12.14 : Fluorescencja i fosforescencja: Instrumenty

Fluorometry i spektrofluorometry to dwa rodzaje instrumentów używanych do pomiaru fluorescencji molekularnej. Instrumenty te różnią się sposobem wybierania długości fal wzbudzenia i emisji oraz rodzajem wykorzystywanych źródeł światła. Fluorometry wykorzystują filtry interferencji absorpcyjnej do wybierania długości fal wzbudzenia i emisji. Źródłem wzbudzenia w fluorometrze jest zazwyczaj niskociśnieniowa lampa rtęciowa, która emituje intensywne linie rozłożone w obszarach ultrafioletowych i widzialnych. Chociaż fluorymetry nadają się do prac ilościowych i mogą mierzyć intensywność fluorescencji, nie są w stanie rejestrować widm wzbudzenia ani emisji.

Wręcz przeciwnie, spektrofluorometry wykorzystują monochromator do wybierania długości fal wzbudzenia i emisji. Instrumenty te wykorzystują wysokociśnieniową lampę łukową ksenonową jako źródło wzbudzenia, która wytwarza ciągłe widmo emisyjne. Spektrofluorometry mogą rejestrować widma wzbudzenia lub emisji, umożliwiając bardziej szczegółową analizę fluorescencji. Nadają się również do pomiarów ilościowych.

W przypadku fosforescencji molekularnej, do rozróżnienia fosforescencji od fluorescencji wymagana jest specjalistyczna aparatura, znana jako fosforymetria. Fosforescencja ma dłuższy czas życia niż fluorescencja, więc opóźnienie jest włączone między wzbudzeniem a pomiarem emisji fosforescencyjnej. Można to osiągnąć za pomocą dwóch siekaczy, które obracają się poza fazą. Siekacze blokują emisję fluorescencyjną, gdy źródło wzbudzenia jest skupione na próbce i blokują źródło wzbudzenia podczas pomiaru emisji fosforescencyjnej. Aby zapobiec dezaktywacji stanu wzbudzonego przez konwersję zewnętrzną, forma relaksacji bezpromienistej, w której energia jest przenoszona do rozpuszczalnika lub matrycy próbki zamiast być emitowana jako światło, próbki do pomiarów fosforescencji są zazwyczaj rozpuszczane w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym i zamrażane w temperaturze ciekłego azotu. Tworzy to optycznie czystą matrycę stałą, która minimalizuje konwersję zewnętrzną. Alternatywnie, próbkę można unieruchomić na stałym podłożu, umożliwiając pomiar fosforescencji w temperaturze pokojowej.