12.14 : Fluorescência e Fosforescência: Instrumentação

Fluorômetros e espectrofluorômetros são dois tipos de instrumentos usados ​​para medir a fluorescência molecular. Esses instrumentos diferem na forma como selecionam os comprimentos de onda de excitação e emissão e no tipo de fontes de luz que utilizam. Os fluorômetros usam filtros de interferência de absorção para escolher os comprimentos de onda de excitação e emissão. A fonte de excitação em um fluorômetro é tipicamente uma lâmpada de vapor de mercúrio de baixa pressão que emite linhas intensas distribuídas pelas regiões ultravioleta e visível. Embora os fluorômetros sejam adequados para trabalho quantitativo e possam medir a intensidade da fluorescência, eles não podem registrar espectros de excitação ou emissão.

Em contraste, os espectrofluorômetros utilizam um monocromador para selecionar os comprimentos de onda de excitação e emissão. Esses instrumentos empregam uma lâmpada de arco de xenônio de alta pressão como fonte de excitação, que produz um espectro de emissão contínuo. Os espectrofluorômetros podem registrar espectros de excitação ou emissão, permitindo uma análise de fluorescência mais detalhada. Eles também são adequados para medições quantitativas.

No caso da fosforescência molecular, é necessária uma instrumentação especializada, conhecida como fosforimetria, para discriminar entre fosforescência e fluorescência. A fosforescência tem uma vida útil mais longa do que a fluorescência, então um atraso é incorporado entre a excitação e a medição da emissão fosforescente. Isso pode ser obtido usando dois choppers que giram fora de fase. Os choppers bloqueiam a emissão fluorescente quando a fonte de excitação é focada na amostra e bloqueiam a fonte de excitação ao medir a emissão fosforescente. Para evitar a desativação do estado excitado por conversão externa, uma forma de relaxamento sem radiação na qual a energia é transferida para o solvente ou matriz da amostra em vez de ser emitida como luz, as amostras para medições de fosforescência são tipicamente dissolvidas em um solvente orgânico adequado e congeladas em temperaturas de nitrogênio líquido. Isso forma uma matriz sólida opticamente clara que minimiza a conversão externa. Alternativamente, a amostra pode ser imobilizada em um substrato sólido, permitindo a medição da fosforescência em temperatura ambiente.