환자 유래 종양 샘플에 대한 개선된 배양 방법은 기존 세포주의 사용에서 멀리 떨어진 분야로 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 생체암 모델과 달리 높은 처리량 및 높은 함량 스크리닝에 적합한 플랫폼에서 환자 유래 종양 세포의 체외 배양을 허용한다. PDX를 통합하는 플랫폼을 통해 토착 종양을 반영하는 더 많은 이질적인 시스템을 평가할 수 있습니다.
이것은 약 기계장치에 통찰력을 산출하고 더 빠른 약 검열을 허용할 수 있습니다. 이 방법은 스트로마, 내피, 면역 세포의 편입을 통해 확장될 수 있었다. 이 공동 배양은 토착 종양 인구와 건축의 더 반사될 수 있었습니다.
PDX와 같은 더 귀중한 세포로 이동하기 전에 매우 능숙하게 확장 된 세포주미세 유체 플레이트를로드하는 연습을합니다. 시작하려면 종양 조직을 미리 계량된 멸균 50밀리리터 원판 튜브로 이송합니다.
혈액과 오염 물질을 제거하기 위해 멸균 PBS의 30 밀리리터로 6 번 헹구는. 가능한 한 많은 액체를 제거하고 종양 조직을 무게. 종양 조직을 60mm 원형 조직 배양 접시로 옮기고 멸균 면도날이나 메스를 사용하여 1밀리미터 조각으로 다진다.
종양 슬러리를 수집하기 위해 PDX 처리 매체의 5 밀리리터를 추가합니다. 종양 슬러리를 수집하기 위해 해리 효소 용액 5 밀리리터를 추가합니다. 해리 효소 용액의 또 다른 5 밀리리터와 문화 접시를 헹구는.
그런 다음 PDX 처리 매체의 5 밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 20분 동안 부드러운 흔들림으로 배양하세요. 잠복기 의 중간쯤에 튜브를 부드럽게 소용돌이시다.
인큐베이션 후, 파이펫을 세로지 피펫으로 부드럽게 위아래로 위아래로 하여 덩어리를 분해합니다. 새로운 멸균 50 밀리리터 튜브 위에 70 미크론 세포 여과기를 놓고 세포를 필터링합니다. 그런 다음 1, 200 rpm에서 세포를 펠릿하는 2 분 동안 원심 분리기.
PDX 배양 배지의 2~3밀리리터에서 상체를 제거하고 재중단한다. 혈전계 또는 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다. 이 테이블을 사용하여 칩당 원하는 세포 밀도를 달성하는 데 필요한 관련 PDX 파생 셀의 필요한 수를 추정한다.
6웰 조직 배양판의 웰당 PDX 배양 배지의 5밀리리터에서 6개의 세포에 1-2회 10회 플레이트. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%로 48시간 동안 배양하여 50~55rpm에 부드러운 흔들림을 가하여 클러스터 형성을 촉진합니다. 클러스터가 형성된 후 원심분리로 진행합니다.
먼저 멸균 50밀리리터 원악 튜브에 멸균 10X HBSS 2밀리리터와 밀도 그라데이션 원심분리 용액 18밀리리터를 철저히 혼합하여 100% 밀도 그라데이션 솔루션 20밀리리터를 준비합니다. 멸균 1X HBSS로 이 100% 용액을 희석하여 각각 20%30%와 55%밀도 그라데이션 솔루션10밀리리터를 만듭니다. 15밀리리터 원내 튜브 의 바닥에 55%의 밀도 그라데이션 솔루션 3밀리리터를 추가합니다.
튜브를 비스듬히 잡고 40% 밀도 그라데이션 용액의 3밀리리터를 튜브의 각진 측면과 55% 층 위에 천천히 분배합니다. 30% 밀도 그라데이션 솔루션으로 반복합니다. 그런 다음 5 밀리리터 세로지컬 파이펫으로 PDX 회전 배양의 상체를 튜브에 모아 플레이트 표면을 부드럽게 헹구십시오.
1, 200 rpm에서 펠릿 세포에 2 분 동안 원심 분리기. 상체를 제거하고 20% 밀도 그라데이션 용액의 3밀리리터에서 셀 펠릿을 다시 분리합니다. 15 밀리리터 튜브의 그라데이션 상단에 셀이 있는 20% 밀도 그라데이션 솔루션을 신중하게 레이어링합니다.
튜브와 원심분리기를 4°C, 2, 000회 G, 제로 브레이크에서 30분 동안 스윙 버킷 로터 원심분리기로 캡을 씌우십시오. 원심 분리 후 분획이 표시됩니다. 실행 가능한 PDX 세포 배양은 전형적으로 40 ~ 55% 밀도 그라데이션 솔루션 인터페이스에서 발견된다.
신선한 15 밀리리터 튜브에 각 분수의 2 ~3 밀리리터를 수집합니다. 각 분획에 멸균 1X HBSS의 3~4권을 추가하고, 완전히 섞이도록 반전한다. 원심분리기는 세포를 펠릿하는 3분 동안 1, 000배 G에서.
상부체를 제거합니다. PDX 처리 매체의 1~ 2 밀리리터에서 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 50~100마이크로리터의 작은 알리쿼시를 튜브에 전달하고, 회화를 위한 동일한 양의 해리 효소 용액을 첨가한다.
클러스터된 셀 서스펜션의 세포 수를 평가합니다. 혈전계 또는 자동화된 세포 카운터로 셀을 계산합니다. 제조업체의 지침에 따라 히알루론산 하이드로겔 솔루션을 재구성합니다.
다중 채널 파이펫을 사용하여 배양 습도 및 최적의 이미징 조건을 유지하기 위해 2차선 미세 유체 플레이트의 관측 창 기둥에 50 마이크로리터의 HBSS를 모든 우물에 추가합니다. 원하는 세포 밀도에서 50 마이크로리터의 하이드로겔에 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산합니다(예: 마이크로리터 당 5, 000 세포). 하나의 미세 유체 플레이트를 시드하기 위해, aliquot 는 4개의 멸균 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브각각에 계산된 부피를 인용합니다.
사용 직전에 정상 수산화 나트륨 1개로 HA 티올 용액의 pH를 8으로 조정합니다. HA 티올의 40 마이크로리터를 PEGdA 10 마이크로리터와 혼합하고 시간이 지남에 따라 겔화를 모니터링하여 시험 젤레이션을 수행합니다. 다음으로, 세포 현탁액 알리쿼트(200배 G)와 실온에서 2분 동안 세포 현탁액 알리쿼트에 원심분리하여 세포를 펠릿하게 한다.
상체를 조심스럽게 제거하고, 50 마이크로리터 최종 부피를 위해 HA 티올의 40 마이크로리터에서 세포를 재중단한다. HA 티올 세포의 한 알리쿼트에 PEGdA 10 마이크로리터를 추가합니다. 잘 섞고 미세 유체 플레이트를 시드하기 전에 1~3분 간 기다립니다.
1.5 마이크로리터를 단일 채널 반복 파이펫에 분배하고 HA 하이드로겔 용액의 셀과 로드하는 팁을 부착합니다. 수소 알리쿼트도 세포 분포를 보장하기 위해 잘 혼합된 상태로 유지하는 것을 기억하십시오. 미세 유체 플레이트를 시드하려면, 하이드로겔 용액의 1.5 마이크로리터를 분배할 때 접촉하지만 압력을 보장하기 위해 젤 입구중앙에 팁을 부드럽게 배치하면서 파이펫 팁을 블레이드에 수직으로 정렬합니다.
플레이트 의 상단, 플레이트 의 바닥 또는 현미경으로 볼 때 미세 유체 채널의 채우기 상태를 관찰하십시오. 이 그림을 사용하여 로드를 설명합니다. 적재 후 1분 후, 다음 알리쿼트(aliquot)를 준비하는 동안 플레이트를 반전시다.
HA 용액에서 나머지 3개의 알리쿼트에 대한 미세 유체 플레이트의 파종을 반복한다. 모든 칩이 채워진 후, 젤레이션이 완료 될 때까지 45 분 가습 인큐베이터에서 37섭씨에서 플레이트를 배양하십시오. 그 후, 제공된 매뉴얼을 사용하여, 14도 각도와 4분 간격으로 올바른 증혈 설정을 사용하여 세포 배양 인큐베이터에 관류 로커가 설치되도록 한다.
모든 매체 입구에 PDX 세포 배양 배지 50 마이크로리터를 추가합니다. 표면을 부드럽게 탭하여 액체가 미세 유체 채널을 채우도록 유도합니다. 그런 다음 접시를 뒤집어 채널이 제대로 채워져 있는지 확인합니다.
모든 미디어 콘센트에 DMEM/F-12 의 마이크로리터 50기를 추가합니다. 공포가 관류 채널에 갇혀 있는 경우 표면을 부드럽게 두드리는 것으로 제거하십시오. 현미경 및 플레이트 레이아웃 양식을 사용하여 칩 충전 성공을 기록합니다.
부적절하게 채워진 칩을 추가 실험용사용에서 제외합니다. 접시를 기울인 로커에 14도 기울기와 4분 주기로 설정하여 관류를 시작합니다. 이틀마다 PDX 배양 배지, 입구에 있는 마이크로리터 50개, 콘센트에 50마이크로리터를 교체하십시오.
이 연구에서는 표준 워터 재킷 세포 배양 인큐베이터에 프로그래밍 가능한 관류 로커를 설치하고 2차선 미세 유체 블레이드를 적재를 위한 표준 생물 안전 캐비닛에 제조되었습니다. 3D 미세 유체 PDX 배양 생존가능성 및 형태는 분리되지 않은 및 밀도 그라데이션 원심분리 조건 모두에서 평가되었다. 첫날, 분리 방법을 겪은 배양자들은 분리되지 않은 배양에 비해 10배 적은 단일 사멸세포를 나타냈다.
중요한 것은, 분리된 클러스터는 주로 살아있는 세포로 이루어져 있습니다. 클러스터 크기 분포에 대해 통계적으로 유의한 차이가 확인되지 않았습니다. 배양은 7일 동안 미세유체 판에서 더 유지되었다.
살아있는 세포의 총 수는 일관되게 남아 있었고, 클러스터는 배양의 수명 동안 약 80 %의 생존력을 유지했습니다. 각 PDX 라인은 고유하므로 종양 소화의 용이성, 클러스터의 피노티픽 크기와 형태, 그라데이션 정제 내의 클러스터 위치가 달라질 수 있음을 기억하십시오. 이 방법을 사용하여 확립된 PDX 배양은 이미지 또는 플레이트 판독기 기반 생존가능성 분석, 고정 및 면역형으로 표지되거나 다른 프로토콜에 대한 세포 용액을 수집하기 위해 해리될 수 있습니다.
이 방법은 연구원이 종양 세포의 생물학 또는 약 반응을 탐구하기 위하여 종양 미세 환경을 회수하는 것을 허용할 것입니다. 사용자는 인간 유래 조직과 함께 일하기 전에 표준 인간 과목 훈련 및 혈액 매개 병원체 훈련을 완료해야합니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.
