이 방법은 잠재적인 치료 내정간섭을 개발하기 위하여 putative 표적 유전자 및 병원성 기계장치의 확인과 같은 종양학의 필드에 있는 중요한 정보를 제공하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 NFAT2 및 알려진 및 참신한 표적 유전자와의 다른 전사 인자의 상호 작용을 감지할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 최적의 고정 및 전단 조건이 확립되기 어렵기 때문에 어려움을 겪게 됩니다.
1.5 밀리리터 튜브를 37%의 포름알데히드1밀리리터로 채우기 시작합니다. 그런 다음 또 다른 1.5 밀리리터 튜브를 PBS 의 4 밀리리터가있는 5 밀리리터 튜브에 1.25 어어 글리신1밀리리터로 채웁니다. 다음으로, 세포의 자극 후 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 회전시키고, PBS의 500 마이크로리터에서 세포를 다시 중단하고 튜브를 얼음으로 채워진 상자에 놓는다.
세포에 37%의 포름알데히드의 13.5 마이크로리터를 넣고 위아래로 배관하여 섞는다. 그런 다음 실온에서 서스펜션을 배양합니다. 그 후, 고정을 중지 1.25 어어 글리신의 57 마이크로 리터를 추가합니다.
그리고 서스펜션이 실온에서 5 분 동안 배양 할 수 있도록하십시오. 잠복기 직후 세포를 얼음에 놓고 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G로 원심분리합니다. 그런 다음 슈퍼 네티퍼를 흡인합니다.
다음으로, 4섭씨에서 5분간 200회 G에서 얼음-차가운 PBS 1밀리리터로 셀을 두 번 씻고 상수체를 제거합니다. 셀 펠릿을 리시스 버퍼 5개에서 위아래로 피펫팅하여 다시 중단합니다. 그런 다음 샘플을 얼음에 넣고 10 분 동안 흔들어 서 배양하십시오.
그 후, 4섭씨에서 5분간 500회 G로 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 제거합니다. 분해 버퍼 2의 5 밀리리터에서 세포를 균질화하고 파이펫을 위아래로 혼합합니다.
그런 다음 흔들림으로 10 분 동안 얼음에 세포를 배양합니다. 인큐베이션 기간 후 튜브를 섭씨 4도에서 5분간 500회 G로 원심분리하고 상퍼를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 1X 프로테아제 억제제로 전단 버퍼 1에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.
그런 다음 10 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 배양합니다. 세포 현탁액의 140 마이크로리터를 기포 형성을 피하기 위해 주의를 기울이는 초음파 튜브로 옮기. 튜브를 7°C의 초점 초음파처리에 놓고 10~7분, 1/2분간 전단을 합니다.
세포 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기. 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 15, 700회 G로 원심분리하고 새로운 튜브에서 상퍼를 수집합니다. 먼저, 1.5밀리리터 튜브 1개당 각 강수량에 대해 20마이크로리터의 단백질 A 코팅 구슬을 준비한다.
구슬이 자기 랙에 1분 동안 정착하고 상체를 제거하도록 허용합니다. 그런 다음 비드를 1X 칩 버퍼 40마이크로리터로 씻어 내고, 단백질 A-코팅 구슬 20개당 위아래로 피펫팅하여 비드를 세척합니다. 구슬이 자기 랙에 1분 동안 정착하여 상퍼를 제거하도록 허용합니다.
이 세척 과정을 세 번 더 반복한 후 원래 1X chIP 버퍼 1의 구슬을 다시 일시 중단합니다. BSA 프로테아제 억제제, 5X chIP 버퍼 및 ChIP-seq 등급의 물을 구슬에 추가합니다. 다음으로, 시어드 크로마틴을 추가합니다.
NFAT2 항체 10 마이크로그램을 사용하여 NFAT2를 포획하고, 2.5 마이크로그램의 IgG 항체를 대조군으로 포획한다. 6RPM에서 회전하는 바퀴에 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 혼합물을 배양합니다. 다음날 7, 000회 G에서 5초 동안 튜브를 회전시키고 자기 랙에 1분 동안 배양합니다.
그런 다음 슈퍼나탄을 흡인하고 1회, 2, 3, 4회 연속 으로 세척 버퍼로 구슬을 세척합니다. 7000회 G에서 튜브를 5초 간 회전한 후 자기 랙의 튜브를 1분 동안 배양합니다. 이 후 상체를 제거하고 다음 세척 버퍼를 추가합니다.
마지막 세척 후, 7000 회 G.Incubate 1 분 동안 자기 랙에 튜브를 배양5 초 동안 튜브를 회전. 상체를 제거하고 용출 버퍼 100 마이크로 리터에서 구슬을 차지합니다. 그런 다음 회전 휠의 튜브를 30 분 동안 배양합니다.
다음으로, 튜브를 잠시 회전시키고 1 분 동안 자기 랙에 놓습니다. 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 상체를 옮기고 용출 버퍼 2의 4 마이크로 리터를 추가합니다. 입력 제어를 만들려면 용출 버퍼 2의 99 마이크로 리터와 시어드 크로마틴의 마이크로 리터 1 개를 혼합합니다.
그런 다음 65도에서 4 시간 동안 샘플을 흔들어 보배합니다. 그 후 튜브에 100%의 이소프로판올 100마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이와 7000회 G.에서 5초 동안 샘플을 회전합니다.다음 각 샘플에 10 마이크로리터의 마그네틱 비드를 추가합니다.
소용돌이와 1 시간 동안 실온에서 회전 바퀴에 샘플을 배양. 다음으로 튜브를 짧게 회전시키고 자기 랙에 1분 동안 놓습니다. 슈퍼나티를 흡인시키고 100마이크로리터의 워시 버퍼 1개에 구슬을 재보아보세요.
튜브를 혼합하고 실내 온도에서 회전 바퀴에 5 분 동안 배양하는 반전. 다음으로, 튜브를 잠시 원심 분리합니다. 자기 랙에 1분 동안 놓고 파이펫을 사용하여 상체를 제거합니다.
그런 다음 세척 버퍼 2의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 튜브를 혼합하고 실내 온도에서 회전 바퀴에 5 분 동안 배양하는 반전. 그 후, 튜브를 잠시 원심분리하고 1분 동안 자기 랙에 넣습니다.
포부를 통해 세척 버퍼 2개를 제거하고 용출 버퍼55 마이크로리터에서 구슬을 다시 분리합니다. 침전된 DNA를 15분 동안 실온에서 회전하는 바퀴로 샘플을 배양한다. 그 후 튜브를 짧게 회전시키고 자기 랙에 1분 동안 놓습니다.
마지막으로, 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 상체를 전송합니다. 이 프로토콜은 LCK를 잠재적NFAT2 표적으로 분석하는 Jurkat 세포로 처음 수행되었습니다. 여기서 나타난 바와 같이, 최적의 결과는 IL-2 양성 대조군 및 LCK DNA의 유의한 농축에 의해 문서화되었다.
최적이 아닌 전단 또는 누락된 고정은 나쁜 질 DNA로 이끌어 낼 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 프로토콜은 CD40L을 실험 대상으로 서 양성 대조군 및 LCK역할을 하는 1차 인간 CLL 세포로 수행되었다. LCK DNA의 강한 농축에 의해 입증된 바와 같이, LCK는 1차 인간 CLL 세포에 있는 직접적인 NFAT2 표적입니다.
품질이 좋지 않은 DNA의 결과로 부적절한 전단은 최적이 아닌 결과를 반환할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 고정 및 초음파 처리 단계는이 방법의 성공을 위해 매우 중요하며 분석되는 세포로 조정해야 할 수도 있음을 기억하는 것이 중요합니다.
