12.14 : Floresans ve Fosforesans: Enstrümantasyon

Florometreler ve spektroflorometreler, moleküler floresansı ölçmek için kullanılan iki tür cihazdır. Bu cihazlar, uyarma ve emisyon dalga boylarını seçme yöntemleri ile kullandıkları ışık kaynağı türleri açısından farklılık gösterir. Florometreler, uyarma ve emisyon dalga boylarını seçmek için absorpsiyon girişim filtreleri kullanır. Bir florometredeki uyarma kaynağı genellikle, ultraviyole ve görünür bölgelerde yoğun çizgiler yayan dağılmış düşük basınçlı bir cıva buharlı lambadır. Florometreler, floresan yoğunluğunu ölçebildikleri ve kantitatif çalışmalar için uygun oldukları halde, uyarma veya emisyon spektrumlarını kaydedemezler.

Buna karşın, spektroflorometreler uyarma ve emisyon dalga boylarını seçmek için bir monokromatör kullanır. Bu cihazlar, sürekli bir emisyon spektrumu üreten yüksek basınçlı bir ksenon ark lambasını uyarma kaynağı olarak kullanır. Spektroflorometreler, uyarma veya emisyon spektrumlarını kaydedebilir, bu da daha ayrıntılı bir floresans analizi yapılmasına olanak tanır. Ayrıca, kantitatif ölçümler için de uygundurlar.

Moleküler fosforesans durumunda, fosforesans ve floresans arasındaki farkı ayırt etmek için fosforimetre olarak bilinen özel bir cihaz gereklidir. Fosforesans, floresanstan daha uzun bir ömre sahiptir, bu nedenle uyarma ile fosforesan emisyonunun ölçülmesi arasında bir gecikme eklenir. Bu, faz farkı ile dönen iki çark kullanılarak sağlanabilir. Çarklar, uyarma kaynağı örneğe odaklandığında floresan emisyonunu engeller ve fosforesan emisyonu ölçülürken uyarma kaynağını engeller. Dışsal dönüşüm yoluyla uyarılmış halin deaktive olmasını engellemek için, enerji ışık olarak yayılmak yerine çözücüye veya örnek matrisine transfer edilen radyasyonsuz rahatlama biçimi olan bir durumdan kaçınılır; bu nedenle fosforesans ölçümleri için örnekler tipik olarak uygun bir organik çözücü içinde çözülür ve sıvı nitrojen sıcaklıklarında dondurulur. Bu, dışsal dönüşümü minimize eden optik olarak şeffaf bir katı matris oluşturur. Alternatif olarak, örnek bir katı alt tabakaya immobilize edilebilir, bu da oda sıcaklığında fosforesans ölçümüne olanak tanır.