈전용해 모델에서 전단 흐름에 따른 Chandler Loop-Formed 전혈의 Fibrinolysis 추적

Thrombosis is associated with numerous medical conditions and current treatments risk severe bleeding. Circulatory system flow significantly impacts blood clot structure. Incorporating flow into in-vitro models may improve their physiological relevance, enhancing the selection of better candidates for in-vivo testing.The assays for the study of fibrinolytics predominantly utilize static clot or microfluidic systems to assess properties such as lysis time, clot structure, or viscoelasticity. Static clot lysis assays typically rely on spectrophotometric measurements or clot mass determination as endpoints to evaluate fibrinolysis efficiency. Current thrombolytic testing uses statically-formed clots, which differ structurally from those formed under flow conditions.Microfluidic systems consider flow dynamics, but their smaller scales create unique hemodynamics and clot structures. The currently developed RT-FluFF assay provides ease in monitoring fibrinolysis in real time under physiological flow conditions. This means we now have a platform that allows control over multiple parameters to mimic conditions closer to in-vivo study models for better translation when screening new thrombolytics.

챈들러 루프 응고 형성 혈전을 형성할 때, 우리는 일반적으로 혈전 이상치(총 형태 및 질량 기반)가 존재하는 경우에도 삼중 혈전용해 분석을 실행할 수 있는 능력을 보장하기 위해 4중을 목표로 했습니다. 최적의 로딩 조건을 가정할 때, 혈전은 그림 3과 같이 길이(~3.3cm), 무게(~100mg) 및 외관이 모두 균일해야 합니다. FITC-Fg를 사용할 때, 우리는 또한 응고 내 불?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

체외 혈전용해 분석은 소화되는 모델 혈전이나 혈전용해가 발생하는 환경에서 생체 내 조건을 복제하는 데 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 여기에서는 챈들러 루프와 RT-FluFF(Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay)를 결합하여 고충실도, 생체 외 혈전 용해 모니터링을 수행하는 방법을 살펴봅니다.

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

혈전증은 수많은 의학적 상태와 관련이 있으며 현재 치료법은 심각한 출혈의 위험이 있습니다. 순환계 흐름은 혈전 구조에 큰 영향을 미칩니다. 체외 모델에 플로우를 통합하면 생리학적 관련성이 향상되어 생체 내 테스트를 위한 더 나은 후보 물질의 선택이 향상될 수 있습니다.섬유소 용해제 연구를 위한 분석은 주로 정적 응고 또는 미세유체 시스템을 사용하여 용해 시간, 응고 구조 또는 점탄성과 같은 특성을 평가합니다. 정적 응고 용해 분석은 일반적으로 섬유소 용해 효율을 평가하기 위한 종점으로 분광광도계 측정 또는 응고 질량 측정에 의존합니다. 현재의 혈전용해 검사는 정적으로 형성된 혈전을 사용하는데, 이는 유동 조건에서 형성된 혈전과 구조적으로 다릅니다.미세유체 시스템은 유동 역학을 고려하지만 더 작은 규모는 고유한 혈류역학 및 응고 구조를 생성합니다. 현재 개발된 RT-FluFF 분석법은 생리학적 흐름 조건에서 실시간으로 섬유소 용해를 쉽게 모니터링할 수 있습니다. 이는 이제 새로운 혈전용해제를 스크리닝할 때 더 나은 번역을 위해 생체 내 연구 모델에 더 가까운 조건을 모방하기 위해 여러 매개변수를 제어할 수 있는 플랫폼을 갖게 되었음을 의미합니다.

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

515 조회수.  Indiana University School of Medicine. 혈전증은 수많은 의학적 상태와 관련이 있으며 현재 치료법은 심각한 출혈의 위험이 있습니다. 순환계 흐름은 혈전 구조에 큰 영향을 미칩니다. 체외 모델에 플로우를 통합하면 생리학적 관련성이 향상되어 생체 내 테스트를 위한 더 나은 후보 물질의 선택이 향상될 수 있습니다.섬유소 용해제 연구를 위한 분석은 주로 정적 응고 또는 미세유체 시스템을 사용하여 용해...