SNX-BaRs는 인간 질병에서 중요한 역할을 하는 막 리모델링 단백질입니다. 우리의 방법을 사용하여, 우리는 지질 결합 및 막 리모델링을 용이하게하기 위해 정확한 생물 학적 특성을 결정할 수 있습니다. 효모 세포로부터 SNB-BAR 단백질을 정화하면 네이티브 호모 및 이테로 SNX-BAR 디머를 획득하는 동시에 비네이티브 발현 시스템과 자주 발생하는 독성 및 불용성을 최소화할 수 있습니다.
우리의 방법은 모든 효모 SNX-BAR의 지질 특이성을 이해하거나 다른 유기체에서 재조합 SNX-BAR 단백질을 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 압출 공정 중 리포솜 손실을 방지하는 데 올바른 압출기 조립이 필수적입니다. 초등학생이나 현장에 새로 오신 학생의 경우 가장 중요한 단계를 시각적으로 관찰하면 성공 가능성이 크게 향상됩니다.
먼저 큰 효모 세포를 플라스크로 접종하여 표준 YP 배지의 50 밀리리터를 함유한 배양물의 부피의 4배 이상을 탄소원으로 보충하고 30°C로 하룻밤 문화를 성장시키는 것으로 시작한다. 다음 날 아침, 50 밀리리터 프리 배양을 표준 YP 배지 1리터에 2%라피노스와 0.1%의 포도당을 2.8리터 부피로 접종하여 펀바흐 플라스크를 흔들어 서배양한 배양기에서 4~5시간 배양하였다. 600 나노미터의 광학 밀도가 0.2에 도달하면, 흔들리는 인큐베이터에서 하룻밤 배양을 위해 세포에 2%의 최종 농도에 갈라토스를 추가합니다.
다음 아침, 원심 분리에 의해 세포를 수확하고 효모 펠릿을 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮긴다. 정제 버퍼의 15 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 약 30 밀리리터의 최종 부피를 달성하고 세포 현탁액을 섭씨 4도로 냉각된 균질화에 적재한다. 샘플을 20~25개, 평방 인치당 000파운드로 2~3라운드로 끌어들이고, 얼음 위에 50밀리리터 원피스 튜브로 라이세이트를 옮킨다.
즉시 원심분리에 의해 세포 용양을 지우고 상체를 새로운 튜브로 조심스럽게 옮긴다. 다음으로, 4°C에서 회전하는 2시간 동안 구슬을 클리어셀 용액에 넣기 전에 정제 버퍼에 3개의 재서스펜션을 가진 IgG Sepharose 구슬 300마이크로리터를 평형화합니다. 인큐베이션의 끝에서 10 밀리리터 크로마토그래피 컬럼에 구슬을 추가하고 언바운드 라이세이터가 흐르도록 합니다.
구슬을 세척당 1밀리리터의 세척 버퍼로 10회 세척하여 다음 볼륨을 추가하기 전에 각 세척이 완전히 흐르도록 합니다. 마지막 세척 후 파이펫과 신선한 버퍼를 사용하여 구슬을 미세 원심 분리기 튜브로 옮겨 넣습니다. 구슬의 총 부피를 신선한 세척 버퍼로 500 마이크로리터에 가져와 서술에서 구슬을 제거하고 밀리리터 TEV 프로테아제 당 10 밀리그램의 두 마이크로리터로 lysate에서 구슬을 제거하여 섭씨 4도에서 회전하여 하룻밤 동안 배양할 수 있습니다.
다음 날 아침, 27 게이지 바늘을 사용하여 상체를 완전히 제거하고 단백질 순도를 10% 폴리아크릴아미드 SDS 페이지로 평가합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 브래드포드 단백질 분석기를 사용하여 농축 된 단백질을 정량화하고 섭씨 4도에서 최대 1 주일 동안 단백질을 저장합니다. 리포솜을 준비하려면 유리 주사기를 사용하여 스톡 지질을 깨끗한 유리 배양 튜브로 옮기면 1%인산염-3-인산염, 20%에르고스테롤, 30%의 포스파디딜세린, 인산다이딜린의 최종 지질 혼합물을 얻을 수 있습니다.
각 지질이 재장매되는 용매에 따라 각 지질을 첨가하면 혼합물이 흐리게 될 수 있다. 유리 튜브의 바닥에서 지질을 균일하게 취급하기 위해 원형 모션으로 혼합물에서 저유량 질소 가스를 지시하여 지질 혼합물을 조심스럽게 건조시다. 그런 다음 유리 배양 튜브를 호일로 감싸서 개구부를 발견하고 1 시간 동안 진공 상태에서 지질을 더 탈수합니다.
인큐베이션이 끝나면 각 유리병에 400 마이크로리터의 결합 버퍼를 추가하여 2.5 밀리몰러의 최종 립약 농도에서 지질을 완전히 재수화한 후 실온에서 소용돌이의 중간 속도로 지질을 30 분 동안 재연합니다. 지질이 다시 중단되면 버퍼가 흐리게 됩니다. 재중단 된 리포솜을 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 액체 질소로 튜브를 얼리고 37도 의 수증기에서 7 ~ 8 번 해동합니다.
화학 연기 후드에서, 어떤 잔류 지질을 제거하고 초순수 물과 바인딩 버퍼의 두 볼륨각 주사기를 평형각 주사기를 제거하기 위해 주사기 당 세 번 클로로 폼의 전체 볼륨과 두 밀리리터 유리 주사기를 청소. 제조업체의 권장 사항에 따라 미니 압출기를 조립합니다. 그런 다음 결합 버퍼에 있는 1개의 200 나노미터 막에 필터 지지의 2개의 조각을 잠급니다.
미니 압출기를 조립하여 완전히 밀폐되도록 하는 것이 중요합니다. 그리고 누출을 확인하는 좋은 방법은 장치를 통해 버퍼를 전달하는 것입니다. 필터 지지 사이에 멤브레인을 끼쳐 미니 압출기에 멤브레인을 배치합니다.
평형 1 밀리리터 주사기 중 하나를 사용하여, 미니 압출기를 통해 리포솜 혼합물의 부피와 유사한 결합 버퍼의 볼륨을 전달하고 다른 주사기를 사용하여 미량 원심 분리튜브를 반전시키는 리포솜 혼합물을 떨어뜨려 리포솜의 마지막 을 튜브 캡으로 수집합니다. 그런 다음 200 나노미터 멤브레인을 19~21회 제거하고 압출된 리포솜을 새로운 미세원심분리기 튜브로 수집한다. SNX-BAR 리포솜 결합 및 관제 소심을 수행하기 전에, 초원심분리에 의한 정제된 단백질을 미리 지우고 펠릿을 방해하지 않고 새로운 미세원심분리기 튜브로 상체를 전달한다.
다음으로, 정제된 SNX4-ATG20의 4개의 마이크로몰라와 2.5 밀리올러의 총 반응 부피에서 30분 동안 30분 동안 잠복할 수 있습니다. 리포솜 튜브를 시각화하고 정량화하려면 인큐베이션 끝에 즉시 샘플을 탄소 코팅 구리 메쉬 그리드에 발견하고 1%의 우란 아세테이트로 부정적인 얼룩을 발견합니다. 그런 다음 200킬로볼트에서 전염 전자 현미경의 샘플을 분석합니다.
리포솜 결합 및 침전물의 경우, 폴리카보네이트 원심분리기 튜브에 반응의 20 마이크로리터를 전송하고 초원심분리기에서 호환 라우터로 샘플을 회전시. 원심분리가 끝나면, 상체를 새로운 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 이송하고 SDS 페이지 샘플 버퍼의 40 마이크로리터에서 펠릿을 재차판으로 재차한다. 펠릿 서스펜션을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고 20마이크로리터의 샘플 버퍼를 상퍼에 추가합니다.
그런 다음 10% 폴리아크릴아미드 SDS 페이지 젤에 동등한 샘플 볼륨과 상피물을 적재하고 쿠마시 염색을 수행하여 리포솜에 결합된 SNX-BAR을 시각화합니다. SNX-BAR 발현의 적절한 유도를 확인하기 위해, 탠덤 친화 합리 태그에 대한 서쪽 블롯은 SNX-BAR의 단백질 수준으로 쿠마시 얼룩을 통해 검출되지 않을 수 있다. SNX-BAR 이종수의 정화 후, 두 SNX-BAR의 밴드는 일대일 스토이치오메트릭 비율로 나타나야하며 오염 밴드가 거의 또는 전혀 없어야합니다.
본 대표적인 분석에서, SNX-BAR 이종성기는 입증된 바와 같이 합성 리포솜에 발현, 정제 및 결합되었다. MVP1은 호모를 형성하고 예상대로 박테리아로 표현되었다는 점에 유의하십시오. 다양한 리포솜 조성물에 결합하는 SNX-BAR는 예를 들어 리포솜 결합에 대한 인산화균제의 효과를 평가하기 위해 밀도에 의해 정량화될 수 있다.
전자 현미경 이미징을 통해 SNX4-ATG20 리포솜 튜블을 측정할 수 있으며, 대부분의 튜벌레는 일반적으로 14~26나노미터 사이의 직경을 소유합니다. 정제된 SNX-BAR은 리포솜의 화물 포획 단지로 재구성하여 전체 어셈블리가 멤브레인 리모델링에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해할 수 있습니다. 정제된 SNX-BAR 디머의 다른 조합의 결합을 다른 지질으로 구성된 합성 지질에 비교할 때, SNX-BAR 단백질은 뚜렷한 지질 결합 선호도를 가지고 있는 것으로 나타났습니다.
클로로폼을 취급할 때항상 후드에서 작업하고 날카로운 또는 유리 재료를 취급할 때 적절한 PPE를 착용하십시오.
