EJV는 미국의 Crohn S &amp; 대장염 재단 (CCFA)의 화목에 의해 지원됩니다. JRM은 CCFA, 암 연구소 (크리), 하워드 H. 굿맨 (MGH), 매사 추세츠 생명 과학 센터 (MLSC)와 NIH 원장의 새로운 이노 수상의 기금에 의해 지원됩니다.

인내심을 추적 및 제어 T 세포 1. 전의 생체내 생성 (그림 1 참조) <ol><li> 야생 타입 마우스로부터 비장을 mashing하여 splenocytes를 분리. 5 &#39;400 X G.에 대한 세포의 PBS의 서스펜션과 원심 분리기를 Resuspend 뜨는을 제거 후 2-3 분 동안 ACK 용해 완충액 4 ML에있는 세포 펠렛을 resuspending하여 적혈구를 lyse. 그 후, PBS 5 ML를 추가합니다. 5 &#39;400 XG에 대한 원심 분리기 및 뜨는을 제거하십시오. </li><li> 1 총 splenocytes을 Resuspend X 10 6 IMDM의 / ML + 10% FBS + 50 MM 2 - 메르 캅 토 에탄올 + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (완료 IMDM). 100-200 NM 3 최종 농도 RA (또는 Am80 또는 Am580 같은 합성 RAR - agonists)와 보충 하나 중 두 그룹에서 세포를 분리. RA 또는 RAR - agonists의 면전에서 활성화된 T 세포가 a4b7and CCR9을 upregulate하고 RA 않고 활성화된 T 세포가 조절 T 세포가 될 반면, 인내심을 트로픽 T 세포가 될 것입니다. </li><li> 이전에 반대 인 경우에는 3 번 CD (10 MG / ML) 및 안티 CD28 (10 MG / ML)로 코팅 24 잘 접시의 각각 잘 수있는 세포 현탁액의 1.5-2.0 ML을 추가하고 37 품어 ° C를 5 % CO에 2 (코팅 접시 500 ML / 음의 안티 인 경우에는 3 번 CD 플러스 37에서 2 시간 동안 PBS과 부화에 안티 CD28을 추가 ˚ C 후 2 ML PBS로 두 번 세척). </li><li> T 세포 overstimulation을 방지하기 위해, 2-3 일 후에 새로운 uncoated 24 잘 접시에 세포 suspensions를 전송할 수 있습니다. 추가 2-3 일동안은 알을 품다. 세포 밀도와 확산에 따라 미디어는 신선한 완료 IMDM으로 미디어의 절반을 교체해야 할 수도있는 경우에 산성 (노란색)이 될 수도 있습니다. 4~5일 (일 0부터 계산) 후 세포를 수확. </li><li> 일반적인 최종 수확량은 X 10 6 효과기 T 세포 / 잘 1-2아르. 따라서, 각각의 인내심을 트로픽 T 세포 및 제어 T 세포의 9-12 웰스의 최소 조건 10-20 X 10 6 T 세포와 최종하기 위해 도금한다. </li></ol> 2. 활성화된 T 세포에 대한 인내심을 유도 수용체 분석 문화 4~5일 후 우리는 통제 T 세포가 이러한 수용체 4 매우 낮은 수준을 표현한다 반면, RA 또는 RAR agonists의 면전에서 활성화된 T 세포에 대한 인내심을 유도 수용체 a4b7and CCR9 높은 표현을 준수해야합니다. 유동세포계측법 (외과) 분석. <ol><li> 4 300g에서 5 분 0.2-0.5 X10 6 셀 및 원심 분리기 사이의 수집 ° C. </li><li> 4 15 분 ° 어둠 속에 C에 대한 안티 - CD4 - FITC, 안티 - a4b7 - PE (BD Biosciences), 안티 - CCR9 - APC (eBiosciences) 및 안티 - CD8 - PercP와 부화. </li><li> 부화 후, g 4 ° C. 300에서 5 분 원심 분리기 세척 및 resuspend 세포를 버퍼를 얼룩과 외과에 의해 분석할 수 있습니다. </li></ol> 3. CFSE 및 CMTMR 세포 추적기와 T 세포 라벨 <ol><li> 37 모든 솔루션을 보관 ° C를 시작하기 전에. 와시 직감을 트로픽 T 세포 (a4b7 높은 CCR9 하이) 및 제어 T 세포는 (a4b7 낮은 / Neg CCR9 낮은 / Neg) 두 번 PBS로 혈청을 제거합니다. 10-15 × 10 6 / PBS에 ML하는 T 세포의 농도를 조정합니다. </li><li> 에서 부드럽게 와동 20 분 품어 각각 5 밀리미터 및 10 mm의 최종 농도 인내심 트로픽 T 및 제어 T 세포 중 하나에 CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르) 또는 CMTMR (chloromethyl - 벤조일 - 아미노 tetramethylrhodamine) fluorophores 추가 37 ° C. 이것은 T 세포 이주에 fluorophores의 잠재적인 본질적인 영향을 제외하기 위해 동일 또는 별도의 실험에서 labelings를 교환하는 것이 좋습니다. </li><li> 부화 후, 상온에서 1-5 분 FBS와 부화 1 볼륨 끄다. 따뜻한 PBS로 10 배 희석 300 G.에서 5 분 원심 분리기 전체 IMDM의 PBS와 resuspend로 두 번 씻으십시오. </li><li> 이상적으로, 각 T 인구의 10-20 X 10 6 세포는 1:1 비율로 혼합 후 5 분 300 XG에 centrifuged해야합니다. 마지막으로, 따뜻한 PBS의 200-250 ML에있는 세포를 resuspend와 꼬리 정맥을 통해 주입. </li><li> 정확한 입력 비율 (1 이상을 닫습니다)를 계산하기 위해서는 주입 세포 현탁액의 50-10 ML을 저장하고 희석 PBS 300 ML과 외과하여 분석할 수 있습니다. </li></ol> 4. 유도 T 세포 분석 마우스가 다양한 시간 포인트 (1 H와 며칠 게시물 T 세포 주입 사이)에서 분석할 수 있지만, 인내심을 트로픽 T 세포의 유도는 최고의 12-24 H 포스트 분사 사이에 문서화되어있다. 긴 시간 포인트는 T 세포 apoptosis와 조직에서 T 세포 출구로 최종 휴대 전화 번호 / 비율을 영향을 미치는 다른 변수의 잠재 효과를 향상시킬 수 있습니다. 생쥐가 여러 조직에서 euthanized, 휴대 suspensions는 세포 죽음을 감소하기 위해 지체없이 격리되어야 후, 이것은 최종 산출 및 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 관심 조직은 소장, 대장, 비장, 림프절, Peyer의 패치, 간, 폐, 혈액 있습니다. 면주입 T 세포가 타고난 인내심 트로픽 T 세포 있으며, 그들은 T 세포를 제어에 비해 작은 창자의 점막에 평균 5-10 배 더 나은 (또는 이상)에서 가정해야합니다. 그러나, 혈액 및 비장 등의 조직은, 우선 T 세포의 마이 그 레이션을 전시 안됩니다. 창자 라미나의 propria 및 intraepithelial 구획에서 lymphocytes의 분리는 이전에 다음 ID로 5 설명했습니다. <ol><li> 외과의 얼룩 : 샘플 3.0 X 10 6 세포 / ML 이상의 밀도에서 수집된 세포의 숫자에 따라 resuspended 있습니다. 경우 congenic CD45.1 + 또는 Thy1.1 + 마우스가받는 사람으로 사용되었다, 세포 일부 혈통 표시 (예, TCRbchain, CD4, CD8와 함께 해당 congenic 마커 (예 : CD45.2 또는 Thy1.2)에 묻은 게있다 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> 외과 분석하는 동안, 세포는 congenic 마커 (예 : CD45.1)에 다음 특정 혈통 표시 (예 : CD4/CD8)에 문이 및 CMTMR 및 CFSE 긍정적인 세포 사이의 비율에 대한 분석입니다. </li><li> 데이터는 일반적으로 해당 입력 비율 (아래 참조)으로 나눈 각 조직의 비율 CFSE / CMTMR (또는 CMTMR / CFSE)로 계산됩니다 호밍 지수 (HI)으로 표시됩니다. 입력 비율이 1 아주 가까이있다면, 조직 비율은 HI에 상응하는 것입니다. </li></ol> HI = CFSE 조직 / CMTMR 조직 : CFSE 입력 / CMTMR 입력 혈액은 또한 모두 T 세포 인구가 균일하게 순환으로 표시됩니다 또는 한 T 세포 인구가 다른 경의를 (예, 폐 / 간에 우선 트래핑하거나 감소 생존 능력에 의해) 감소하는 경우 여부를 확인하기 위해 분석해야합니다. 후자가 폐에 더 큰 정도 갇혀있을 때문에, 순진하거나 쉬고​​있는 메모리 T 세포 대 최근 활성화 효과기 T 세포를 비교하면 이러한 문제가 발생할 수 있습니다. 혈액의 HI는 1보다 크게 다른 경우, 하나는 혈액에서 HI에 의해 조직에서 인사 정상화 수 있습니다. 혈액은 anesthetized 생쥐에서 심장 펑크 (avertin 또는 isofluorane 사전 안락사)를 통해 얻을 수 있으며, 외과의 얼룩을 위해 사용하기 전에 ACK 버퍼 번 lysed해야합니다. 혈액 정규화는 = HI 조직 / HI 블러드 5. 대표 결과 받는 마우스 (Thy1.1 +)는 euthanized18h 게시물 세포 주입했다. 셀 suspensions은 비장, 주변 림프절 (PLN), mesenteric 림프절 (MLN)과 소장의 라미나의 가끔하는 (LP)에서 생성되었습니다. 세포는 Thy1.2와 CD8을위한 스테인드 그리고 마지막 CMTMR + 세포 (인내심을 트로픽 T 세포)와 CFSE 사이의 비율에 대한 분석했다 가능한 Thy1.2 + CD8 + 세포에 게이팅로 외과에 의해 분석되었다 그 후 + 입력 비율로 나눈 전지 (제어 T 세포). 결과는 같은가 인내심을 트로픽 및 제어 T 세포가 균일하게 비장 (HI 빨간색 라인 표시, to1를 닫습니다)로 이동된 것을 감상할 수있는 그림 2와 같이 표시할 수 있습니다. T 세포를 제어에 비해 대조적으로, 인내심을 트로픽 T 세포는 LP에보다 효율적으로 10 번 주위를 마이 그 레이션. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="그림 1" /> Figure1 :. 창자 - 트로픽 및 비 직감 트로픽 T 세포의 생성 및 라벨을 보여주는 T 세포가 다이어그램은 야생 타입 마우스으로부터 격리 및 anti-CD3/anti-CD28과 100-200 nm의 존재 또는 부재 모두 활성화됩니다 - 트랜스 retinoic 산 (RA). 4~5일 후 RA - 취급 T 세포 수용체 용기를 유도 CCR9 및 a4b7의 표현을 획득. 그렇다면, 인내심을 트로픽 및 제어 T 세포는 differentially 1:1 비율로 혼합하여 꼬리 정맥을 통해받는 마우스에 주입, 씻어, CFSE 또는 CMTMR으로 표시됩니다. 일부 레이블이 세포는 CFSE / CMTMR 입력 비율 (종료 1한다)를 결정하는 데 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="그림 2" /> Figure2 :. 돌입 분석의 예 마우스가 12-18 H 게시 T 세포 주입 및 단일 세포 suspensions가 관심의 기관에서 얻을 수있다 분석했다. 세포는 다음 방지 Thy1.2 (congenic 마커) 플러스 안티 - CD8 및 Thy1.2 물들일 아르 + CD8 + T 세포가 CMTMR의 비율에 대한 분석 아르 +와 CFSE + 외과 각 조직의 세포. 조직 CMTMR / CFSE 비율은 다음 위치 추적 색인 (HI)을 구하는 입력 CMTMR / CFSE 비율로 정상화됩니다. 이 예제 CMTMR의 +와 CFSE에 + 세포는 각각 직감 - 트로픽 및 제어 효과기 T 세포입니다.

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

유도 실험 특정 조직에서 전체 세포 인구의 마이 그 레이션하는 것에 대한 매우 귀중한 정보를 제공하더라도, 그것은 이러한 assays 직접 내피 접착력을 분석하지 않으며 따라서 차별하지 않는 마음에 보관되어야하는 다단계 부착의 어느 단계 (S)에 캐스케이드 (tethering / 인증 또는 고집 롤링) 지정된 추적 수용체는 행동이다. 유착 층계에 들어가고 수용체의 특정 역할을 정의하는 황금 표준은 개별 ...

동물 : C57BL / 6 마우스는 일반적으로 T 세포 절연을 위해 사용됩니다. 또한, CD45.1 및 Thy1.1 congenic 계통 잭슨 연구소 (바 하버, ME)를 통해 사용할 수 있습니다. 문화 미디어 : IMDM (Iscove의 수정 Dulbecco의 중간 + L - 글루타민 + Hepes) 플러스 10% 열 inactivated 100 U / ML 페니실린과 보충 FBS (태아 소 혈청, 낮은 내독소, Gibco ®, Invitrogen, 칼스 배드, CA), 100 MG / ML 스트렙토 마이신 (항생제의 HyClone, 월섬, MA), 0.5은 MG / ML fungizone / amphotericin B (Gibco), 50 MM B - 메르 캅 토 에탄올. ACK 적혈구 세포 용해 버퍼 (RBC, 10 MM KHCO 3, 150 MM NH 4 Club 호텔, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0)) 산도 7.2-7.4와 실온에서 저장을 조절할 수 있습니다. PBS (인산이 살린, Hyclone, 월섬, MA를 버퍼). 유동세포계측법 (외과) 미디어 (PBS 또는 IMDM + 2퍼센트 FBS + 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 이 MM CA와 Selectin - FC chimeras, 미디어를 사용하면 얼룩 + + 모든 단계 (외과 인수 포함)에 사용해야합니다. IMDM이 경우에 권장합니다. T 세포 라벨링 및 입양 전송 : CFSE (carboxyfluorescein 디아 세 테이트, succinimidyl 에스테르), CMTMR - 분자 프로브에서 ((5 (그리고 - 6 )-((( 4 - chloromethyl) 벤조일) 아미노) tetramethylrhodamine) ®, Invitrogen, 칼스 배드, CA ). 1000 X 주식은 DMSO로 작성 (5 MM의 CFSE, 20 MM CMTMR)와 -20 ° C.에 보관해야 Polyclonal T 세포 활성화 : 24 - 글쎄 또는 96 - 웰 플레이트는 (조직 문화 처리, 뚜껑이있는 평면 바닥 폴리스티렌, BD 팔콘, 프랭클린 레이크스, NJ)는 ° C와 50 ML PBS, 각각 37에서 2 시간 동안 incubated 아르 , 안티 인 경우에는 3 번 CD 플러스 안티 CD28 항체 (10 MG / ML 각)이있는. 그런 다음, 문화 플레이트는 PBS로 두 번 씻어하고 T 세포 문화의 즉시 사용됩니다. 또는 anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, 칼스 배드, CA)로 코팅 Dynabeads 대신 판 - 바운드 항체의 T 세포 활성화에 사용할 수 있습니다. 유동세포계측법 (외과) 얼룩 : Polyclonal 인증 : 인 경우에는 3 번 CD (1452C11), CD28 (37.51). 리니지 mAb : CD4 (L3T4), CD8a (LY - 2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). 인내심을 유도 수용체 : 정화 CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, 샌디에고, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotype 제어 (IgG2a, K). 피부 유도 수용체 : P - selectin - FC (정화 마우스 P - Selectin - IgG의 융합 단백질, BD Pharmingen, 산호세, CA), E - selectin - FC (재조합 마우스 E-Selectin/Fc 치메라, ​​R &amp; D 시스템, 미네 아 폴리스, MN) 플러스 해당 보조 시약의 염소 F (AB &#39;) 2 안티 인간 IgG R - PE (Invitrogen, 칼스 배드, CA). 모든 트랜스 retinoic 산이 (시그마, 세인트 루이스, MO) 준비 중에 노란색 전구 또는 조명의 간접 소스를 사용하여 절대 에탄올 또는 DMSO에 resuspended 있습니다. -80에서 유리 튜브 안에 저장 aliquots ° C와 항상 빛으로부터 보호. 합성 RAR - agonists : Am80 (와코 화학 물질, 리치몬드, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

발휘하기 위해서는 자신의 기능 lymphocytes은 혈액을두고 신체의 다른 조직으로 마이 그 레이션해야합니다. 내피 세포 및 조직 넘쳐 흐름에 림프구 접착력이 lymphocytes과 내피 세포 1 2에 표시된 각각의 리간드 (addressins)에 표시 다른 접착 분자에 의해 통제 다단계 프로세스 (유도 수용체)입니다. 이러한 유착 수용체의 기능이 부분적으로 공부를 할 수 있지만 전 생체내 자신의 생리 관련에 대한 궁극적인 시험은 생체내 림프구 접착 및 마이 그 레이션에 동안 자신의 역할을 평가하는 것입니다. intravital 현미경 (IVM)과 유도 실험 : 두 개의 상호 보완적인 전략이 목적을 위해 사용되었습니다. IVM은 실시간으로 가능하고 다른 조직에 유착 폭포 중 특정 유착 수용체의 정확한 기여를 정의하는 필수되어 있지만, IVM은 집중 시간이 소요과 노동, 그것은 종종 정교한 수술 기법의 개발이 필요, 그것은 단일의 사전 격리 필요 세포 인구와 어떤 주어진 시간에 하나의 조직 / 기관의 분석을 수 있습니다. 반대로, 경쟁 유도 실험 같은 마우스의 두 마이 그 레이션 (혹은 이상) 셀 집합에 직접적이고 동시 비교를 허용하지 않으며 그들은 또한 많은 조직과 같은 실험에서 세포의 높은 숫자의 분석을 허용합니다. 여기서 우리는 제어 셀 인구에 비해 같은 특정 조직에 집으로 주어진 세포 유형의 장점 / 단점을 확인하는 데 사용되는 전통적인 경쟁 유도 프로토콜을 설명합니다. 창자 점막이 외부 환경과의 접촉에서 가장 큰 몸 표면이기 때문에 우리는 인내심을 트로픽 대 인내심 트로픽 비 T 세포의 철새 속성을 설명하기 위해 선택하고 또한 최고의 정의 철새 요구 사항을 추가 - 림프 조직이다 . 또한, 최근의 작품은 비타민이 신진 대사 모든 트랜스 retinoic 산 (RA)는 lymphocytes에 창자가 특정 유착 수용체 (인테 a4b7and의 케모카인 수용체 CCR9)를 유도에 대한 책임의 기본 분자 메커니즘 것을 확인했습니다. 따라서, 우리는 쉽게 드디어 여기에서 설명한 경쟁 유도 실험에서 사용할 수있는 각각 RA의 존재 또는 부재의 T 세포를 활성화하여 인내심을 트로픽 및 lymphocytes 인내심 트로픽 비 예 생체내 다수를 생성할 수 있습니다.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

경쟁 유도 실험 직접 하나의 마우스로 두 개의 서로 다른 세포 인구의 철새 속성을 평가하실 수 있습니다. 여기 우리는 전 생체내 생성 인내심 트로픽 대 비 직감 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 비교하여이 절차를 설명합니다.

굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

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Research

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Immunology and Infection

12.4K 조회수.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. 경쟁 유도 실험 직접 하나의 마우스로 두 개의 서로 다른 세포 인구의 철새 속성을 평가하실 수 있습니다. 여기 우리는 전 생체내 생성 인내심 트로픽 대 비 직감 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 비교하여이 절차를 설명합니다.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...