12.14 : Fluorescence et phosphorescence: instrumentation

Les fluorimètres et les spectrofluoromètres sont deux types d'instruments utilisés pour mesurer la fluorescence moléculaire. Ces instruments diffèrent dans la manière dont ils sélectionnent les longueurs d'onde d'excitation et d'émission et dans le type de sources lumineuses qu'ils utilisent. Les fluorimètres utilisent des filtres interférentiels d'absorption pour choisir les longueurs d'onde d'excitation et d'émission. La source d'excitation d'un fluorimètre est généralement une lampe à vapeur de mercure à basse pression qui émet des lignes intenses réparties dans les régions ultraviolettes et visibles. Bien que les fluorimètres soient adaptés aux travaux quantitatifs et puissent mesurer l'intensité de la fluorescence, ils ne peuvent pas enregistrer les spectres d'excitation ou d'émission.

En revanche, les spectrofluoromètres utilisent un monochromateur pour sélectionner les longueurs d'onde d'excitation et d'émission. Ces instruments utilisent une lampe à arc au xénon à haute pression comme source d'excitation, qui produit un spectre d'émission continu. Les spectrofluoromètres peuvent enregistrer les spectres d'excitation ou d'émission, permettant une analyse de fluorescence plus détaillée. Ils conviennent également aux mesures quantitatives.

Dans le cas de la phosphorescence moléculaire, une instrumentation spécialisée, appelée phosphorimétrie, est nécessaire pour faire la distinction entre la phosphorescence et la fluorescence. La phosphorescence ayant une durée de vie plus longue que la fluorescence, un délai est donc incorporé entre l'excitation et la mesure de l'émission phosphorescente. Cela peut être réalisé en utilisant deux hacheurs qui tournent hors phase. Les hacheurs bloquent l'émission fluorescente lorsque la source d'excitation est focalisée sur l'échantillon et bloquent la source d'excitation lors de la mesure de l'émission phosphorescente. Pour empêcher la désactivation de l'état excité par conversion externe — une forme de relaxation sans rayonnement dans laquelle l'énergie est transférée au solvant ou à la matrice de l'échantillon au lieu d'être émise sous forme de lumière — les échantillons pour les mesures de phosphorescence sont généralement dissous dans un solvant organique approprié et congelés à des températures d'azote liquide. Cela forme une matrice solide optiquement claire qui minimise la conversion externe. Alternativement, l'échantillon peut être immobilisé sur un substrat solide, permettant la mesure de la phosphorescence à température ambiante.