우리는이 비디오에 제시된 전체 hippocampal 조각의 낮은 배율 이미지를 인수와 관련하여 도움이 마크 Lucanic 및 Hwai - 김정일 쳉 감사드립니다. 우리는 또한 영상과 함께 텍스트로 은닉 죄로 사라 패리 감사하고 싶습니다.

BIOLISTIC TRANSFECTION에 대한 PROTOCOL 총알 만들기 총알은 최대 6 개월 좋다지만, 2~3개월 후 transfection 효율 감소로 시작할 수 있습니다. 글머리 기호는 dessicant 알약의 존재 4 ° C에 저장해야합니다. 항상 병을 열기 전에 실내 온도에 따뜻한 총알이 저장되는 섬광의 튜브를, 보자. 시작하기 전에 준비했습니다 : <ul><li> Spermidine (0.05M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100 % - 고급 - 개봉 병) </li><li> Autoclaved H 2 0 </li><li> transfected 수 DN​​A </li><li> Polyvinylpyrrolidone (PVP - 20 MG / ML 주식) </li><li> 2 X 15 ML 원뿔 (2/bullet 세트) </li><li> 튜브 (X ~ 30인치 / 총알 세트 1로 절단) </li><li> 섬광 튜브 (1/bullet 세트) </li><li> 탈수 알약 </li><li> 10 ML 주사기 W / 끝에 튜브 </li></ul> 튜빙을 준비 : <ol><li> 드라이 ~ 튜브 역 W / N 2 가스 (0.4 압력) 20 분 최소의 튜브 30 인치 (약 2 인치 오른쪽 O - 링 넘어 연장). </li></ol> 골드 비즈 DNA를 Precipitating : <ol><li> microcentrifuge 관 50 μmL 전체 볼륨 (최대 50 μg 총 DNA)에 transfected 수 DN​​A 준비 </li><li> 골드 6-8 MG를 무게와 microcentrifuge 관으로 전송 </li><li> 금을 0.05M spermidine 100 μL를 추가하고 20 초에 대한 sonicate </li><li> 골드 / spermidine하는 DNA의 50 μL를 추가 </li><li> 와동 (설정 5 정도) W / 캡 오픈 </li><li> 1M CaCl 2의 현명한 100 μL를 드롭 추가 </li><li> Sonicate의 잠시 (&lt;5 초) </li><li> 온도는 실온에서 10 분 석출물 수 있도록 허용 </li><li> 간략 Sonicate </li></ol> sonication 동안 PVP 솔루션을 준비 : <ol><li> (3.5 ML 백퍼센트 EtOH로 20mg/ml PVP 주식의 7.5 μL 추가) 총알의 각 집합 15 ML 원뿔, 3.5mL 희석 PVP에서 PVP 솔루션을 희석 확인 </li></ol> EtOH와 골드 비즈를 Rinsing : <ol><li> microcentrifuge 10 초 최고 속도 골드 비즈를 스핀 다운 </li><li> 뜨는 폐기하지만, 황금 구슬 위에 액체의 소량을 유지 </li><li> 필요한 경우 1ml EtOH로 배 세척, 잠시 때마다 sonicate </li></ol> PVP 솔루션에 Resuspend 골드 / DNA : <ol><li> 3.5 ML 희석 PVP / EtOH 솔루션 200 μL의 황금 펠릿을 Resuspend </li><li> 소용돌이 resuspend에 금을 펠릿 (필요한 경우 간단히 sonicate) </li><li> 새로운 15 ML 원뿔에 금색 / PVP 솔루션의 200 μL를 전송 </li><li> 모든 금괴가 15 ML 원뿔로 전송되었습니다 때까지 한 번에 PVP 200 μL를 추가, 이런 방식으로 계속하고, 최종 볼륨 3.2 ML입니다 </li></ol> 코팅 튜브 : <ol><li> 튜브 역에서 N 2를 끄고 말린 튜브를 제거 </li><li> 10 ML의 주사기에 건조 튜빙을 첨부 </li><li> 목숨 걸고 15 ML 원뿔은 골드 / PVP 가득 흔들 </li><li> 골드 / PVP 솔루션에 튜브의 끝 부분을 넣고 거품을 피하기 위해 천천히되는주의 빨아 </li><li> 튜빙의 양쪽에서 ~ 2인치 건조 남겨주세요 </li><li> 관 여전히 주사기에 부착된과 골드 / PVP 솔루션으로 가득으로 신중하게 튜브를 다시 역에 배치 </li><li> 솔루션 앉아 튜브의 끝을 표시 </li><li> 골드는 주사기가 부착된 5 분 해결하자 </li><li> 해결 골드가 (다시 - 세척해야 않게) 남겨진 있도록 주사기를 당겨 매우 천천히 솔루션을 빨아 </li><li> 주사기를 분리 </li><li> 90 ° 회전 2 초 앉아 보자 </li><li> 180 ° 회전하여 다른 이초 앉아 보자 </li><li> 5 초위한 튜브를 회전 </li><li> 밸브가 0.4 사이 읽는 있도록 N 2 켜고 - 0.5 및 5 분 동안 건조 골드 코팅 튜빙을 스핀. </li></ol> 튜빙을 절단 : <ol><li> 튜브의 준비 - 역에서 튜브를 제거하고 상처에서 끝을 잘라. </li><li> 컷 카트리지를 잡고 튜브 헬기가 아래 표시 섬광의 병을 넣어 </li><li> 플레이스 튜브 헬기에 튜브 깨끗한 면도날로 튜브를 잘라 </li><li> 섬광의 약병에 탈수의 알약을 플레이스 </li><li> 4 스토어 카트리지 ° C </li></ol> 조직 조각 슈팅 교양 조각 촬영 때, 그것은 오염을 방지하기 위해 상대적으로 살균 기술을 채택하는 것이 중요합니다. 두 개의 서로 다른 구조를 촬영하면, 총알이 모두 세트가 동일한 카트리지 홀더에 로드할 수 있지만, 배럴 - 라이너와 화면 구성 사이에서 변경되어야한다고, 기억하십시오. 시작하기 전에 준비했습니다 : <ul><li> DNA 총알 (열기 전에 상온에 섬광 약병을 따뜻한하자) </li><li> 조직 조각 </li><li> 진 건 헬리 우스 </li><li> 유전자 총 호스와 헬륨 탱크 첨부 &lt;/ 리&gt; <li> 카트리지 홀더 </li><li> 대신에 플라스틱과 바렐 라이너는 O - 링 </li><li> 디퓨저 (수정) </li><li> 디퓨저 화면 </li><li> 집게 </li></ul> 유전자 총을 준비 : <ol><li> 사용 포셉는 카트리지 홀더에 금이 코팅된 플라스틱 카트리지를 놓습니다. </li><li> 첫째 돌려 잠금을 추진하여 유전자 총에 카트리지 홀더 플레이스 </li><li> 자물쇠 카트리지 홀더를 고정 </li><li> O - 링과 장소에 안전하게 디퓨저 화면 배럴의 라이너를 구합니다 </li><li> 유전자 총에 배럴 - 라이너를 스크류 </li></ol> 유전자 총을 교양 조각 슈팅 : <ol><li> 귀 muffs 입어 </li><li> 호스 연결 헬륨 가스 탱크에 유전자 총을 플러그 </li><li> 180 PSI에 탱크에 압력을 턴 </li><li> 디퓨저 화면에서 어떤 먼지 또는 파편을 제거하기 위해 공중에 빈 쏴. 총을 쏴하려면 먼저 방아쇠를 당긴다 후, 총 삡까지 안전 잠금 버튼을 우울. </li><li> 빈 촬영 후 인큐베이터에서 조각을 제거할 </li><li> 첫번째 구축 사전 총 </li><li> 0.5 디퓨저 화면 쏴 - 슬라이스에서 1 인치 </li><li> 우물 사이의 카트리지를 사전. </li><li> 마지막으로 잘 촬영 후 인큐베이터에 다시 조각 장소 </li><li> 헬륨 호스에서 총을 분리하기 전에 가스 릴리스 압력을 해제합니다 </li><li> 돌려서 배럴 라이너, 그리고 카트리지를 제거하고 사용 조개 </li></ol> 카트리지 홀더 및 배럴 라이너 청소 : <ol><li> 장소 카트리지, 배럴 라이너, 그리고 비눗물로 비커에 확산 화면 </li><li> 20 분 목욕 sonicator 및 sonicate에 플레이스 비커 </li><li> 모든 비누 잔류물이 제거되기 전까지는 철저히 물을 린스 </li><li> 시간 동안 70 % EtOH에서 소크 </li><li> 건조 건조 종이 타월에 소는 하룻밤 </li><li> 청소 카트리지, 배럴 라이너, 그리고 화면은 다음 후속 biolistic transfections에 활용할 수 있습니다 </li></ol> Biolistic Transfection에 대한 문제 해결 팁 Biolistic transfection 때로는 suboptimal transfection 조건이 발생할 수 있습니다. 너무 적거나 너무 많은 세포가 transfected, 너무 높거나 너무 낮은 표현 수준을 초래할 수도 있고, 일반적으로 건강에 해로운가 될 조직 조각을 일으킬 수 있습니다. 압력 폭발에서 종종 건강에 해로운 슬라이스 결과. 최적 transfected 조직 조각을 얻기 위해 몇 가지 도움말입니다. : 슬라이스 (또는 너무 많은 세포 / 슬라이스를 transfected 경우), 시도 건강에 해로운 것으로 나타날 경우 <ul><li> 증가 촬영 거리 </li><li> 가스 탱크에 압력 감소 </li><li> 골드의 크기를 감소 </li><li> 바이오 방사선 디퓨저의 중심을 절단하고 디퓨저 화면 중앙을 대체합니다. </li></ul> 너무 몇 가지 세포가 transfected있다면, 시도 : <ul><li> 촬영 거리를 감소 </li><li> 가스 탱크에 대한 압력 증가 </li><li> 골드의 양을 증가 </li><li> / 잘 조직 조각의 수를 증가 </li><li> 총신 - 라이너에 O - 링이 그대로 있는지 확인하십시오. </li></ul> 같은 촬영 있는지 확인하는 동안 transfected 모두 너무 많은 너무 몇 가지 세포와 조각을 얻을 경우 : <ul><li> 당신은 대칭 위에 잘 총을 들고있다 </li><li> 금괴는 균일 튜브의 내부 코팅입니다. (당신은 황금 라인을 받고있다면, 골드가 가라앉을 때 한 번 빠른 속도로 튜브에서 뜨는을 그릴 및 질소를 켜기 전에 금을 더 이상 회전. 반면에, 당신이 금을 줄이을 받고있는 경우, , 이것은 가능성이 총알 제작 중에 너무 많은 수분 노출로 인해됩니다 튜브가 코팅하기 전에 완전히 건조하고 피부를 상한 이상) 적시에 총알을 준비한다는 사실을 당신은 EtOH의 개봉 병을 사용하고 있는지 확인하십시오. </li></ul> transfection 효율이 최적이 보이는 경우 (# 전지 / 슬라이스를 transfected)하지만, 표현 수준이 너무 높거나 너무 낮은 것 같다 : <ul><li> 골드에 대한 비율 DNA를 조정합니다. (너무 낮은 경우 예를 들어, 황금의 크기를 유지하지만, DNA의 양을 증가시킵니다.) </li><li> 촬영 및 데이터 수집 간의 시간을 조정 </li></ul> 이중 transfection의 경우에는, 귀하의 구성 중 하나가 너무 작은 표현을 받고있다면, 확인을 줄 수있는만큼, 적절한 방식으로 두 구성의 비율을 조정하고 모두 구조가 동일한 모터 아래에 있는지 확인 이거요 발기인은 다른 밖에서 경쟁하지 않습니다.

<ol>
	<li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles.">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li><li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun.">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neurons.">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Biolistic transfection은 고속 DNA 코팅 골드 입자 살아있는 조직의 폭격을 통해 세포를 transfecting의 물리적인 수단입니다. 총알이 핵의 나머지에 관해서는 입자 매개 유전자 전달에는 일반적으로 transfected 세포의 결과. 여러 transfection 방법이 존재하지만, 같은 microinjection, lipofection, 칼슘 인산염 transfection, electroporation 및 바이러스성 transfection으로 biolistic transfection은 쉽게 이러한 다른 방법을 사용하여 transfected되지 않은 세포를 transfecting위한 집중 적은 노동,하고 효율적인 대안을 제공할 수 있습니다. 세포 벽의 존재는 전부터 방법 1을 사용 transfection이 어려운 만든 이후 사실, 처음 식물의 유전자 전달을위한 기술로 개발되었습니다. 포스트 mitotic의 뉴런은 2,3를 transfect하는 악명 어려운되므로 마찬가지로, biolistics는 신경 생물학 분야에서 인기를 얻고있다. 특히, 그것은 널리 그대로 뇌 조각의 단일 뉴런의 벌금 형태를 평가하기위한 실험에 사용할 수있는 주요 기술로 인식되고 있습니다. 방법은 유전자 총을 개최 손 (; 바이오 래드 편 진 건 시스템)을 사용하여 양식 뇌 조각의 biolistic transfection을 수행하는 방법에 대한 상세하고 포괄적인 설명을 제공합니다 여기에서 설명한. 그것은 뇌 슬라이스에 걸쳐 세포의 스파스 번호 transfection을 허용하기 때문에 Biolistic transfection은 슬라이스 문화에 신경을 transfecting에 대한 기본 방법이되었다. 이러한 방법으로 각각의 뉴런은 격리 검사하실 수 있습니다. 이 기법은 특히 뇌 슬라이스의 뉴런을 transfecting 적합되기 때문에, 그것은 종종 광 산란 조직 네 안에 깊은 찬란 분류 세포의 2 광자 여기있게 시각화 이후, 2 광자 현미경과 함께 사용됩니다. 사실이 동영상을 통해 제공 하나 피라미드 뉴런의 높은 배율 이미지는 사용자 지정 기본 2 - 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 점령했다. 결론 biolistic transfection 주변 세포가 높은 밀도의 컨텍스트 내에서 개별 세포를 transfecting의 효율적인 수단이며, 같은 찬란의 연결을 슬라이스 문화에서 개별 뉴런을 라벨에 대한 매우 유용한 입증되었습니다.

우리가 별도로 모든 제품을 나열했습니다하지만, 바이오 - 래드 (CAT # 165-2431) 위에 나열된 모든 제품에 포함되어 &quot;유전자 건 시스템 편&quot;구입에 더 경제적입니다.

preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture

Biolistic transfection은 고속 DNA 코팅 입자와 조직을 bombarding하여 세포를 transfecting의 물리적인 수단입니다. 우리는 DNA 코팅 총알의 초기 준비에서 유전자 총을 사용하여 organotypic 슬라이스 문화의 마지막 촬영에, 쥐 hippocampal 조각의 biolistic transfection에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 유전자 총 transfection은 뉴런을 transfecting의 효율적이고 쉬운 방법이며 찬란 조직 통에 세포의 작은 하위 집합을 라벨에 특히 유용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 먼저 DNA와 코팅 골드 입자하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 우리는 옆에있는 골드 / DNA 총알과 플라스틱 튜브의 내부를 선하는 방법을 보여줍니다 및 유전자 총에 로딩을위한 플라스틱 카트리지를 얻으려면이 튜브를 잘라하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 생명 래드 취급을 보여주는 것은 유전자 총을 편, 그리고 건강하고 최적의 transfected 조직 조각을 얻기 위해 문제 해결에 대한 조언을 제공, 쥐 hippocampal 슬라이스 문화 biolistic transfection을 수행합니다.

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Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

우리는 DNA 코팅 황금 총알을 준비하는 방법을 설명하고 biolistically 교양 hippocampal 조각의 뉴런을 transfect 그러한 총알의 사용을 보여줍니다.

진 건 글머리 기호 및 슬라이스 문화 뉴런의 Biolistic Transfection의 준비

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Biology

52.2K 조회수.  University of California, Davis. 우리는 DNA 코팅 황금 총알을 준비하는 방법을 설명하고 biolistically 교양 hippocampal 조각의 뉴런을 transfect 그러한 총알의 사용을 보여줍니다.

비디오: Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

망막의 수평 슬라이스 준비

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

연구

생물학

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Hippocampal 뉴런의 유전자 총을 Transfection

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18 랫 두뇌의 Organotypic 슬라이스 문화

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Compartmented 문화의 도설 루트 신경의 뉴런의 준비 및 유지 관리

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.