Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem

Resumo

Cariótipo é uma técnica simples e útil amplamente utilizado para detectar alterações genéticas. Descrevemos aqui um passo a passo protocolo para a preparação cromossomo disseminação de células estaminais embrionárias humanas para monitorar o estado cromossômica dessas células mantidas em cultura.

Resumo

Apesar de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) foram mostrados para apresentar um cariótipo diplóide estável ^1, muitos estudos têm relatado que dependendo das condições de cultura torna-se propenso a adquirir anomalias cromossômicas, como adição de conjunto ou de partes de cromossomos. Com efeito, durante longo prazo de cultura, alterações cariotípicas são observadas quando enzimática ou química de dissociação são usados ^​​2,3,4, enquanto dissecção manual de colônias para passaging mantém um cariótipo estável ^5. Além disso, as mudanças no ambiente, tais como a remoção de células de alimentação também parecem comprometer a integridade genética das CTEh ^3,6. Uma vez que alterações cromossômicas podem afetar a fisiologia celular, a caracterização da integridade genética das CTEh in vitro é CTEh considerando crucial como uma ferramenta essencial em estudos de embriogênese e testes de drogas. Além disso, para o futuro fins terapêuticos alterações cromossômicas são uma preocupação real como ele é freqüentemente associada à carcinogênese.

Aqui nós mostramos um método simples e útil para obter spreads cromossomo de alta qualidade para posterior análise do cromossomo definido pelo G-banding, FISH SKY, ou técnicas de CGH ^7,8. Recomendamos que verifique o estado cromossômicas rotineiramente com intervalos de 5 passagens a fim de monitorar o aparecimento de translocações e aneuploidias

Priscila Britto e Rafaela Sartore contribuíram igualmente para o papel.

Protocolo

EQUIPAMENTO

• Cultura de tecidos incubadora, 37 ° C CO, 5% ₂
• Centrifugador
• Conjunto de micropipettors (100, 100μL)
• Banho-maria 37 ° C
• Banho-maria 90 ° C a ser fonte de vapor de água
• Microscópio de contraste de fase

PRIMEIRO PASSO

Tratar as células com Colcemid

Neste procedimento foi utilizada a linha CTEh H9 cultivadas sobre fibroblastos embrionárias de rato (MEF) inativados com mitomicina C (Sigma) e mantidos em DMEM/F12 (Invitrogen) suplementado com a substituição knockout 20% de soro (KSR, Gibco) e 8ng/mL de fator de crescimento fibroblástico (FGF-2, R & D).

A fim de obter um grande número de metáfases se espalha, é recomendado o uso de culturas com alto índice mitótico em que há muitas células em divisão.

1. Pegue o frasco de cultura da incubadora e, no fluxo laminar, adicione Colcemid na concentração final de 0,1 mg / mL.
2. Retornar o frasco para a incubadora e esperar 3 horas para que o inibidor pode causar paragem da mitose na metáfase, quando os cromossomos estão bem condensados ​​e podem ser facilmente visualizadas ao microscópio.

Fixação das células

3. Retire e adicione o meio tripsina / EDTA 0,05% suficiente para cobrir a superfície das células. Permitir que as células incubar por 5 minutos em temperatura ambiente e depois inativar a enzima quer pela inclusão de meio de cultura contendo soro ou apenas adicionando soro para as células.
   NOTA: É importante certificar-se que uma suspensão única célula é conseguido obter bons spreads metáfase.
4. Transferência das células para um tubo de centrifugação de 15 mL e centrifugar a 122 g por 5 minutos.
5. Desprezar o sobrenadante, deixando cerca de 200 mL, e ressuspender o sedimento delicadamente tocando o tubo, como mostrado no vídeo. Certifique-se que as células estão bem dissociada, então você não pode visualizar qualquer aglomerados na solução.
6. Em seguida, você terá que adicionar 5 mL de solução hipotônica (KCl 75mm) pré-aquecido a 37 ° C, lentamente, pela parede do tubo como no seguinte descrição. Primeiro adicione 3 ml, inverter o tubo para a posição horizontal apenas para misturar as células com a solução hipotônica em seguida, adicionar os 2 ml restantes e manter aquecido a 37 ° C por 15 minutos.
   NOTA: Neste ponto, a solução hipotônica irá causar um aumento no volume celular e ajudam a desembaraçar os cromossomos. O tempo de incubação é importante para adquirir spreads cromossomo bom. Se o tempo é muito longo, a membrana celular pode estourar cedo demais e os cromossomos são perdidos. Se for muito curto, pode ser difícil obter spreads cromossomo porque a membrana celular não pode perturbar.
7. Adicionar 3 gotas da solução fixadora (metanol / ácido acético glacial 3:1), inverter o tubo suavemente para misturar a solução fixadora com as células e centrifugar a 122 g por 5 minutos sem intervalo.
   NOTA: A solução fixadora deve ser preparado.
   NOTA: É importante o uso de centrifugação, sem interrupção, para evitar o desgaste das células, evitando a perda do material.
8. Desprezar o sobrenadante, deixando cerca de 200 mL, e ressuspender o sedimento delicadamente tocando no fundo do tubo.
   NOTA: Mais uma vez, certifique-se que as células estão bem dissociada, então você não pode visualizar qualquer aglomerados na solução.
9. Adicione o primeiro de 3 mL de solução fixadora, lentamente pela parede do tubo, enquanto você gira o tubo. Inverter o tubo para a posição horizontal apenas para misturar as células, e em seguida, adicione mais 2 mL da solução de fixador de parede do tubo para tirar as células para baixo. Estoque a 4 ° C durante a noite.
   NOTA: As células fixas podem ser armazenados em solução fixadora por meses a 4 ° C. Além de proteger as células em seu estado inchado, a solução fixadora elimina lipídios e proteínas desnatura. Estes eventos fazem a membrana celular frágil e, como resultado, fazer o cromossomo espalhar facilmente.

LIMPEZA DO lâminas de vidro

Antes de iniciar fazendo espalha o seu cromossomo se certificar de que seus slides estão devidamente limpos, ou você pode perder alguns núcleos e também metáfases. Esta etapa é bem importante se você quiser experimentar qualquer técnica de hibridização ^9.

1. Coloque as lâminas num copo contendo HCl 6M por pelo menos 3 h à temperatura ambiente.
2. Após este tempo, lavagem das lâminas em água corrente por 10 minutos.
3. Enxágüe as lâminas em água destilada e deixar eles secam em temperatura ambiente.
4. Agora as lâminas podem ser armazenadas em etanol 96% e secos com um pano imediatamente antes da utilização.

NOTA: Para nos métodos de hibridização in situ, as lâminas não pode ser armazenado por mais de dois dias em etanol 96%

SEGUNDA ETAPA

Lavar as células

10. No dia seguinte, centrifugar as células em 122 g por 5 minutos sem intervalo.
11. Discard o sobrenadante deixando cerca de 200 ml. Ressuspender o sedimento suavemente flicking o tubo, em seguida, adicionar 5 ml de solução fixadora fresco (metanol / ácido acético glacial 3:1), lentamente pela parede do tubo durante a rotação do tubo. Repita este passo de lavagem mais 2 vezes para um total de três lavagens.
    NOTA: A solução fixadora deve ser preparado.

Preparando os slides

12. Na última etapa de centrifugação deixar quantidade suficiente de solução para homogeneizar o pellet celular e obter uma densidade adequada de células nas lâminas (ver figura 1).
13. Adicionar 2-30 mL de suspensão de células sobre uma lâmina limpa e seca, movendo a pipeta muito próximo e paralelo à superfície. Como a evaporação solução fixadora, a superfície da lâmina torna-se granulado.
14. Imediatamente, expor o slide, a face para cima, para o vapor de água quente (90 °) por 30 segundos para fazer com que as células explodir.
    NOTA: Neste momento, o metanol evapora a partir da solução fixadora, resultando em uma concentração de ácido acético aumentou, o que junto com a água estimula o cromossomo se espalhando.
15. Olhe para um microscópio de contraste de fase, apenas para verificar se a concentração, bem como a distribuição das células é bom (ver figura 1).
16. Agora os slides estão prontos para ser utilizados para verificar o conjunto de cromossomos por citogenética abordagens como bandamento G, SKY FISH (Giemsa), ou CGH.

DICAS IMPORTANTES

Como escolher uma metáfase adequada a ser analisada

Escolhendo metáfases redondo e isolado (figura 2D), você pode evitar considerando aneuploidias falso como o ganho de cromossomos gerados por dois ou mais se espalha misturados entre si ou a perda de cromossomos gerados por um cromossomo lançado. Assim, evitar a escolha de metáfases perto núcleos porque alguns cromossomos pode ser escondida por eles (figura 2A e 2B). Além disso, procurar metáfases redonda e ter certeza de que qualquer cromossomo é separado da metáfase (figura 2C).

Células de alimentação e do cariótipo CTEh

Para bandamento G e análise SKY, a presença de células alimentadoras na cultura CTEh não interfere com os resultados, porque as células de alimentação não estão sob um estado de divisão (inativados por mitomicina C ou irradiação) e não será uma parte da população metáfase. No entanto, para a aplicação da técnica FISH em núcleos interfásicos, é preferível para separar a população CTEh a partir de células de alimentação por colher as colônias manualmente antes de tripsinização para análise FISH.

Figura 1: Como conhecer a densidade de célula apropriada nos slides. Imagens de microscópio de contraste de fase na objetiva de 10x. (A) A densidade celular é muito alto. As setas apontam para metáfase se espalha muito próximo de núcleos. (B) Um slide com boa densidade celular. Os círculos mostram metáfases spreads isolado de núcleos ou metáfases outros. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.

Figura 2: Como escolher uma metáfase adequada para ser analisado. Cromossomos são corados com DAPI e as imagens obtidas por um microscópio de fluorescência em objetiva de 100x. (A) (B) Evite metáfases perto núcleos (indicado pelas setas) (C) e metáfases não volta que os cromossomos presentes separados (círculo). (D) A rodada é uma metáfase metáfase bom para ser analisado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.

Discussão

A preparação dos spreads cromossomo é um passo crítico para uma análise bem sucedida do estado genético das células-tronco embrionárias pelo rotineiramente técnicas como bandamento G, e as técnicas mais sofisticadas, como FISH, SKY e CGH.

Este procedimento pode ser aplicado para vários tipos de células, variando o período de incubação Colcemid, que depende da duração do ciclo celular. Para colônias de células-tronco embrionárias, vamos esperar três horas enquanto que par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Techno Plastic Products	91015
Colcemid Karyo MAX	GIBCO, by Life Technologies	15212-012
EDTA	Isofar	721
Glacial acetic acid	Isofar	100
Methanol	Isofar	208
Potassium Chloride (KCl)	Merck & Co., Inc.	104.931.000
Slide	Bioslide	7105-1
Tripsin	Sigma-Aldrich	T4799