Preparazione Stendere cromosomiche di cellule staminali embrionali umane per cariotipo

Riepilogo

Cariotipo è una tecnica semplice e utile ampiamente utilizzato per la rilevazione di alterazioni genetiche. Qui si descrive un passo dal protocollo passo per la preparazione diffusione cromosoma di cellule staminali embrionali umane per monitorare lo stato cromosomico di queste cellule mantenute in coltura.

Abstract

Sebbene cellule staminali embrionali umane (hESC) hanno dimostrato di presentare un cariotipo diploide stabile ^1, molti studi hanno riportato che in base alle condizioni cultura diventano inclini ad acquisire le anomalie cromosomiche come la aggiunta di interi o parti di cromosomi. Infatti, durante il lungo periodo la cultura, le alterazioni del cariotipo si osservano quando dissociazione enzimatica o chimica sono usati ^2,3,4, mentre dissezione manuale di colonie per passaging mantiene un cariotipo stabile ^5. Inoltre, cambiamenti nell'ambiente come la rimozione delle cellule alimentatore sembrano anche compromettere l'integrità genetica di hESC ^3,6. Una volta che le alterazioni cromosomiche potrebbero influenzare la fisiologia cellulare, la caratterizzazione della integrità genetica di hESC in vitro è di fondamentale importanza hESC considerare come uno strumento essenziale negli studi di embriogenesi e test della droga. Inoltre, per futuri scopi terapeutici alterazioni cromosomiche sono una reale preoccupazione in quanto è frequentemente associata a carcinogenesi.

Qui vi mostriamo un metodo semplice e utile per ottenere alta qualità dei cromosomi si diffonde per la successiva analisi del cromosoma fissati dal G-banding, FISH, SKY o tecniche di CGH ^7,8. Si consiglia di verificare lo stato cromosomico di routine con intervalli di 5 passaggi al fine di monitorare la comparsa di traslocazioni e aneuploidie

Priscila Britto e Rafaela Sartore contribuito in maniera uguale alla carta.

Protocollo

ATTREZZATURE

• Tessuto cultura incubatore, 37 ° C, 5% di CO ₂
• Centrifuga
• Set di micropipettors (100, 100μL)
• Acqua del bagno 37 ° C
• Bagnomaria a 90 ° C a essere fonte di vapore d'acqua
• Microscopio a contrasto di fase

PRIMO PASSO

Trattando le cellule con Colcemid

In questa procedura abbiamo usato la linea hESC H9 colta su fibroblasti embrionali di topo (MEF) inattivato con Mitomicina C (Sigma) e mantenuti in DMEM/F12 (Invitrogen) integrata con la sostituzione ad eliminazione diretta il 20% di siero (KSR, Gibco) e 8ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-2, R & S).

Al fine di ottenere un gran numero di metafasi si diffonde, si consiglia di utilizzare le culture con elevato indice mitotico in cui ci sono molte cellule in divisione.

1. Prendere il pallone cultura dal termostato e, nel flusso laminare, aggiungere Colcemid ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml.
2. Ritorna il pallone l'incubatore e attendere 3 ore in modo che il inibitori può causare arresto mitotico in metafase, quando i cromosomi sono ben condensati e possono essere facilmente visualizzati sotto il microscopio.

Fissaggio delle cellule

3. Estrarre il supporto e aggiungere tripsina / EDTA 0,05% sufficiente a coprire la superficie delle cellule. Consentono alle cellule di incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e poi inattivare l'enzima sia con l'aggiunta di terreno di coltura contenente siero o con la sola aggiunta di siero alle cellule.
   NOTA: è importante fare in modo che una sospensione singola cella è realizzata per ottenere diffonde metafase bene.
4. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 122 g per 5 minuti.
5. Eliminare il supernatante, lasciando circa 200 mL e risospendere il pellet delicatamente toccando il tubo, come mostrato nel video. Assicurarsi che le cellule sono ben dissociato, quindi non è possibile visualizzare qualsiasi grumi nella soluzione.
6. Successivamente sarà necessario aggiungere 5 ml di soluzione ipotonica (KCl 75mm) pre-riscaldato a 37 ° C, lentamente, dalla parete del tubo come nella seguente descrizione. In primo luogo aggiungere 3 ml, invertire il tubo in posizione orizzontale solo per mescolare le cellule con la soluzione ipotonica quindi aggiungere i rimanenti 2 ml e tenere in caldo a 37 ° C per 15 minuti.
   NOTA: A questo punto la soluzione ipotonica causerà un aumento del volume cellulare e aiuta a districare i cromosomi. Il tempo di incubazione è importante acquisire diffonde cromosoma bene. Se i tempi sono troppo lunghi, la membrana cellulare può esplodere troppo presto e cromosomi vengono persi. Se troppo breve, può essere difficile ottenere diffonde cromosoma perché la membrana cellulare non può interrompere.
7. Aggiungere 3 gocce della soluzione di fissativo (metanolo / acido acetico glaciale 3:1), invertire il tubo delicatamente per mescolare la soluzione fissativa con le cellule e centrifugare a 122 g per 5 minuti, senza intervallo.
   NOTA: La soluzione fissativo dovrebbe essere preparato.
   NOTA: è importante usare centrifugazione senza interruzione per evitare attriti cellule, impedendo la fuoriuscita del materiale.
8. Eliminare il supernatante, lasciando circa 200 mL e risospendere il pellet delicatamente toccando il fondo della provetta.
   NOTA: Anche in questo caso, assicurarsi che le cellule sono ben dissociato, quindi non è possibile visualizzare qualsiasi grumi nella soluzione.
9. Aggiungere i primi 3 ml di soluzione fissativo, lentamente la parete del tubo, mentre si ruota il tubo. Invertire il tubo in posizione orizzontale solo per mescolare le celle e quindi aggiungere altre 2 mL della soluzione fissativo dalla parete del tubo di prendere le cellule verso il basso. Magazzino a 4 ° C durante la notte.
   NOTA: Le cellule fisso può essere conservato in soluzione fissante per mesi a 4 ° C. Oltre a proteggere le cellule nel loro stato gonfio, la soluzione fissante rimuove i lipidi e le proteine ​​denatura. Questi eventi rendono la membrana cellulare fragile e, di conseguenza, rendere il cromosoma diffonde facilmente.

PULIZIA DEL vetrini

Prima di iniziare rendendo il vostro diffonde cromosoma assicurarsi che le diapositive siano adeguatamente puliti o si rischia di perdere alcuni nuclei e anche metafasi. Questo passo è così importante se si vuole provare tutte le tecniche di ibridazione ^9.

1. Posizionare i vetrini in un bicchiere contenente HCl 6M per almeno 3 ore a temperatura ambiente.
2. Trascorso questo tempo, lavare i vetrini in acqua corrente per 10 minuti.
3. Sciacquare i vetrini in acqua distillata e lasciare che si asciugano a temperatura ambiente.
4. Ora le diapositive possono essere memorizzati in etanolo al 96% e asciugato con un panno immediatamente prima dell'uso.

NOTA: Per metodi di ibridazione in situ, le diapositive non può essere conservato per più di 2 giorni in etanolo al 96%

SECONDO STEP

Lavaggio delle cellule

10. Il giorno dopo, centrifugare le cellule a 122 g per 5 minuti, senza intervallo.
11. Discard il surnatante lasciando circa 200 ml. Risospendere il pellet con delicatezza sfogliando il tubo poi aggiungere 5 ml di soluzione di fissativo fresco (metanolo / acido acetico glaciale 3:1), lentamente dalla parete del tubo durante la rotazione del tubo. Ripetere questa fase di lavaggio altre 2 volte per un totale di tre lavaggi.
    NOTA: La soluzione fissativo dovrebbe essere preparato.

Preparare le diapositive

12. Alla fase di centrifugazione scorso lasciare sufficiente quantità di soluzione per omogeneizzare il pellet ed ottenere una densità sufficiente di cellule nelle slide (vedi figura 1).
13. Aggiungere 20-30 ml di sospensione cellulare su un vetrino pulito e asciutto, spostando la pipetta molto vicino e parallelo alla superficie. Come la soluzione evapora fissativo, la superficie di scorrimento diventa granulosa.
14. Immediatamente, esporre la diapositiva, a faccia in su, nel vapore di acqua calda (90 °) per 30 secondi per provocare le cellule saltare in aria.
    NOTA: In questo momento, il metanolo dalla evapora la soluzione fissativa, con un conseguente aumento della concentrazione di acido acetico, che insieme con l'acqua stimola il cromosoma diffusione.
15. Guardate un microscopio a contrasto di fase solo per verificare se la concentrazione e la distribuzione delle cellule è buono (vedi figura 1).
16. Ora le diapositive sono pronte per essere utilizzato per controllare il set di cromosomi da approcci citogenetica come G-banding (Giemsa), FISH, SKY o CGH.

CONSIGLI IMPORTANTI

Come scegliere un metafase adeguata da analizzare

La scelta di metafasi rotondo e isolato (figura 2D), si può evitare di considerare aneuploidie falso come il guadagno dei cromosomi generata da due o più si diffonde miscelati tra loro o la perdita di cromosomi generato da un cromosoma lanciato. Quindi, evitare di scegliere metafasi vicino nuclei perché alcuni cromosomi possono essere nascoste da loro (figura 2A e 2B). Inoltre, cercare metafasi giro ed essere sicuro che ogni cromosoma è separato dalla metafase (figura 2C).

Cellule feeder e cariotipo hESC

Per G-banding e analisi SKY, la presenza di cellule di alimentazione nella cultura hESC non interferisce con i risultati, perché le cellule di alimentazione non sono in uno stato che divide (inattivato dalla mitomicina C o irradiazione) e non sarà parte della popolazione metafase. Tuttavia, per l'applicazione della tecnica FISH nei nuclei interfase, si è preferito separare la popolazione hESC a partire da cellule alimentatore dalla raccolta delle colonie manualmente prima tripsinizzazione per l'analisi FISH.

Figura 1: Come sapere la appropriata densità delle cellule nelle diapositive. Le immagini del microscopio a contrasto di fase obiettivo 10x. (A) La densità delle cellule è troppo alta. Le frecce indicano metafase si diffonde troppo vicino dei nuclei. (B) Una diapositiva con una buona densità cellulare. I cerchi mostrano diffonde metafasi da nuclei isolati o metafasi altri. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.

Figura 2: Come scegliere un metafase adeguata da analizzare. I cromosomi sono colorati con DAPI e le immagini ottenute con un microscopio a fluorescenza a obiettivo 100x. (A) (B) Evitare metafasi vicino a nuclei (indicati dalle frecce) (C) e metafasi non rotondi che i cromosomi presentano separati (cerchio). (D) Un metafase rotonda è una metafase bello per essere analizzati. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.

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Discussione

La preparazione degli spread cromosoma è un passo fondamentale per un'analisi efficace della situazione genetica delle cellule staminali embrionali da tecniche di routine come G-banding, e le tecniche più sofisticate come la FISH, SKY e CGH.

Questa procedura può essere applicata per molti tipi di cellule, variando il periodo di incubazione Colcemid, che dipende dalla durata del ciclo cellulare. Per le colonie di cellule staminali embrionali, aspettiamo 3 ore, mentre per corpi embriona...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Techno Plastic Products	91015
Colcemid Karyo MAX	GIBCO, by Life Technologies	15212-012
EDTA	Isofar	721
Glacial acetic acid	Isofar	100
Methanol	Isofar	208
Potassium Chloride (KCl)	Merck & Co., Inc.	104.931.000
Slide	Bioslide	7105-1
Tripsin	Sigma-Aldrich	T4799