성체 제브라피쉬에 최적화된 정맥 주사

우리의 연구는 제브라피시 모델을 활용하여 인간의 혈액 질환을 연구하며, 백혈병과 같은 질환에 대한 새로운 바이오마커, 치료 표적 및 치료법을 식별하는 데 중점을 둡니다. 제브라피시의 고유한 장점을 활용하여 혈액 질환의 기저에 있는 분자 메커니즘을 탐구하고 환자 결과를 개선하기 위한 혁신적인 치료 전략을 개발하는 것을 목표로 합니다. 성체 제브라피쉬에 대한 정맥 주사는 크기가 작고 혈관 구조가 복잡하기 때문에 어렵습니다.

당사는 물질 또는 세포를 성체 제브라피시로 정확하고 효율적으로 전달하기 위해 최적화된 IV 주입 방법을 개발했습니다. 심장 내 및 후안와 주사와 비교했을 때, 여기에서 제시한 IV 방법은 더 나은 물고기 생존과 더 나은 세포 생착을 가져왔습니다. 이 방법은 성체 제브라피시를 비학기 연구에 더 유용하게 사용할 수 있도록 합니다.

새로운 모델의 한계를 극복한 개선된 IV 기술은 질병 모델 및 약물 스크리닝의 정확도를 높여 새로운 치료법을 발전시키는 데 도움이 됩니다. 먼저 안락사된 mpo:EGFP 형질전환 제브라 피쉬를 해부 테이블에 놓습니다. 제브라 피쉬를 해부하여 신장 골수를 분리합니다.

그런 다음 신장 골수를 세포 현탁액이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 신장 골수 세포를 분리하기 위해 현탁액을 피펫팅합니다. 40마이크로미터 나일론 셀 스트레이너를 통해 셀 현탁액을 여과합니다.

그런 다음 500G에서 8분 동안 세포를 원심분리하고 상등액을 버리고 펠릿을 500마이크로리터의 세포 현탁액에 다시 현탁시킵니다. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 10마이크로리터 분취량으로 세포를 계수합니다. 해밀턴 주사기를 75% 에탄올로 3-4회 철저히 세척하십시오.

그런 다음 주사기를 초순수로 3-4회 헹구어 모든 에탄올 잔여물이 제거되었는지 확인합니다. 제브라피쉬에게 마취제를 투여한 후, 움직임 감소와 반사 반응 상실을 통해 마취의 깊이를 확인합니다. 물고기의 등쪽이 위로 향하게 하고 머리가 왼쪽을 향하도록 깨끗하고 축축한 티슈 페이퍼에 배치하여 주입을 위해 안정화합니다.

해밀턴 주사기를 단단히 잡고 바늘을 꼬리 정맥에 대해 약 45도 각도로 기울입니다. 캐스퍼 제브라피쉬의 경우 반투명 몸체를 통해 선박의 보이는 부분을 조준합니다. 바늘을 혈관에 부드럽게 삽입하고 mpo:EGFP 형질전환 제브라피시에서 분리한 2마이크로리터의 전체 신장 골수 세포를 투여합니다.

주입 후 면봉으로 주입 부위에 10초 동안 부드럽게 눌러 출혈을 억제합니다. 주입된 제브라피시를 현미경으로 관찰하여 용기 내의 GFP 신호를 확인합니다. 주입된 제브라피시가 갓 살균된 생선 물에서 10분 동안 회복되도록 합니다.

그런 다음 물고기를 정적 수조로 옮깁니다. 정맥 주사 방법은 43마리의 물고기 중 41마리에서 GFP 신호가 보이며 가장 높은 성공률을 보였습니다. retro-orbital 방법은 37마리의 물고기 중 3마리에서만 GFP가 검출된 반면 심장 내 방법은 40마리 중 11마리에서 성공을 보였습니다.

정맥 주사 방법은 특히 역안와 및 심장 주사 방법에 비해 더 높은 세포 용량으로 주입된 물고기의 생존율이 더 높았습니다. GFP 신호는 정맥 주사된 물고기에서 이식 후 3일째 되는 날에 감지되었으며, 후안와 및 심장 내 방법은 지연된 GFP 신호 시작을 보여주었습니다. 17일째까지, 정맥 주사된 물고기는 신장 골수에서 가장 두드러진 GFP 신호를 나타냈습니다.

신장 골수의 유세포 분석은 정맥 주사된 물고기에서 약 18%GFP 양성 세포를 보여주었으며, 5개의 세포의 힘에 3배의 10을 표시하여 기증자 신장 골수의 GFP 수치와 일치했습니다. 대조적으로, 심장 내 및 후안와 방법은 각각 5%와 2%GFP 양성 세포를 보여주었습니다.