Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

요약

마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency - 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.

초록

일반적으로 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs) ¹ 가변 조건 하에서 배양해 수 있습니다. 그러나 culturing위한 효과적인 시스템이 이러한 세포를 확립하는 것은 쉽지 않다. 문화 조건 hESCs과 hiPSCs의 pluripotency 수여 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 최적화 및 문화 방법의 표준화가 중요합니다.

hESC 라인의 설립이 먼저 피더 세포와 태아 소 혈청 (FBS) 함유 배지 ^2로 MEFs를 사용하여 설명되었다. 다음으로, FBS는 hESCs ^3의 증식을 향상 녹아웃 혈청 교체 (KSR)과 FGF2,로 대체되었습니다. 마지막으로, 공급기 - 무료 문화 시스템에 Matrigel 코팅 접시에 culturing 세포를 활성화 KSR-포함된 에어컨 매체 (매체가 MEFs에 의해 조건) ^4. 그 후, hESCs 문화 조건은 화학적 defin에 피더 무료 문화쪽으로 이사^5-7 에드 조건입니다. 또한, 외부의 무료 구성 요소를 사용 병원균과 동물 단백질 배양 방법에 의한 잠재적인 오염을 피하기 위해 ⁸ 설립되었습니다.

향상된 상태를 얻으려면 마우스 피더 세포는 인간 세포 라인 (예 : 태아의 근육과 피부 세포 ^9, 성인 피부 세포 ^10, 포피의 섬유아 세포 ^11-12, amniotic mesenchymal 세포 ^13)로 대체되었습니다. 그러나 인간의 포피 fibroblast 파생 피더 레이어를 사용하여 undifferentiated hESCs을 유지의 효율성은 ¹⁴ Activin의 분비의 낮은 수준으로 인해 마우스 피더 세포의 그만큼 높은 아니다. 분명히, 마우스 및 인간 피더 세포에 의한 성장 인자의 생산에 분명 차이가있다.

마우스와 인간 피더 세포 transcriptomes의 분석은지지와 비지지 세포 사이의 중요한 차이점을 공개했다. 외인성 FGF2는 maintai 데 중요hESCs과 hiPSCs의 자기 갱신을 닝과 Tgfβ1, Activin와 피더 세포의 괴물 (BMP 길항제)의 표현을 규제하는 핵심 요소로 확인되었습니다. Activin은 OCT4, SOX2 및 hESCs ^15-16의 NANOG의 표현을 유발을 보여줘왔다.

장기적인 문화의 경우 hESCs 및 hiPSCs들은 undifferentiated 상태를 유지하기 위해 mitotically inactivated MEFs이나 Matrigel - 코팅 접시에 MEF-CM (MEF-에어컨 중간)에서 피더없는 조건 하에서 재배 할 수 있습니다. 그들이 직접 hESCs의 성장에 영향을 미칠 이후 두 문화 조건의 성공은 완전히 피더 세포의 품질에 따라 달라집니다.

여기서는 마우스 배아 섬유아 세포의 격리와 문화 (MEFs)에 대한 최적화된 방법이 갖추어진 매체 (CM)과 미디어 사이를 Activin의 수준을 평가하는 효소 결합 면역 분석 (엘리사)의 준비를 제시.

프로토콜

1. 마우스 배아의 섬유아 세포의 절연 (MEFs)

다음 두 단계는 아닌 무균 조건 하에서 수행됩니다.

1. 경추 탈구하여 13 또는 14 dpc (일 이후 coitum)에서 임신한 쥐 (CF1, 할렌, 미국)를 희생.
2. 자궁 뿔을을 해부, 짧게 칼슘 ^{2 + MG이없이는} PBS를 포함 팔콘 튜브에 70% (V / V) 에탄올과 장소에 린스 ⁺ (Gibco, Invitrogen).

다음 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 수행하고 멸균 악기를 사용하고 있습니다.

3. 배양 접시에 자궁 뿔을를 삽입하고 태반과 태아의 SAC에서 각 배아를 구분합니다.
4. 머리와 붉은 장기를 해부, PBS로 씻고 깨끗한 배양 접시에있는 모든 배아를 넣습니다. 잘게 그것 피펫 것이 가능하게됩니다 때까지 멸균 면도날을 사용하여 조직을 말하다.
5. 0.05 %의 1 ML 추가 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Gibco, Invitrogen), inclu배아 당 DNase I (USB)의 딩 100 Kunitz 단위.
6. 50 ML 팔콘 튜브에 조직을 전송 37시 15 분 동안 품어 ° C. 부화의 각 5 분 후, 철저하게하고 아래로 최대 pipetting하여 세포를 떼어 놓다.
7. 신선한 MEF 매체의 1 볼륨에 대해 추가하여 트립신을 Inactivate.
   MEF 문화 매체 (부품, 미디어 500 ML을 모든 구성 요소 및 필터를 섞어) :
   450 DMEM의 ML, FBS 50 ML (10 % (V / V)), 200 MM L-글루타민 (1 / 100 (V / V)) 5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신의 5 ML (1 / 100 (V / V)).
8. 5 분, (300 XG) 저속으로 세포를 원심 분리기, 신중 따뜻한 MEF 매체에 뜨는 및 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다.
9. 플레이트 약 2 시간에 대해 0.2 % 젤라틴 (소 피부 타입 B, 시그마에서 젤라틴)로 코팅 각 T150 (TPP) 플라스크에 3-4 배아 것과 같습니다 세포의 수. 섬유아 세포 (P0, 통로 0) 젤라틴 코팅 flasks에 첨부할 수있는 기능을 가지고있는 유일한 세포입니다.
10. 이상적으로, 세포는 24 시간 후에 80-90% 지류이며,이 단계에서 P0 세포의 주요 부분은 향후 사용을 위해 냉동 있습니다.
11. P3 또는 P4까지 P0 세포의 나머지 T150 플라스크 (들)을 확장한 다음 inactivate과 모이통는 hESCs를 replate하거나 에어컨 매체 (CM)을 생산로 사용합니다.

2. 불활 성화 및 도금 MEFs (피더 셀 준비)

모든 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 이루어졌습니다.

1. 적어도 2 시간을위한 RT에서 0.2 % 젤라틴 및 부화와 코트 T150 flasks합니다.
2. mitomycin PBS에서 C (1 밀리그램 / ML)와 필터를 희석.
3. MEFs에서 미디어를 대기음 및 CA ^{2 +} MG ^{2 +없이} PBS로 씻는다.
4. 10 μg / MEFs에서 mitomycin C의 ML을 포함하는 매체의 장소 20 ML.
5. 37에서 2 시간 동안 품어 ° 매체를 포함하는 mitomycin C와 C 그리고 PBS, trypsinize, 원심 분리기 (300 XG에서 5 분)과 따뜻한 매체 resuspend 세포로 두 번 씻는다.
6. 56.000 세포 / T150 flasks의 cm ^2의 농도에서 세포와 접시를 카운트하고 다음 6 일간 CM 제작을 위해 사용합니다.

3. 에어컨 매체 (CM) 준비

모든 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 이루어졌습니다.

1. hESC 매체 (어 .. 무조건 중간) (0.5 ML / cm ^2)와 MEF 매체를 교체 56.000 세포 / ㎝ ^2의 밀도에 inactivated MEFs을 도금 후 일 4 NG / FGF2의 ML과 갓 보충.
2. 24 H 보육 후에 피더 flasks에서 CM을 모아서 4 NG / 모이통에 FGF2의 ML을 포함하는 신선한 hESC 매체를 추가하십시오.
3. 다음 6 일간이 절차를 반복합니다. 매일 저장소는 -20 ° C.에 CM을 수집
4. 육일는 중간 및 필터 (코닝, 0.22 μm의, PAS)의 모든 aliquots를 섞어 후에. -80에서 50 ML aliquots 및 매장 만들기 ° C.
5. Matrigel에서 성장 hESCs에 추가하기 전에 추가 4 NG / FGF2의 ML과 CM을 보완.

4. 에어컨 미디어를 Activin 측정 (엘리사) ¹⁵

1. 모든 샘플 및 시약 실내 온도로 와요.
2. microplate에 추가, 1 % BSA와 PBS에 (인간 \ 마우스 \ 쥐 Activin MAb, R & D 시스템) 항체를 캡처 (100 μl / 음)와 RT에서 밤새 품어 희석.
3. 24 시간은 블록 (1 % BSA / PBS 300 μl / 잘) RT에서 1 시간 동안 후 PBST (0.05 % 십대 초반 20과 PBS) (물론 300 μl /)와 우물 세 번 씻어 후.
4. 이 시간에는 Activin을 7 dilutions (30 NG / ML보다 농도 이하) 및 빈 샘플을 포함하여 (R & D 시스템) 표준 곡선, 준비합니다. Activin의 선형 작동 범위는 0.25 사이 및 32 NG / ML입니다.
5. 우물 (물론 100 μl /)를 표준 및 샘플 중복을 넣고 RT에서 2 시간 동안 알을 품다.
6. 우물 세 번 (PBST 300 μl)를 씻으십시오.
7. 보조 (biotinylated) 항체 (인간 / 마우스 / 쥐 Activin MAb, R & D 시스템을 Biotinylated) (0을 추가합니다.25 μg / ML 1% BSA / PBS) 및 RT에서 2 시간 동안 알을 품다.
8. 우물 세 번 (PBST 300 μl)를 씻으, Streptavidin-HRP를 (1 % BSA / PBS, R & D 시스템에 희석) 추가하고 RT에서 20 분 동안 품어.
9. 우물 세 번 (PBST 300 μl)를 씻으, 기판 솔루션을 100 μl (Quantikine, R & D 시스템)을 추가하고 어둠 RT에서 30 분 동안 품어.
10. 각도에 스톱 솔루션의 100 μl (Quantikine, R & D 시스템)을 추가하고 가볍게 섞는다.
11. 물론 각각의 광학 밀도를 결정하기 위해 540 또는 570 nm의 파장에서 보정과 450 nm의까지 세트 Microplate 리더 (분자 소자 스펙트럼 최대 250 글로벌 의료 계측, 주식, 미네소타),.

5. 대표 결과

분리 절차의 전반적인 체계는 그림 1에 표시됩니다. hESCs 서로 다른 조건에서 배양해 hiPSCs의 전형적인 형태는 그림 2에 표시됩니다. 의 형태 MEFs 및 CM을 준비하는 데 사용 inactivated 피더 세포는 그림 3에 표시됩니다. 일반적으로 세포는 24 시간 이후 고립 합류 및 동결하거나 확장할 준비가되어 있어야합니다. 그러나, 가끔 합류 문화를 취득하기 전에 2-3일 걸릴 수 있습니다. CM은 통로 4, 늦어도의 세포에서 준비되어야한다. 일차 전지에만 노화의 발병 전에 4-5 구절에 대한 확장시킬 수 있기 때문에 이것은 중요합니다.

시토킨, Activin는 pluripotent 세포 ¹⁴ undifferentiated 성장 지원을위한 피더 세포에 의해 분비 가장 중요한 요소로 간주됩니다. CM에를 Activin 수준의 측정은 (그림 4) MEFs의 품질을 모니터링하는 매우 편리한 정량 분석이다.

그림 1. MEFs 격리 절차의 개략도 표현.

ontent ">
그림 2. (A) 피더 세포, (B) 시설 매체 및 (C) 정의된 매체의 면전에서 배양해 undifferentiated hESCs의 전형적인 형태. (D, E) 피더 세포의 면전에서 배양해 hiPSCs의 전형적인 형태.

그림 3. 마우스 배아의 섬유아 세포의 전형적인 형태 (MEFs). () 항로 0 (P0) 도금 / 절연 이틀 후에, 56.000 세포 / ㎝의 밀도에서 (B) inactivated 피더 계층 ^2.

그림 4. 효소 결합 면역 분석 (엘리사) 기반 시설 매체 (CM) 홍보에를 Activin의 농도의 측정CF1 마우스 변형에서 파생 마우스 배아 섬유아 세포와 epared. CM는 6 일 동안 수집된 후 풀링된되었다. CM "1"과 CM "2"미디어 무조건 미디어 보시죠의 다른 일괄 처리를 참조하십시오. 에어컨 프로세스의 함수가 MEFs, Activin에 의해 매체로 분비를 Activin되면서, 음 거의 탐지가있다.

토론

여기서 제시 MEFs 절연 절차는 hESCs과 hiPSCs을위한 표준화된 문화 조건의 설립을 가능하게합니다. 또한 피더 세포에 의해 시토킨 생산을 평가하는 데 사용 엘리사 기반 시스템은 MEF-파생 에어컨 미디어의 품질에 유용한 지표입니다. 지원 섬유아 세포를 제공하는 마우스 변형 (CF1)의 정기 점검은 문화 미디어의 배치 - 투 - 배치 변화를 방지하는 데 필요합니다. 더욱이, 그것은 동시에 세포의 일관된 품질을 얻기 위해 여러 생쥐에서 배아를 분리하는 것이 좋습니다. 물론 갓 격리 MEFs는 P0과 P1에서 냉동 보관 할 수 있습니다. 또한 inactivated MEFs는 세포 배양을위한 요구 사항에 따라 적절한 양의 aliquots에서 냉동 보관 할 수 있습니다. 보통 약 250.000 세포 문화 hESCs 및 IPS 세포에 6 - 잘 접시의 한 우물로 도금한다. 설립 및 최적화 방법은 정기적으로 diffe 간의 다양성을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다실험을 임대.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM (높은 혈당)	Gibco, Invitrogen	41966-052
FBS	Biochrom	S0115
L-글루타민	Gibco, Invitrogen	25030-024
페니실린 - 스트렙토 마이신	Gibco, Invitrogen	15140-122
진공 필터 시스템	코닝	431,097	500 ML, 0.22 μm의, PAS
DMSO	시그마	D2650
마네 DMEM	Gibco, Invitrogen	10829-018
마네를 빼앗아음 교체	Gibco, Invitrogen	10828-028
비 필수 아미노산	Gibco, Invitrogen	11140-035
베타 - 메르 캅 토 에탄올	시그마	M7522
PBS	Gibco, Invitrogen	14190-169
DNase I	시그마	D4527
Mitomycin C	로슈	10107409001
기본 Fibroblast 성장 팩터	PeproTech	100-18B
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin 항체	R & D 시스템	BAM3381
젤라틴	시그마	G9391
/ 인간 / 마우스쥐 Activin MAb	R & D 시스템	MAB3381
0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	Gibco, Invitrogen	25300-054
추가 얇은 홍채 가위	FST	14088-10
엑스트라 파인 Graefe의 집게	FST	11150-10
Pierse 고정 집게	FST	18155-13