La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Heart, Lung, And Blood Institute des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01HL167877. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Toutes les méthodes mentionnées ci-dessous sont conformes aux protocoles du comité d’examen institutionnel (IRB) et du comité d’éthique de la recherche humaine de l’établissement. Tous les volontaires en bonne santé ont fourni un consentement écrit et éclairé avant le don de sang. Il convient de noter que tous les documents mentionnés dans le protocole se trouvent dans le Tableau des matériaux. Bien que la WB et le plasma humains soient abordés tout au long de ce protocole, l’utilisation de sang d’animaux de recherche et de produits sanguins appauvris en facteurs peut être achetée et remplacée.
1. Prélèvement de sang total
<ol><li>Prélever du sang total veineux (BM) de volontaires sains consentants à l’aide de techniques de phlébotomie standard. ATTENTION : Assurez-vous que les précautions universelles sont suivies pour réduire le risque de contact avec du sang ou d’autres matières potentiellement infectieuses tout au long de ce protocole. L’utilisation de gants, d’une blouse de laboratoire et d’un écran facial est nécessaire.</li>
	<li>Prélever ~50 ml de WB directement dans des tubes de citrate de sodium à 3,2 % et accumuler immédiatement dans des tubes de 50 ml pour une utilisation ultérieure. REMARQUE : Un tube de jetange avant le prélèvement sanguin dans le tube de citrate est nécessaire en plus de s’assurer que les tubes sont remplis au volume recommandé par le fabricant. Les WB fraîchement collectées récapituleront le mieux la dynamique de coagulation de l’hôte. L’entreposage à court terme de la WB à température ambiante (≤4 h avant l’utilisation) est permis. La WB n’est pas stockée pendant la nuit, car il a été démontré qu’elle a un impact sur la dynamique de la coagulation lorsqu’elle est examinée par thromboélastographie15.</li>
</ol>2. Formation de caillots
<ol><li>Dans 3 mL de sang total citraté, ajouter du fibrinogène marqué par fluorescence (FITC-Fg) par fluorescence (FITC-Fg) jusqu’à une concentration finale de 60 μg/mL (rapport entre 1:50 de fibrinogène marqué par fluorescence et de fibrinogène non modifié, en supposant une concentration plasmatique endogène de fibrinogène de 3 mg/mL). REMARQUE : Ce rapport peut être augmenté jusqu’à 1:10 avec un impact minimal sur la morphologie du caillot. 13,14 Le fibrinogène marqué par fluorescence peut être acheté ou généré en faisant réagir le fibrinogène avec l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Le mélange du fibrinogène doit être effectué ≤5 minutes avant le début de la série.<ol><li>Si le fibrinogène a déjà été aliquote et congelé, inspectez le FITC-Fg décongelé pour vous assurer que la polymérisation n’a pas commencé prématurément, le rendant ainsi inutilisable (assurez-vous de l’absence de particules ou de fibres dans la solution).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez la configuration de la boucle Chandler avec un tambour de 120 mm de diamètre dans un bain-marie à 37 °C (Figure 1). Assurez-vous que le dispositif de boucle Chandler est capable de tourner à une vitesse de rotation fixe de 0 à 90 tr/min pendant tout le processus de formation du caillot. REMARQUE : D’autres configurations et modifications de la boucle de Chandler peuvent être trouvées dans Zeng et al.16. Planche à billets</li>
	<li>Coupez les tubes (diamètre intérieur 5/32, diamètre extérieur 7/32") et formez des boucles qui s’adaptent fermement mais pas étroitement autour du tambour. Pour la taille de tube recommandée décrite ici, coupez un tube PCR standard de 200 μL à utiliser comme raccord pour connecter les extrémités du tube pour former la boucle fermée. REMARQUE : Différentes tailles de tubes peuvent être utilisées pour produire des caillots de différentes tailles16.</li>
	<li>Amorcer la coagulation du sang en ajoutant 200 mM de solution de chlorure de calcium dans un rapport de 1:17 de solution de calcium par rapport au sang total. Chargez le sang dans la tubulure (remplissez ~50 % du volume du tube) à l’aide d’une seringue de 3 ml. Placez immédiatement la boucle sur le tambour de boucle Chandler reliant les extrémités et commencez la rotation.<ol><li>Assurez-vous d’un bon mélange avec une inversion douce avant le chargement pour éviter tout problème résultant de la sédimentation des composants WB.</li>
		<li>Assurez-vous qu’une quantité égale de sang est ajoutée à chaque tube à chaque passage, car cela peut avoir un impact sur la taille du caillot s’il n’est pas maintenu de manière constante.</li>
		<li>Comme les bulles dans la colonne de sang peuvent également avoir un impact sur la coagulation du sang, retirez-les en déplaçant doucement le tube en forme de « balançoire » pour faciliter l’évacuation des bulles avant de les charger sur le tambour.</li>
	</ol></li>
	<li>Faites pivoter le tambour partiellement immergé dans le bain-marie à une vitesse de rotation de 40 tr/min pour obtenir un taux de cisaillement calculé de ~450 s-1. REMARQUE : Reportez-vous à Zeng et al. pour plus d’informations sur les cisailles calculées en fonction de la taille du tube et de la vitesse de rotation (20 à 60 tr/min)16. Les taux de cisaillement veineux et artériel typiques sont de 20-200 s-1 et 300-1 000 s-1, respectivement, ~400-500 s-1 étant représentatif de l’artère pulmonaire.</li>
	<li>Laisser les caillots se former pendant 40 à 60 minutes dans des conditions de faible luminosité pour minimiser le photoblanchiment du fibrinogène marqué par fluorescence.</li>
	<li>Une fois le temps de coagulation souhaité atteint, retirez les caillots du tube et utilisez-les immédiatement. Pour assurer l’élimination en douceur des caillots sans compromettre la structure, retournez doucement le tube pour permettre au caillot de glisser lentement hors du tube dans un petit récipient. REMARQUE : Le stockage des caillots formés dans du plasma citraté ou du PBS pendant une nuit à 4 °C peut avoir un impact sur l’analyse ultérieure de la digestion des caillots dans la boucle d’écoulement.</li>
</ol>3. Configuration de l’instrument RT-FluFF
<ol><li>Assurez-vous que l’appareil à boucle d’écoulement est connecté comme illustré à la figure 2 et que toutes les connexions sont sécurisées. En bref, l’appareil de boucle d’écoulement comprend, dans l’ordre du sens d’écoulement : Pompe > amortisseur > capteur de pression d’entrée > capteur de pression de > de sortie > fluorimètre > réservoir chauffé > pompe. Ajustez la sélection de la capacité de la pompe, du débit expérimental, du diamètre et de la longueur du tube, de la température, du volume du réservoir et de la taille/géométrie du caillot en fonction des besoins expérimentaux uniques à chaque étude. REMARQUE : Pour cet exemple, le même tube de diamètre utilisé dans la boucle de Chandler a été utilisé pour RT-FluFF. Le tube peut être utilisé pour plusieurs passages le même jour, mais doit être surveillé pour détecter toute dégradation ou fuite, puis changé/rincé au besoin. Il est recommandé de rincer à l’eau distillée tiède entre les passages. Selon la conception de l’expérience, il peut être nécessaire de remplacer le tube après chaque passage.</li>
	<li>Une fois que tous les tubes sont fixés, allumez le moniteur de pression. Vérifiez que le moniteur de pression indique 0 mmHg pour les capteurs d’entrée et de sortie. Si ce n’est pas le cas, ouvrez les vannes pour vous assurer que les capteurs de pression sont ouverts à la pression atmosphérique et mettez les capteurs à zéro.</li>
	<li>Allumez le bloc chauffant ou le bain-marie utilisé et surveillez la température tout au long de l’expérience. Maintenez la température proche de 37 °C pour imiter la température physiologique du corps humain.</li>
	<li>Allumez la pompe au débit souhaité pour vérifier s’il y a des fuites et vérifier que les capteurs de pression fonctionnent. REMARQUE : Un débit de ~160 mL/min dans cette taille de tube représentera un taux de cisaillement de ~500 s-1.</li>
	<li>Éteignez la pompe pour faciliter le chargement du caillot.</li>
</ol>4. Chargement du caillot dans la boucle d’écoulement
<ol><li>Si un caillot précédemment fabriqué qui a été stocké est utilisé, assurez-vous de ramener le caillot à température ambiante avant de le charger dans le système de boucle d’écoulement.</li>
	<li>La perte de masse du caillot est un paramètre important pour les tests de thrombolyse. Il est préférable de mesurer la masse du caillot juste avant de la charger dans la boucle d’écoulement au lieu de s’appuyer sur des mesures préalables.<ol><li>Les mesures de la masse des caillots doivent toujours être effectuées de la même manière à chaque fois pour assurer l’uniformité entre les échantillons et tous les jours d’analyse, car la teneur en liquide à l’intérieur et sur les caillots peut avoir un impact significatif sur leur masse. La meilleure pratique consiste à éponger doucement les caillots sur les lingettes de laboratoire jusqu’à ce qu’ils ne libèrent plus une quantité significative de liquide sur la lingette, en prenant soin de ne pas comprimer le caillot tout au long du processus de mesure.</li>
	</ol></li>
	<li>Immergez le caillot dans le plasma (autologue ou de type apparié) ou dans une autre solution de phase mobile utilisée dans la boucle d’écoulement (telle que le PBS ou un milieu défini) dans un récipient peu profond tel qu’une parabole de pesée. La solution en phase mobile doit être prélevée directement dans le réservoir du système de 50 mL pour contrôler le volume total du système. Aucun agent de test thrombolytique ou pharmaceutique ne doit être présent pendant la phase de charge du caillot. Il est recommandé que le volume total de la phase mobile pour l’exécution de la boucle d’écoulement soit de ≥50 mL et qu’il soit uniforme pour tous les échantillons.</li>
	<li>Retirez la section centrale de la boucle d’écoulement du tube (entre les capteurs d’entrée et de sortie) et fixez une seringue de 10 ml à une extrémité du tube.</li>
	<li>À l’aide de l’extrémité libre du tube, placez-le dans le plasma (ou phase mobile) et prélevez un petit volume de la solution pour amorcer le tube. Ensuite, placez l’entrée du tube près du caillot, en examinant soigneusement le caillot pour identifier la tête (généralement l’extrémité légèrement plus épaisse du caillot) et la queue (extrémité opposée à la tête). La tête du caillot doit être positionnée vers le capteur de pression d’entrée et loin de la sortie. Placez le tube à l’extrémité « arrière » du caillot et aspirez-le dans le tube avec la seringue. REMARQUE : dans les cas où la directionnalité tête/queue du caillot ne peut pas être déterminée visuellement, la directionnalité peut être attribuée en fonction de la connaissance de la direction de rotation de la boucle de Chandler - la tête du caillot fait face dans la direction opposée de la rotation du tambour.</li>
	<li>Fixez le tube à l’appareil principal de manière à ce que le caillot soit le plus proche du capteur de pression de sortie (la tête du caillot doit être tournée vers l’opposé du capteur de sortie). Fixez le caillot dans sa position en perforant le tube et la tête du caillot avec deux aiguilles de 30 G en forme de « X ». Laissez ces aiguilles pendant toute la durée de la course. REMARQUE : Selon les réglages de l’amortisseur et de la pompe, des aiguilles supplémentaires peuvent être nécessaires pour s’assurer que le caillot ne se fragmente pas prématurément. Si nécessaire, un tamis peut être ajouté au tube en aval du caillot pour empêcher les fragments de caillot de circuler dans le système. Une fois qu’un nombre défini d’aiguilles a été établi pour retenir le caillot, maintenez ce nombre constant dans toutes les conditions.</li>
	<li>Prenez le reste de la solution en phase mobile et mettez-le dans un tube de 50 ml comme réservoir.</li>
	<li>Placez le réservoir dans le bain-marie et mettez le tube d’entrée et de sortie (la sortie provient du fluorimètre et l’entrée va dans la tête de pompe).</li>
	<li>Vérifiez que le fluorimètre utilisé est connecté et surveillé. Au début de l’expérience, vérifiez que la valeur initiale est appropriée par rapport à la ligne de base d’un système mobile en phase uniquement. REMARQUE : Si un fluorimètre en ligne n’est pas disponible, un échantillonnage périodique en série du réservoir peut être effectué à des intervalles définis tout au long de la période d’analyse de la boucle d’écoulement. Les fractions collectées peuvent être lues à l’aide d’une plaque à 96 puits immédiatement après la fin de l’expérience sur n’importe quel spectrophotomètre disponible dans le commerce.</li>
	<li>Ajoutez 500 μL de tPA de 100 000 ng/mL directement dans le volume du réservoir pour obtenir une concentration finale de 1 000 ng/mL de tPA dans 50 mL. Le volume, la concentration et le médicament spécifique ajouté dépendront de la concentration circulante cible souhaitée et du volume du réservoir du système.</li>
	<li>Vérifiez les points suivants avant de démarrer la pompe :<ol><li>Tous les carrefours sont sécurisés.</li>
		<li>Les deux vannes situées au-dessus des capteurs de pression sont dans la position fermée appropriée.</li>
		<li>Tout plasma (ou fluide) résiduel a été remplacé dans le réservoir.</li>
		<li>Le thrombolytique a été ajouté au réservoir et correctement mélangé.</li>
		<li>Le tube d’entrée se trouve près du fond du réservoir (ce qui garantit un minimum de bulles).</li>
		<li>Le tube de sortie est sécurisé et à la hauteur appropriée pour la pression souhaitée (selon l’emplacement de la cuve modélisé).</li>
		<li>Le sens de rotation de la pompe est correct (ordre d’écoulement : pompe > amortisseur > caillot > fluorimètre > réservoir > pompe).</li>
		<li>Si le régime de la pompe est réglé très haut (>150 tr/min), démarrez à une vitesse plus lente et augmentez la vitesse pour vous assurer que le changement rapide de pression ne fragmente pas le caillot ou ne provoque pas de fuite du tuyau.</li>
		<li>S’assurer que le système enregistre correctement les données du fluorimètre et/ou que les fournitures sont préparées pour l’échantillonnage périodique de la phase mobile pour les lectures de points temporels après l’expérience.</li>
	</ol></li>
	<li>Allumez la pompe et réglez-la pour atteindre le débit volumétrique souhaité de 160 mL/min ou augmentez le débit jusqu’à ce que la pression souhaitée soit atteinte. Le système se remplira de liquide et de bulles. Les bulles augmenteront artificiellement les lectures fluorométriques, alors surveillez les bulles pour qu’elles disparaissent. Une fois qu’ils l’ont fait, éteignez les lumières et commencez l’acquisition des données.</li>
	<li>Laissez la pompe fonctionner jusqu’à ce que le caillot soit considérablement dégradé ou que le temps expérimental souhaité se soit écoulé (≥60 min). Ajoutez des réactifs, au besoin, au système tout au long de l’expérience via le réservoir pour créer des conditions expérimentales uniques testant une variété de variations thrombolytiques. REMARQUE : La durée de l’expérience dépendra du débit de la pompe (niveau de cisaillement) et de la concentration de thrombolytique.</li>
	<li>Une fois le test terminé, réduisez le débit volumétrique et retirez le tube d’entrée pendant que la pompe fonctionne encore pour pousser la majeure partie du fluide du système dans le réservoir (une partie de la phase mobile restera dans le tube). Débranchez la section du tube contenant le caillot du côté du capteur de pression de sortie du tube et abaissez-le dans un bateau de pesée.</li>
	<li>Retirez les aiguilles qui maintiennent le caillot en place pour recueillir le liquide restant de l’intérieur du système et le caillot/fragments de caillot. Utilisez une seringue pour aider à nettoyer le système au besoin.</li>
	<li>Pesez et traitez le caillot restant pour des analyses supplémentaires telles que le calcul du pourcentage de masse perdue ou pour l’histologie.</li>
</ol>5. Nettoyage du système
<ol><li>Entre les échantillons, rincez l’ensemble du système à l’eau tiède à haut régime (>150 tr/min). Chargez l’eau dans le réservoir et faites couler l’eau dans le système pendant au moins 2 min, videz-la et revenez deux fois pour rincer complètement le système. Après ces rinçages, si la lecture du fluorimètre ne revient pas à la valeur de base, répétez le processus de rinçage pour un cycle supplémentaire. S’il n’est toujours pas revenu à la ligne de base, changez complètement le tube avant d’analyser l’échantillon suivant. REMARQUE : Au cours des expériences, les tubes peuvent être réutilisés entre les échantillons ; Cependant, en raison de la perforation avec des aiguilles utilisées pour maintenir le caillot en place, la section du tube entre les capteurs de pression d’entrée et de sortie doit être remplacée après chaque passage. Dans certaines conditions expérimentales, il peut être nécessaire de remplacer l’ensemble de la tubulure après chaque analyse ou chaque analyse de regroupement pour éliminer toute contamination croisée de l’échantillon.</li>
	<li>Une fois que tous les échantillons ont été analysés pour l’expérimentation de la journée, retirez tous les tubes et jetez-les. Frottez les jonctions en T avec de l’eau chaude et une brosse à poils jusqu’à ce qu’elles soient propres, laissez sécher et rincez les amortisseurs de seringue à l’eau chaude. Utilisez 70% d’EtOH pour aider à la stérilité.</li>
</ol>

Combinaison de la boucle de Chandler et du RT-FluFF pour la surveillance ex vivo de la lyse des caillots

<ol>
	<li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+of+thrombolytic+therapy:+a+review.">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).</li><li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke.">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+ischemic+stroke+models:+replicating+human+stroke+pathophysiology.">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li><li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy.">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).</li><li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs.">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14 (2006).</li><li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution.">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis.">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li><li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis.">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro.">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li><li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows.">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).</li><li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+haemostasis:+A+review.">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833 (2020).</li><li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis.">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li><li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model.">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).</li><li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets.">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li><li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture.">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).</li><li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop.">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li><li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps.">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li><li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization,+fibrinogenolysis,+or+fibrinolysis.">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Formation et étiquetage des caillots Il a été démontré que la boucle de Chandler fournit un moyen facile et efficace de générer de manière reproductible des caillots qui imitent les thrombus16 in vivo. Des paramètres de réglage précis tels que la taille du tube, les vitesses de rotation, le diamètre du tambour et le temps de coagulation permettent la génération rapide de caillots dans différentes conditions de cisaillement qui peuvent capturer des caract...

Les maladies découlant fondamentalement d’étiologies thrombo-emboliques représentent une source majeure de morbidité et de mortalité dans la société actuelle. Les manifestations de la pathogenèse thrombo-embolique comprennent, sans s’y limiter, les infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires1. Une énorme quantité de recherches en cours, couvrant plusieurs disciplines, tourne autour de la mise au point de méthodes sûres et efficaces pour traiter la thrombose pathogène. Les variations dans les manifestations artérielles et veineuses de la thrombose et les différentes localisations anatomiques ont entraîné le développement de différentes approches de traitement. Cependant, le traitement aigu repose généralement sur l’utilisation d’une thrombolyse pharmacologique via des activateurs du plasminogène avec un potentiel de thrombectomie mécanique dans certaines circonstances cliniques2.
Le développement de nouvelles stratégies de traitement pharmacologique repose fondamentalement sur des modèles animaux in vivo et des modèles de digestion in vitro pour les essais précliniques 3,4. Les modèles in vivo bénéficient naturellement de leur capacité à capturer l’interaction complexe de divers paramètres physiologiques sur l’efficacité du traitement, y compris la clairance des agents pharmaceutiques ainsi que les interactions cellulaires avec les médicaments. Cependant, cette même complexité rend souvent ces modèles très coûteux et pose des problèmes supplémentaires lorsqu’il s’agit d’isoler la pharmacodynamique/cinétique sous-jacente chez les animaux qui diffère considérablement de la physiologie humaine. Le développement de modèles in vitro a contribué à faciliter un cadre de test distillé dans lequel le développement et le criblage de médicaments peuvent être effectués, mais manque souvent de la fidélité nécessaire pour récapituler l’état pathologique étudié.
Les protocoles in vitro courants pour tester de nouveaux thrombolytiques reposent sur l’utilisation de caillots formés et lysés dans des conditions statiques où la masse résiduelle du caillot sert de critère d’évaluation principal 5,6. Malheureusement, ces techniques ne tiennent pas compte des aspects mécaniques de la lyse des caillots, tels que l’écoulement turbulent et les chutes de pression trans-thrombus qui peuvent modifier considérablement la pharmacodynamique des médicaments testés. De plus, les caillots formés dans des conditions statiques contiennent une microarchitecture qui diffère des caillots physiologiques. Il a été démontré de manière reproductible que la présence d’un cisaillement lors de la formation d’un caillot a un impact sur les caractéristiques du caillot résultant, telles que l’activation plaquettaire et la réticulation de la fibrine. Les caillots produits sous l’effet d’un écoulement de cisaillement présentent une hétérogénéité complexe de la pointe à la queue qui est absente dans les caillots formés statiquement 7,8. De tels écarts par rapport à l’architecture physiologique du caillot peuvent avoir un impact important sur la caractérisation du développement de médicaments, y compris la pénétration du médicament dans un thrombus et l’efficacité de la lyse ultérieure9.
Pour remédier à certaines de ces limitations associées à l’utilisation de modèles statiques de coagulation/lyse de caillot, l’adoption de la boucle de Chandler pour la formation de caillots et la lyse de caillots en présence de cisaillement a entraîné une résurgence10. Bien que de tels systèmes permettent une meilleure représentation de la dynamique de l’écoulement et génèrent des caillots avec une architecture plus pertinente sur le plan physiologique par rapport aux tests relativement statiques, leurs conditions d’écoulement simplifiées représentent tout de même un écart par rapport aux conditions physiologiques. Enfin, des approches microfluidiques ont également été entreprises en raison de leur facilité d’imagerie et de leurs modèles d’écoulement uniformes ; Cependant, ils restent une élimination significative des conditions physiologiques attendues dans les gros vaisseaux principalement affectés dans la plupart des troubles thrombo-emboliques cliniquement pertinents11,12.
En gardant à l’esprit la discussion ci-dessus, nous avons développé un modèle de thrombolyse in vitro haute fidélité pour le dépistage préclinique des médicaments thrombolytiques. Le modèle vise à s’attaquer à certains des pièges actuels décrits ci-dessus dans le domaine du dépistage des nouvelles thérapies thrombolytiques et a été validé pour sa reproductibilité et sa sensibilité à des concentrations variables d’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le système décrit dans le présent document offre des écoulements de cisaillement physiologiques à l’aide d’une pompe péristaltique, d’un amortisseur de pression, d’un réservoir chauffé, de deux capteurs de pression, d’un fluorimètre en ligne et d’un analogue de caillot formé par cisaillement en boucle de Chandler marqué par fluorescence pour faciliter le suivi en temps réel de la fibrinolyse13. Dans l’ensemble, le système global s’appelle le test de fibrinolyse à flux fluorométrique en temps réel (RT-FluFF Assay)14 et ce manuscrit aborde les subtilités de la mise en place et de l’exécution réussies des tests dans ce modèle de thrombolyse in vitro haute fidélité.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G&#160;Disposable Hypodermic Needles</td>
			<td>Exel International&#160;</td>
			<td>26439</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>B07SXGSQ82</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>MLB3</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus , dampeners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans HemoMed Pod</td>
			<td>Drager</td>
			<td>5588822</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans Patient Monitor</td>
			<td>Drager</td>
			<td>SC 7000</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chandler loop,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield</td>
			<td>Moxe</td>
			<td>SHIELDS10</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>30600-04</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (FITC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>119245000</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2839</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate 4 &#215; 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1152016H</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-SPL</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Whole Blood&#160;</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-WB-SDS&#160;</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>77200-62</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7528-10</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor Speed Controller</td>
			<td>CoCocina</td>
			<td>ZK-MG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6151-0312</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump tubing&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06424-15&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching Power Supply</td>
			<td>SoulBay</td>
			<td>UC03U</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S751010</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue plasminogen activator, human</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0831</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 1/4&#39;&#39;, OD 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AGL00017</td>
			<td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 5/32&#34;, OD 7/32&#34;</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ND-100-65, ADF 00009&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td>
			<td>uvBeast</td>
			<td>uvB-V3-365-MINI</td>
			<td>Chandler loop, used to check completed clots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td>
			<td>Pangyoo</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking fibrinolysis of chandler loop-formed whole blood clots under shear flow in an in-vitro thrombolysis model

La thromboembolie et les complications qui y sont associées sont l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde, et divers tests ont été mis au point pour tester l’efficacité des médicaments thrombolytiques in vitro et in vivo. Il existe une demande croissante de modèles de caillots in vitro plus pertinents sur le plan physiologique pour le développement de médicaments en raison de la complexité et du coût associés aux modèles animaux, en plus de leur manque souvent de translatibilité à la physiologie humaine. Le débit, la pression et le taux de cisaillement sont des caractéristiques importantes du système circulatoire, les caillots qui se forment sous l’écoulement présentant des caractéristiques de morphologie et de digestion différentes de celles des caillots formés statiquement. Ces facteurs sont souvent non représentés dans les tests conventionnels de digestion par caillot in vitro , ce qui peut avoir des implications pharmacologiques qui ont un impact sur les taux de réussite de la traduction des médicaments.
Le testd’ibrinolyse orométrique F lowing FR eal-T ime Flu(RT-FluFF) a été développé en tant que plate-forme de test de thrombolyse haute fidélité qui utilise des caillots marqués par fluorescence formés sous écoulement de cisaillement, qui sont ensuite digérés à l’aide de plasma circulant en présence ou en l’absence d’agents pharmaceutiques fibrinolytiques. La modification des débits des étapes de formation et de digestion des caillots permet au système d’imiter les conditions artérielles, pulmonaires et veineuses dans des configurations expérimentales très diverses. Les mesures peuvent être prises en continu à l’aide d’un fluorimètre en ligne ou en prenant des points temporels discrets, ainsi qu’une mesure conventionnelle de la masse du caillot final. Le test RT-FluFF est un système flexible qui permet le suivi en temps réel de la digestion des caillots dans des conditions d’écoulement qui représentent plus précisément les conditions physiologiques in vivo tout en conservant le contrôle et la reproductibilité d’un système de test in vitro.

Diseases fundamentally stemming from thrombo-embolic etiologies present a major source of morbidity and mortality in present-day society. Manifestations of thrombo-embolic pathogenesis include, but are not limited to, myocardial infarctions, ischemic strokes, deep venous thromboses, and pulmonary emboli1. A tremendous amount of ongoing research, spanning multiple disciplines, revolves around the development of safe and effective methods for dealing with pathogenic thrombosis. Variations in arterial and venous manifestations of thrombosis and varying anatomic locations have resulted in the development of different treatment approaches. However, acute treatment generally relies on the use of pharmacologic thrombolysis via plasminogen activators with the potential for mechanical thrombectomy under certain clinical circumstances2.
The development of novel pharmacologic treatment strategies fundamentally relies on both in-vivo animal models and in-vitro digestion models for preclinical testing3,4. In-vivo models naturally benefit from their ability to capture the complex interaction of various physiologic parameters on treatment efficacy that include clearance of pharmaceutical agents as well as cellular interactions with drugs. However, this same complexity often makes such models quite costly and introduces additional issues when attempting to isolate underlying pharmaco-dynamics/kinetics in animals that significantly differ from human physiology. The development of in-vitro models has helped by facilitating a distilled testing setting in which drug development and screening can be performed but often lacks the fidelity necessary to recapitulate the disease state being studied. 
Commonly found in-vitro protocols for testing novel thrombolytics rely on the utilization of clots formed and lysed under static conditions whereby the residual clot mass serves as the primary endpoint5,6. Unfortunately, such techniques fail to account for the mechanical aspects of clot lysis such as turbulent flow and trans-thrombus pressure drops that can significantly alter the pharmacodynamics of test drugs. Additionally, clots formed under static conditions contain microarchitecture that differs from physiologic clots. The presence of shear during clot formation has reproducibly been shown to impact the resulting clot characteristics such as platelet activation and fibrin-crosslinking. Clots being produced under shear flow exhibit complex heterogeneity from tip-to-tail that is absent in statically formed clots7,8. Such departures from physiologic clot architecture may impact important drug development characterization that includes drug penetration within a thrombus and subsequent lysis efficiency9. 
To address some of these limitations associated with the use of static clotting/clot-lysis models, the adoption of the Chandler loop for both clot formation and clot lysis in the presence of shear has seen a resurgence10. Although such systems allow for a better representation of flow dynamics and generate clots with more physiologically relevant architecture compared to relatively static assays, their simplified flow conditions still represent a deviation from physiologic conditions. Lastly, microfluidic approaches have also been undertaken due to their ease of imaging and uniform flow patterns; however, they remain a significant removal from the physiologic conditions expected within the larger vessels primarily affected in most clinically relevant thrombo-embolic disorders11,12. 
With the above discussion in mind, we developed a high-fidelity, in-vitro thrombolysis model for preclinical thrombolytic drug screening. The model aims at addressing some of the current pitfalls detailed above in the realm of novel thrombolytic therapy screening and was validated for reproducibility and sensitivity at varying concentrations of tissue plasminogen activator (tPA). The system described herein offers physiological shear flows utilizing a peristaltic pump, a pressure dampener, a heated reservoir, two pressure sensors, an in-line fluorometer, and a fluorescently labeled Chandler loop shear-formed clot analog to facilitate real-time tracking of fibrinolysis13. Taken together, the overall system is called the Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 and this manuscript will discuss the intricacies of successfully setting up and running assays in this high-fidelity in-vitro thrombolysis model.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser les tests thrombolytiques en intégrant la dynamique des écoulements dans les modèles in vitro

Suivi de la fibrinolyse de caillots de sang total formés en boucle de Chandler sous flux de cisaillement dans un modèle de thrombolyse in vitro

Formation de caillot en boucle de Chandler Lors de la formation des caillots, nous avons généralement visé des quadruples pour nous assurer que s’il existait des valeurs aberrantes de caillots (basées sur la morphologie et la masse macroscopiques), nous avions toujours la capacité d’effectuer des tests de thrombolyse en triple. En supposant des conditions de charge optimales, les caillots devraient tous être assez uniformes en longueur (~3,3 cm), en poids (~100 mg) et en apparence, comme le ...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

Les tests de thrombolyse in vitro ont souvent eu du mal à reproduire les conditions in vivo, que ce soit dans le thrombus modèle digéré ou dans l’environnement dans lequel la thrombolyse se produit. Dans cet article, nous explorons comment le couplage de la boucle de Chandler et du test de fibrinolyse par écoulement fluorométrique en temps réel (RT-FluFF) est utilisé pour la surveillance de la lyse des caillots haute fidélité, ex-vivo.

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

La thrombose est associée à de nombreuses conditions médicales et les traitements actuels risquent de provoquer des saignements graves. Le flux circulatoire a un impact significatif sur la structure des caillots sanguins. L’intégration du flux dans les modèles in vitro peut améliorer leur pertinence physiologique, ce qui améliorera la sélection de meilleurs candidats pour les tests in vivo.Les tests pour l’étude des fibrinolytiques utilisent principalement des caillots statiques ou des systèmes microfluidiques pour évaluer des propriétés telles que le temps de lyse, la structure du caillot ou la viscoélasticité. Les tests de lyse statique des caillots reposent généralement sur des mesures spectrophotométriques ou la détermination de la masse du caillot comme critères d’évaluation de l’efficacité de la fibrinolyse. Les tests thrombolytiques actuels utilisent des caillots formés statiquement, qui diffèrent structurellement de ceux formés dans des conditions d’écoulement.Les systèmes microfluidiques prennent en compte la dynamique de l’écoulement, mais leurs échelles plus petites créent une hémodynamique et des structures de caillot uniques. Le test RT-FluFF actuellement développé facilite le suivi de la fibrinolyse en temps réel dans des conditions de flux physiologiques. Cela signifie que nous disposons désormais d’une plate-forme qui permet de contrôler plusieurs paramètres pour imiter les conditions plus proches des modèles d’étude in vivo pour une meilleure traduction lors du criblage de nouveaux thrombolytiques.

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

595 vues.  Indiana University School of Medicine. La thrombose est associée à de nombreuses conditions médicales et les traitements actuels risquent de provoquer des saignements graves. Le flux circulatoire a un impact significatif sur la structure des caillots sanguins. L’intégration du flux dans les modèles in vitro peut améliorer leur pertinence physiologique, ce qui améliorera la sélection de meilleurs candidats pour les tests in vivo.Les tests pour l’étude des fibrinolytiques utilisent principalement des caillots sta...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser les tests thrombolytiques en intégrant la dynamique des écoulements dans les modèles in vitro

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test thrombolytic drug efficiency both in vitro and in vivo. There is increasing demand for more physiologically relevant in-vitro clot models for drug development due to the complexity and cost associated with animal models in addition to their often lack of translatability to human physiology. Flow, pressure, and shear rate are important characteristics of the circulatory system, with clots that are formed under flow displaying different morphology and digestion characteristics than statically formed clots. These factors are often unrepresented in conventional in-vitro clot digestion assays, which can have pharmacological implications that impact drug translational success rates.
The Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) assay was developed as a high-fidelity thrombolysis testing platform that uses fluorescently tagged clots formed under shear flow, which are then digested using circulating plasma in the presence or absence of fibrinolytic pharmaceutical agents. Modifying the flow rates of both clot formation and clot digestion steps allows the system to imitate arterial, pulmonary, and venous conditions across highly diverse experimental setups. Measurements can be taken continuously using an in-line fluorometer or by taking discrete time points, as well as a conventional end point clot mass measurement. The RT-FluFF assay is a flexible system that allows for the real-time tracking of clot digestion under flow conditions that more accurately represent in-vivo physiological conditions while retaining the control and reproducibility of an in-vitro testing system.

In-vitro thrombolysis assays have often struggled to replicate in-vivo conditions whether in the model thrombus being digested or in the environment in which thrombolysis is occurring. Herein, we explore how coupling the Chandler loop and Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) is used for high-fidelity, ex-vivo, clot lysis monitoring.