우리의 연구 프로그램은 다양한 형태의 세포 사멸이 어떻게 조절되는지 이해하는 데 중점을 두고 있습니다. 우리는 일반적으로 암 치료의 맥락에서 세포 사멸을 연구하며, 약물이 세포 사멸을 유발하는 기능과 이러한 반응을 더 좋고 더 구체적으로 만드는 방법을 배우는 것을 목표로 합니다. 조절되는 세포 사멸에는 다양한 유형이 있다는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다.
이 분야는 현재 기계론적으로 구별되는 최소 14가지 유형의 죽음을 확인했다. 이들 중 대부분은 형태학적으로 괴사하는 죽음을 일으키며, 일반적으로 이러한 경로가 어떻게 작용하는지에 대해 아는 바가 거의 없습니다. 세포 사멸 조절을 연구하는 효과적인 방법은 기능적 유전체학(functional genomics)을 사용하는 것입니다.
즉, 각 유전자를 체계적으로 교란시키고 이러한 교란이 세포 사멸에 어떤 영향을 미치는지 결정하는 것입니다. 약물의 맥락에서 수행되는 경우 이를 화학유전학적 프로파일링이라고 합니다. 화학유전학 스크리닝은 일반적으로 유전자 녹아웃이 최종 집단 크기에 어떤 영향을 미치는지 평가합니다.
그러나 개체군 크기는 성장률, 사망률 또는 둘 다의 변화에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 현재의 스크리닝 방법은 성장률 변동의 제한 효과로 인해 사멸 조절 유전자를 식별하지 못합니다. 메두사는 약물 반응 시뮬레이션을 사용하여 성장률 또는 사망률의 변화가 최종 개체군 크기에 어떤 영향을 미치는지 모델링합니다.
이러한 시뮬레이션을 통해 스크리닝의 각 유전자에 대한 약물 유도 사망률을 추출하고 다른 교란 요인을 제거할 수 있습니다.우선, 웰당 1500에서 5, 000 세포 사이의 파종 밀도에서 검은색의 투명한 바닥 96 웰 플레이트의 플레이트 세포. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소와 습도로 16-24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 이전에 최적화된 사이토톡스 농도를 포함하는 배지에서 약물 희석을 준비합니다.
최적화된 농도로 Triton X를 사용하여 한 플레이트를 라이스하십시오. 그런 다음 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 최적화된 설정을 사용하여 T0에서 실험 플레이트의 사이토톡스 형광을 측정한 다음 나중에 적절한 시점에 측정합니다. 최종 시점 이후, Triton X를 사용하여 실험 플레이트를 라이스하여 각 조건의 최종 개체군 크기를 결정합니다.
종말점 데이터를 사용하여 분획 생존율을 계산하고 결과를 투여 반응 곡선에 피팅합니다. 용량 반응 곡선을 평가하여 약 50%의 세포 사멸을 유도하는 약물 용량을 식별합니다. 세포 사멸을 유도하기 위해 약물 투여량을 최적화한 후 비표적 SG RNA를 비표적 유전자에 무작위로 할당합니다.
선택한 cutoff 전략에 따라 낮은 수의 SG RNA를 trim합니다. NPG 값의 범위를 평가하기 위해 for 루프를 사용하여 순 인구 증가율 또는 NPG에 대한 가능한 모든 섭동을 시뮬레이션합니다. 각 실험용 단일 SG RNA에 대해 관찰된 데이터에 가장 가까운 시뮬레이션된 접힘 변화를 일치시키고 해당 상대 성장률을 SG RNA에 할당합니다.
그런 다음 살아있는 세포 계수 데이터에서 사멸 전 약물 유도 성장률을 결정합니다. 데이터를 간단한 지수 방정식에 맞추어 성장률을 도출합니다. 살아있는 세포 계수 데이터와 약물 등급 값을 결합하여 사망 발병 후 약물 유도 성장률을 계산합니다.
등급 플롯에서 선택한 약물 용량에 대한 등급을 플롯합니다. 약물로 인한 성장과 사망률 간의 실험적으로 결정된 조정을 사용하여 시간 경과에 따른 약물 유발 인구 규모를 시뮬레이션하는 모델을 만듭니다. 그런 다음 NPG, 사망 발병 전후의 약물 유도 성장률(시간당 두 배로 증가) 및 약물 유발 사망률을 포함하는 메두사 모델을 개발합니다.
시작 시점을 0시간으로 설정하고 치료되지 않은 상태와 치료되지 않은 상태 모두에 대한 최종 시점을 정의합니다. 기준선 모델에 대한 성장 및 사망률에 대한 가능한 모든 섭동을 시뮬레이션합니다. 각 조합에 대해 분석 종말점에서 관찰된 폴드 변화의 2밑이 되는 로그를 계산합니다.
각 SG RNA에 대해 관찰된 폴드 변화를 일으킬 약물 유발 사망률을 삼각 측량합니다. 미리 결정된 상대 성장률을 추출하는 것으로 시작합니다. 사망 발병 전후의 약물 유도 성장 속도를 결정합니다.
NPG의 상대 성장률을 적용하여 사망 발병 전후의 약물 유도 성장률에 대한 비례 성장률을 계산합니다. NPG, 사멸 발병 전후의 약물 유도 성장률에 대한 제약 조건을 사용하여 각 SG RNA에 대해 관찰된 접힘 변화에 가장 가까운 시뮬레이션된 접힘 변화를 식별합니다. 라이브러리에 있는 각 유전자에 대한 유전자 수준 성장 및 사멸률을 결정합니다.
일반적으로 4개에서 10개의 SG RNA에 이르는 각 유전자와 관련된 모든 SG RNA의 평균 성장 및 사멸률을 계산합니다. 경험적 P 값을 계산하려면 SG RNA 수준 데이터를 부트스트랩하고 Benjamin Hochberg 절차를 사용하여 거짓 발견 비율 보정을 적용합니다. U2 OS 세포의 분획 생존력은 96시간 후 5마이크로몰 에토포사이드에서 관찰된 약 50%의 치사율과 함께 용량 의존적 방식으로 감소했습니다.
회복된 개체군 크기는 5마이크로몰 에토포시드에 노출된 지 4일 후 40%에서 50%까지 감소하여 약물 치료 중 세포 사멸을 확인했습니다. 등급 분석은 5마이크로몰 에토포사이드가 완전한 성장 정지 후에만 세포 사멸이 시작되어 성장률을 현저히 감소시키는 것으로 예상했습니다. 메두사 분석에 따르면 XRCC 5개의 녹아웃 세포는 치료되지 않은 조건에서 느린 성장과 에토포시드 치료 하에서 높은 약물 유발 사망률을 보였습니다.
검증 실험을 통해 XRCC 5 녹아웃 세포는 처리되지 않은 조건에서 느린 성장을 보이고 에토포시드에서 사망률이 높았으며, 이는 메두사 예측과 일치했습니다.
