Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Resumo

A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.

Resumo

Em geral, as células estaminais embrionárias (hESCs) e células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs) ¹ podem ser cultivadas sob condições variáveis. No entanto, não é fácil para estabelecer um sistema eficaz para a cultura dessas células. Uma vez que as condições de cultura pode influenciar a expressão do gene que confere pluripotência em hESCs e hiPSCs, a otimização e padronização do método de cultura é crucial.

O estabelecimento de linhas de células estaminais embrionárias humanas foi descrita pela primeira vez utilizando MEFs como células de alimentação e de soro fetal bovino ^(FBS)-2 contendo meio de cultura. Em seguida, foi substituído com FBS a substituição knockout soro (KSR) e FGF2, o que aumenta a proliferação de hESCs ^3. Finalmente, os sistemas de alimentação de cultura sem permitir a cultura de células em Matrigel placas revestidas em KSR contendo meio condicionado (meio condicionado por MEFs) ^4. Posteriormente, as condições de cultura hESCs se mudaram para alimentador de cultura livre em definidores quimicamentecondições ed ^5-7. Além disso, para evitar a contaminação potencial por patógenos e métodos de animais proteínas de cultura utilizando xeno-free componentes foram estabelecidas ^8.

Para se obter melhores condições células alimentadoras do rato foram substituídos com linhas de células humanas (por exemplo, músculo fetal e células da pele ^9, as células adultas da pele ^10, fibroblastos de prepúcio ^11-12, amnióticas células mesenquimais ^13). Contudo, a eficiência de manter hESCs indiferenciadas usando prepúcio humano camadas de fibroblastos derivados de alimentação não é tão elevada como a partir de células de ratinho de alimentação devido ao baixo nível de secreção de Activina A ^14. Obviamente, há uma evidente diferença na produção de fator de crescimento pelo rato e células alimentadoras humanos.

A análise dos transcriptomas de rato e células alimentadoras humanos revelou diferenças significativas entre as células de apoio e não apoio. Exógena FGF2 é crucial para a manutenning auto-renovação das hESCs e hiPSCs, e tem sido identificada como um factor chave regulando a expressão de TGF-p1, Uma Activina e Gremlin (um antagonista de BMP) em células de alimentação. Activina A tem sido mostrado para induzir a expressão de Oct4, SOX2, e NANOG em hESCs ^15-16.

Para a cultura de longo prazo, e hESCs hiPSCs podem ser cultivadas em MEFs mitoticamente inactivado ou sob condições isentas de alimentador em MEF-CM (MEF-meio condicionado) em Matrigel placas revestidas para manter o seu estado não diferenciado. Sucesso de ambas as condições de cultura depende inteiramente da qualidade das células de alimentação, uma vez que afecta directamente o crescimento de hESCs.

Aqui, nós apresentamos um método optimizado para o isolamento e cultura de fibroblastos de rato embrionários (MEFs), a preparação de meio condicionado (CM) e enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) para avaliar os níveis de Activina A dentro dos meios de comunicação.

Protocolo

1. Isolamento de fibroblastos embrionários (MEFs)

Os dois passos seguintes são realizadas sob condições não assépticas.

1. Sacrifique um rato grávida (CF1, Harlan, EUA) em 13 ou 14 dpc (dia pós-coitum) por deslocamento cervical.
2. Dissecar os cornos uterinos, brevemente enxaguar em 70% (v / v) de etanol e local dentro de um tubo Falcon contendo PBS sem Ca ^{2 +} Mg ^{2 +} (Gibco, Invitrogen).

Os passos seguintes são realizadas em um capuz de cultura de tecido sob condições assépticas e utilizando instrumentos estéreis.

3. Coloque cornos uterinos em uma placa de Petri e separar cada embrião a partir da sua placenta e do saco embrionário.
4. Dissecar cabeça e os órgãos vermelhas, lave em PBS e colocar todos os embriões em placas de Petri limpa. Finamente moída o tecido usando uma lâmina de barbear estéril até que se torne possível a pipeta.
5. Adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina / EDTA (Gibco, Invitrogen), including 100 unidades Kunitz de DNase I (USB), por embrião.
6. Transferir o tecido em um tubo Falcon 50 ml e incubar durante 15 min a 37 ° C. Após cada 5 min de incubação, dissociar as células por pipetagem de cima e para baixo completamente.
7. Inactivar a tripsina, adicionando cerca de 1 volume do meio de MEF recentemente preparada.
   MEF meio de cultura (componentes para fazer 500 ml de meio, misturar todos os componentes e filtro):
   450 ml de DMEM, 50 ml de FBS (10% (v / v)), 5 ml de 200 mM de L-glutamina (1/100 (v / v)), 5 ml de penicilina-estreptomicina (1/100 (v / v)).
8. Centrifugar as células com baixa velocidade (300 xg), 5 min, cuidadosamente remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em meio de células MEF quente.
9. Placa de aproximadamente um número de células que é equivalente a 3-4 embriões em cada balão T150 (TPP) revestidas com gelatina a 0,2% (A gelatina de pele de bovino, do Tipo B, Sigma) durante 2 horas. Os fibroblastos (P0, passagem 0) são as únicas células que têm a capacidade para ligar aos frascos revestidos a gelatina.
10. Idealmente, as células são de 80-90% confluentes após 24 hr e, nesta fase, uma parte importante do P0 células é congelado para uso futuro.
11. Expandir o balão T150 restante (s) de P0 células até P3 ou P4, em seguida, inactivar e utilização como alimentadores para replate hESCs ou para produzir o meio condicionado (CM).

2. Inativação e Plating MEFs (Preparação células alimentadoras)

Todos os passos são realizados em uma capa de cultura de tecido sob condições assépticas.

1. Casaco T150 frascos com gelatina a 0,2% e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas.
2. Diluir a mitomicina C em PBS (1 mg / ml) e filtrar.
3. Aspirar a mídia MEFs e lavar com PBS sem Ca ^{2 +} Mg ^{2 +.}
4. Colocar 20 ml de meio contendo 10 ug / ml de mitomicina C em MEFs.
5. Incubar durante 2 horas a 37 ° C com mitomicina C, em seguida, contendo o meio de lavar duas vezes com PBS, trypsinize, de centrifugação (durante 5 min a 300 xg) e Ressuspender as células em meio quente.
6. Contar as células e em placas a uma densidade de 56.000 células / cm ² no T150 frascos e utilizar para a produção de CM para os seguintes 6 dias.

3. Meio condicionado Preparação (CM)

Todos os passos são realizados em uma capa de cultura de tecido sob condições assépticas.

1. No dia após plaqueamento MEFs inactivada a uma densidade de 56.000 células / cm ² substituir o meio com meio MEF hESC (UM, meio não condicionado) (0,5 ml / cm ²⁾ suplementado com recém-4 ng / ml de FGF2.
2. Collect CM partir de frascos de alimentação após 24 h de incubação e adicionar meio hESC fresco contendo 4 ng / ml de FGF2 para os alimentadores.
3. Repita este procedimento para os próximos 6 dias. Cada loja dia coletados CM a -20 ° C.
4. Após 6 dias misturar todos os alíquotas de médio e de filtro (Corning, 0,22, PAS). Fazer alíquotas de 50 ml e armazenar a -80 ° C.
5. Suplemento CM com 4 ng adicional / ml de FGF2 antes de adicionar a hESCs cultivadas em Matrigel.

4. Medição da Activina A em meios condicionados (ELISA) ¹⁵

1. Traga todas as amostras e reagentes à temperatura ambiente.
2. Diluir o anticorpo capturar (Humanos \ Mouse \ Rat Activina A MAB, R e D Systems) em PBS com BSA a 1%, adicionar a microplaca (100 uL / ​​poço) e incubar durante a noite à RT.
3. Após 24 hr lavar os poços três vezes com PBST (PBS com 0,05% de Tween 20) (300 ul / poço) então o bloco (1% BSA / PBS, 300 ul / poço) durante 1 h à RT.
4. Neste tempo preparar uma Um Activina (R e D Systems) curva padrão, incluindo 7 diluições (concentração inferior a 30 ng / ml) e amostra em branco. A gama linear de trabalho do Activina A é entre 0,25 e 32 ng / ml.
5. Adicionar duplicados de padrões e amostras aos poços (100 ul / poço) e incubar durante 2 horas à RT.
6. Lavar os poços três vezes (300 uL de PBST).
7. Adicione o anticorpo (biotinilado) secundário (Mouse / Humano / Rato biotinilado Activina A MAB, R & D Systems) (0.25 ug / ml em 1% de BSA / PBS) e incubar durante 2 horas à RT.
8. Lavar os poços três vezes (300 uL de PBST), adicionar Estreptavidina-HRP (diluído em BSA a 1% / PBS, R e D Systems) e incubar durante 20 min à TA.
9. Lavar os poços três vezes (300 uL de PBST), adicionar 100 uL de solução de substrato (Quantikine, R e D Systems) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
10. Adicione 100 ml de solução de paragem (Quantikine, R & D Systems) para cada poço e misture delicadamente.
11. Conjunto Microplate Reader (Molecular Devices Spectra Max 250, Instrumentação Médica Global, Inc., Minnesota) a 450 nm, com correcção de comprimento de onda a 540 ou 570 nm, para determinar a densidade óptica de cada poço.

5. Os resultados representativos

O esquema geral do procedimento de isolamento é apresentada na Figura 1. A morfologia típica de hESCs e hiPSCs cultivados em condições diferentes é apresentado na Figura 2. A morfologia do MEFs e células alimentadoras inactivadas utilizados para preparar CM é apresentada na Figura 3. Em geral, as células devem ser confluente de 24 horas pós-isolamento e pronto para ser congelada ou expandido. No entanto, às vezes isso pode levar 2-3 dias antes da obtenção de culturas confluentes. O CM deve ser preparados a partir de células em passagem 4 e não depois. Isto é crucial porque as células primárias só pode ser expandido para 4-5 passagens antes do início da senescência.

A citoquina, Activina A, é considerado como o factor mais crítico secretada por células de alimentação para o suporte do crescimento de células indiferenciadas pluripotentes ^14. A medição do nível de Activina A em CM (Figura 4) é um ensaio muito conveniente quantitativo para controlar a qualidade dos MEFs.

Figura 1. Uma representação esquemática do procedimento de isolamento MEFs.

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Figura 2. A morfologia típica de hESCs indiferenciadas cultivadas na presença de células (A) de alimentação, (B) meio condicionado e médios (C) definido. A morfologia típica de hiPSCs cultivadas na presença de células (D, E) de alimentação.

Figura 3. A morfologia típica de fibroblastos de rato embrionários (MEFs). (A) Passagem 0 (P0), dois dias após o plaqueamento / isolamento, (B) camada alimentadora inactivada a uma densidade de 56.000 células / cm. ²

Figura 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-baseados medições da concentração de Activina A em meio condicionado (CM) prepared com fibroblastos de rato embrionários provenientes da estirpe de ratinhos CF1. CM foi recolhido durante 6 dias e depois reunidas. CM "1" CM e "2" se referem a diferentes lotes de meios de comunicação e da UM para a mídia incondicionados. Como a função do processo de condicionamento é Activina A secreção para o meio de pelo MEFs, Activina A é quase indetectável em UM.

Discussão

O processo de isolamento MEFs aqui apresentado permite o estabelecimento de uma condição de cultura padronizada para hESCs e hiPSCs. Além disso, o sistema de ELISA baseado utilizado para avaliar a produção de citocinas pelas células de alimentação é um indicador útil da qualidade dos meios de comunicação MEF derivados condicionados. A manutenção de rotina da estirpe de rato (CF1) proporcionando fibroblastos de suporte é necessário para evitar lote para lote variação de meios de cultura. Além disso, recomenda-se para isolar os embriões de ratinhos vários simultaneamente para se obter uma qualidade consistente de células. Certamente MEFs recentemente isolado pode ser mantido congelado a P0 e P1. MEFs também inactivado pode ser mantida congelada em alíquotas de quantidades apropriadas, dependendo dos requisitos para a cultura de células. Normalmente, aproximadamente 250,000 células devem ser revestida em um único poço de uma placa de 6 poços para hESCs cultura e células iPS. O método estabelecido e optimizado podendo ser utilizado rotineiramente para minimizar a variabilidade entre difealugar experimentos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DMEM (glicose alta)	Gibco, Invitrogen	41966-052
FBS	Biochrom	S0115
L-glutamina	Gibco, Invitrogen	25030-024
Penicilina-estreptomicina	Gibco, Invitrogen	15140-122
Sistema de filtro a vácuo	Corning	431097	500 ml, 0,22, PAS
DMSO	Sigma	D2650
Knockout DMEM	Gibco, Invitrogen	10829-018
Ser Knockouthum substituição	Gibco, Invitrogen	10828-028
Non-aminoácidos essenciais	Gibco, Invitrogen	11140-035
beta-mercaptoetanol	Sigma	M7522
PBS	Gibco, Invitrogen	14190-169
DNase I	Sigma	D4527
A mitomicina C	Roche	10107409001
Factor de crescimento de fibroblasto básico	PeproTech	100-18B
Biotinilado Anti-human/mouse/rat Activina Um anticorpo	R & D Systems	BAM3381
Gelatina	Sigma	G9391
Mouse / Humano /Rat Activina A MAb	R & D Systems	MAB3381
0,05% de tripsina-EDTA	Gibco, Invitrogen	25300-054
Extra Fino tesoura de íris	FST	14088-10
Extra Fino Pinça Graefe	FST	11150-10
Pierse Pinças de fixação	FST	18155-13