이러한 방법은 신경 모세포종 전이의 첫번째 제브라피시 모형을 개발하기 위하여 이용되었습니다. 그리고이 모델은 신경 모세포종의 고위험 환자에서 본 전이의 많은 특징을 충실하게 재구성 할 수 있음을 입증합니다. 이 전이성 얼룩말 피시 모델의 주요 장점은 종양 보급의 생체 내 이미징에서 언제, 그리고 아마도 전이가 발생하는지 더 잘 이해하는 것입니다.
이 기술은 신경 모세포종에 만국되지 않습니다. 그것은 종양 세포가 가능성의 배열로 이끌어 내는 확인되고 추적될 수 있는 한 암의 다양한 모형의 제브라피시 모형에 적용될 수 있습니다. 시작하려면 MYCN과 LMO1 형질 대사를 교배하여 MYCN과 LMO1을 과도하게 표현하는 이종화구균 형질형 어류 라인을 개발하십시오.
언젠가 포스트 수정에서, EGFP 양성 점으로 제시 EGFP 발현에 대한 아웃 크로스의 자성을 정렬하는 입체 형광 현미경을 사용합니다. 선별 후, 선별된 배아를 별도의 페트리 요리로 분리하고 MYCN 긍정 또는 MYCN 음성으로 라벨 접시를 표시합니다. LMO1 발현을 위한 두 그룹의 배아를 3~4일 후에 비옥하게 시각화하고 분류한다.
특히 힌드뇌의 직사각형 에서 우수한 자궁 경부 신경절과 비 PSNS 도파민성 뉴런 세포 모두에서 적색 형광 반점을 찾습니다. 배아가 5일 후에 수정되기 전에 검열을 수행합니다. 그런 다음 선별된 물고기를 서로 다른 유전자형으로 분리하고 MYCN으로만 라벨을 부착하고, LMO1만, MYCN 및 LMO1은 야생 유형으로 분리합니다.
표준 프로토콜에 따라 동일한 조건에서 올립니다. 종양을 보기 위해 양쪽에 금속 주걱으로 물고기를 부드럽게 뒤집어 입체 형광 현미경으로 종양을 시각화합니다. 가능한 종양 베어링 물고기를 식별 한 후, 생년월일, 종양이 검사 된 날짜 및 유전자형을 포함하는 적절한 라벨이있는 별도의 탱크로 분리하십시오.
수정 후 6 주에서, 이전에 가려진 물고기에 대한 종양의 존재를 확인하거나 새로운 가능한 종양 베어링 물고기를 식별하기 위해 종양 베어링 물고기와 비 종양 베어링 물고기를 검사하기 위해 이전 단계를 반복합니다. 형광 양성 질량및 확인된 종양 베어링 물고기의 지속 또는 증가된 크기를 찾아보십시오. 종양 베어링 물고기를 확인한 후에, 종양 세포 이동의 증거를 위해 격주 감시, 작은 EGFP 또는 mCherry 양성 종양 질량으로 제출하는 종양 창종의 1 차적인 사이트에서 멀리.
필요에 따라 이러한 물고기를 별도의 탱크로 분리하고 가능한 전이를 나타내기 위해 적절하게 라벨을 부착합니다. LMO1 물고기에서 이종고우스 MYCN을 해석한 후, 그들의 자손을 분류하는 동안, EGFP MYCN 발현은 1일 후에 비 PSNS 도파민성 신경세포에서 두드러졌습니다. 대조적으로, LMO1 발현은 PSNS 세포와 비 PSNS 도파민성 신경 세포 둘 다에서 두드러졌습니다.
형광 양성 종양 질량은 MYCN과 LMO1 의 과발현을 가진 화합물 형질전환 물고기의 1 차 종양 부위에서 멀리 떨어진 장기의 조직에서 검출되었지만 MYCN의 발현을 혼자 가진 형질전환 물고기에서는 검출되지 않았다. 수술 섹션의 H&E 염색은 신경 모세포종 환자에서 1 차적인 질병의 일반적인 사이트인 인간 부신의 제브라피시 동등한 인터신장 부위에서 1 차적인 종양이 발생했다는 것을 보여줍니다. 신장의 탈경 부분, 궤도, 아가미, 비장 및 심심 의 심방 챔버의 내벽을 포함하여 여러 지역에서 종양 질량이 발견되었습니다.
1차 종양 및 모든 전이성 부위에서 종양 세포의 PSNS 신경폭발 계보가 확인되었다. MYCN을 단독으로 발현하는 종양과 비교했을 때 MYCN LMO1 종양에서 PSR 염색 콜라겐 섬유의 현저히 증폭된 양과 두께증가가 발견되었다. 이 절차를 사용한 후, 신약 검진 및 새로운 암 치료법을 테스트하면 잠재적으로 전이성 암을 예방하고 치료할 대체 제제의 개발로 이어질 수 있습니다.
