Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

Riepilogo

La qualità di fibroblasti embrionali di topo (MEF) è dettata dal ceppo destro del mouse, ad esempio CF-1. Pluripotenza-solidale MEF e mezzi condizionati (CM) ottenuti da questi dovrebbe contenere le concentrazioni ottimali di Activin A, Gremlin e Tgfβ1 necessari per la Activin / Nodale FGF e percorsi di co-operativamente mantenere il self-renewal e la pluripotenza.

Abstract

In generale, le cellule staminali embrionali umane (hESC) e umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) ¹ può essere coltivato in condizioni variabili. Tuttavia, non è facile stabilire un sistema efficace per la coltura di tali cellule. Poiché le condizioni di coltura può influenzare l'espressione del gene che conferisce la pluripotenza in hESC e hiPSCs, l'ottimizzazione e la standardizzazione del metodo di cultura è fondamentale.

La creazione di linee di hESC è stato descritto utilizzando MEF come cellule di alimentazione e siero bovino fetale ^(FBS)-2 contenente terreno di coltura. Successivamente, FBS è stato sostituito con la sostituzione knockout siero (KSR) e FGF2, che aumenta la proliferazione delle hESC ^3. Infine, l'alimentatore senza sistemi di coltura permettono alle cellule in coltura Matrigel rivestite con lastre in KSR contenente mezzo condizionato (medium condizionato dal MEF) ^4. Successivamente, condizioni di coltura hESC si sono spostati verso alimentatore privo di cultura nel definire chimicamenteEd condizioni ^5-7. Inoltre, per evitare il potenziale contaminazione da agenti patogeni e proteine ​​animali metodi di coltura utilizzando xeno-free componenti sono state stabilite ^8.

Per ottenere migliori condizioni cellule di alimentazione di topo sono stati sostituiti con linee cellulari umane (ad esempio muscolari fetale e ⁹ cellule della pelle, cellule adulte ^10, fibroblasti prepuzio ^11-12, amniotico cellule mesenchimali ^13). Tuttavia, l'efficienza di mantenere hESC indifferenziate utilizzando prepuzio fibroblasti umani di derivazione strati di alimentazione non è così elevata come quella di cellule feeder topo a causa del basso livello di secrezione di Activin A ^14. Ovviamente, vi è una differenza evidente nella produzione di fattore di crescita di topo e cellule feeder umane.

L'analisi dei trascrittomi di topo e cellule di alimentazione umana ha rivelato differenze significative tra le cellule di sostegno e non di sostegno. Esogena FGF2 è fondamentale per eseguire manutenzioneNing auto-rinnovamento delle hESC e hiPSCs, ed è stato identificato come un fattore chiave regolando l'espressione di Tgfβ1, Activin A e Gremlin (un antagonista BMP) nelle cellule di alimentazione. Activin A ha mostrato di indurre l'espressione di OCT4, SOX2, e Nanog in hESC ^15-16.

Per lungo termine cultura, hESC e hiPSCs possono essere coltivate su mitoticamente inattivato MEF o sotto alimentatore senza condizioni MEF-CM (MEF condizionata Medium) su Matrigel rivestite con lastre di mantenere il loro stato indifferenziato. Il successo di entrambe le condizioni di coltura dipende completamente la qualità delle cellule di alimentazione, poiché influenza direttamente la crescita delle hESC.

Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per l'isolamento e la coltura di fibroblasti embrionali di topo (MEF), preparazione del terreno condizionato (CM) e enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) per valutare i livelli di Activin A all'interno dei media.

Protocollo

1. Isolamento dei fibroblasti embrionali del mouse (MEF)

Le seguenti due fasi vengono eseguite sotto condizioni non asettiche.

1. Sacrifica un topo in stato di gravidanza (CF1, Harlan, USA) a 13 o 14 DPC (giorni post-coitum) per dislocazione cervicale.
2. Dissect le corna uterini, sciacquare brevemente nel 70% (v / v) etanolo e posto in una provetta Falcon contenente PBS senza Ca ^{2 +} Mg ^{2 +} (Gibco, Invitrogen).

Le seguenti operazioni sono eseguite in una cappa coltura tissutale in condizioni asettiche e utilizzando strumenti sterili.

3. Mettere le corna uterine in una capsula Petri e separare ogni embrione dalla sua placenta e il sacco embrionale.
4. Staccare testa e gli organi rosse, lavare in PBS e mettere tutti gli embrioni in un piatto pulito Petri. Tritare finemente il tessuto usando una lama di rasoio sterile fino diventa possibile pipettare.
5. Aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina / EDTA (Gibco, Invitrogen), including 100 unità Kunitz di DNasi I (USB), per embrione.
6. Trasferire il tessuto in una provetta Falcon da 50 ml e incubare per 15 min a 37 ° C. Dopo ogni 5 minuti di incubazione, le cellule dissociare pipettando su e giù accuratamente.
7. Inattivare la tripsina aggiungendo circa 1 volume di terreno MEF appena preparato.
   MEF terreno di coltura (componenti per fare 500 ml di media, mescolare tutti i componenti e filtro):
   450 ml di DMEM, 50 ml di FBS (10% (v / v)), 5 ml di 200 mM L-glutammina (1/100 (v / v)), 5 ml di penicillina-streptomicina (1/100 (v / v)).
8. Centrifugare le cellule con bassa velocità (300 xg), 5 min, rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in media MEF caldo.
9. Tavola circa un numero di celle che è equivalente a 3-4 embrioni in ciascun (TPP) pallone T150 rivestiti con 0,2% di gelatina (gelatina di pelle bovina, tipo B, Sigma) per 2 h. I fibroblasti (P0, il passaggio 0) sono le uniche cellule che hanno la possibilità di allegare alla gelatina rivestite fiaschi.
10. Idealmente, le cellule sono confluenti 80-90% dopo 24 ore e in questa fase una parte importante del P0 cellule viene congelato per uso futuro.
11. Espandere il restante T150 pallone (s) di P0 cellule fino P3 o P4, e quindi inattivare usare come alimentatori per replate hESC o per produrre mezzo condizionato (CM).

2. Inattivazione e placcatura MEF (Feeder Preparazione Cells)

Tutte le fasi sono eseguite in una cappa coltura tissutale in condizioni asettiche.

1. Cappotto T150 palloni con il 0,2% di gelatina ed incubare a temperatura ambiente per almeno 2 ore.
2. Diluire mitomicina C in PBS (1 mg / ml) e filtrare.
3. Aspirare media da MEF e lavare con PBS senza Ca ^{2 +} Mg ^{2 +.}
4. Trasferire 20 ml di mezzo contenente 10 ug / ml di mitomicina C il MEF.
5. Incubare per 2 ore a 37 ° C con mitomicina C contenente il mezzo poi lavate due volte con PBS, Tripsinizzare, centrifuga (per 5 minuti a 300 xg) e risospendere le cellule in mezzo caldo.
6. Contare le cellule e la piastra ad una densità di 56.000 cellule / cm ² in fiasche T150 e di utilizzare per la produzione CM per i successivi 6 giorni.

3. Condizionata Medium (CM) Preparazione

Tutte le fasi sono eseguite in una cappa coltura tissutale in condizioni asettiche.

1. Il giorno dopo la piastratura inattivato MEF ad una densità di 56.000 cellule / cm ² sostituire il mezzo MEF con il mezzo hESC (UM, media incondizionata) (0,5 ml / cm ²⁾ appena completato con 4 ng / ml di FGF2.
2. Raccogliere CM da beute alimentazione dopo 24 h di incubazione e aggiungere mezzo fresco contenente hESC 4 ng / ml di FGF2 agli alimentatori.
3. Ripetere questa procedura per i prossimi 6 giorni. Ogni negozio raccolti CM giorni a -20 ° C.
4. Dopo 6 giorni mescolare tutte le aliquote di medio e filtro (Corning, 0,22 micron, PAS). Effettuare aliquote di 50 ml e conservare a -80 ° C.
5. Supplemento CM con ulteriori 4 ng / ml di FGF2 prima di aggiungere al hESC coltivate Matrigel.

4. Misura di Activin A in Media condizionata (ELISA) ¹⁵

1. Portare tutti i campioni e reagenti a temperatura ambiente.
2. Diluire la cattura anticorpale (Human \ Mouse \ Rat activina A MAB, R & D Systems) in PBS con 1% BSA, aggiungere alla micropiastra (100 pl / pozzetto) ed incubare una notte a temperatura ambiente.
3. Dopo 24 ore lavare i pozzetti tre volte con PBST (PBS con 0,05% Tween 20) (300 pl / pozzetto), allora blocco (1% BSA / PBS, 300 pl / pozzetto) per 1 ora a RT.
4. In questo tempo preparare una Activin A (R & D Systems) curva standard, tra cui 7 diluizioni (concentrazione inferiore a 30 ng / ml) e il campione in bianco. Il campo lineare di lavoro del Activin A è tra 0,25 e 32 ng / ml.
5. Aggiungi duplicati degli standard e dei campioni ai pozzetti (100 pl / pozzetto) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
6. Lavare tre volte (300 ml di PBST) pozzi.
7. Aggiungere il secondario (biotinilato) anticorpi (Human / Mouse / Rat Biotinylated Activin A MAb, R & D Systems) (0.25 ug / ml in 1% BSA / PBS) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
8. Lavare tre volte (300 ml di PBST) pozzi, aggiungere streptavidina-HRP (diluita in 1% BSA / PBS, R & D Systems) e incubare per 20 minuti a RT.
9. Lavare tre volte (300 ml di PBST) pozzetti, aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato (Quantikine, R & D Systems) e incubare per 30 min a RT al buio.
10. Aggiungere 100 ml di soluzione di arresto (Quantikine, R & D Systems) in ciascun pozzetto e mescolare delicatamente.
11. Set Lettore di micropiastre (Molecular Devices Spectra Max 250, Global Medical Instrumentation, Inc., Minnesota) a 450 nm, con correzione lunghezza d'onda a 540 o 570 nm, per determinare la densità ottica di ciascun pozzetto.

5. Risultati rappresentativi

Lo schema generale della procedura di isolamento è presentato in Figura 1. La morfologia tipica delle hESC hiPSCs e coltivate in condizioni differenti è presentata in Figura 2. La morfologia dei MEF e cellule feeder inattivate usati per preparare CM è presentato nella Figura 3. In generale, le celle devono essere confluenti 24 ore dopo l'isolamento e pronti per essere congelati o espanso. Tuttavia, a volte potrebbe richiedere 2-3 giorni prima di ottenere colture confluenti. Il CM deve essere preparato dalle cellule al passaggio 4 e non dopo. Questo è fondamentale perché le cellule primarie può essere ampliato per 4-5 passaggi prima dell'inizio della senescenza.

La citochina, Activin A, è considerato il principale fattore critico secreto dalle cellule di alimentazione per il sostegno di crescita indifferenziata di cellule pluripotenti ^14. La misurazione del livello di Activin A in CM (figura 4) è un saggio quantitativo molto conveniente per monitorare la qualità di MEF.

Figura 1. Una rappresentazione schematica della procedura di isolamento MEF.

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Figura 2. La morfologia tipica delle hESC indifferenziati coltivate in presenza di (A), le cellule di alimentazione (B) mezzo condizionato e media (C) definita. La morfologia tipica di hiPSCs coltivate in presenza di (D, E) cellule di alimentazione.

Figura 3. La morfologia tipica di fibroblasti embrionali di topo (MEF). (A) Passaggio 0 (P0) due giorni dopo placcatura / isolamento, (B) inattivato strato alimentatore ad una densità di 56.000 cellule / cm ^2.

Figura 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) a base di misurazioni della concentrazione di Activin A in mezzo condizionato (CM) prepared con fibroblasti embrionali di topo derivate dal ceppo di topi CF1. CM è stato raccolto per 6 giorni e poi sommati. CM "1" e CM "2" si riferiscono a diversi lotti di media e di messaggistica unificata ai media incondizionati. Poiché la funzione del processo di condizionamento viene Activin A secrezione nel mezzo di MEF, Activin Un quasi impercettibile a UM.

Discussione

La procedura di isolamento MEF qui presentata consente la creazione di una condizione di cultura standardizzata per le hESC e hiPSCs. Inoltre il sistema ELISA basato utilizzato per valutare la produzione di citochine da cellule di alimentazione è un utile indicatore della qualità dei mezzi condizionati MEF-derivati. La manutenzione ordinaria del ceppo di topo (CF1) fornendo fibroblasti supporto è necessaria per evitare lotto a lotto variazione di terreni di coltura. Inoltre, si raccomanda di isolare embrioni di topo contemporaneamente per ottenere una qualità costante di cellule. Certo, appena isolato MEF può essere mantenuto congelato a P0 e P1. Inoltre inattivati ​​MEF può essere conservato congelato in aliquote di quantità appropriate a seconda delle esigenze per colture cellulari. Di solito circa 250.000 cellule devono essere seminati in un singolo pozzo di una piastra da 6 pozzetti di hESC cultura e le cellule iPS. Il metodo consolidato e ottimizzato può essere utilizzato di routine per ridurre la variabilità tra diffeaffitto esperimenti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
DMEM (glucosio)	Gibco, Invitrogen	41966-052
FBS	Biochrom	S0115
L-glutammina	Gibco, Invitrogen	25030-024
Penicillina-streptomicina	Gibco, Invitrogen	15140-122
Sistema di aspirazione del filtro	Corning	431097	500 ml, 0,22 micron, PAS
DMSO	Sigma	D2650
Knockout DMEM	Gibco, Invitrogen	10829-018
Knockout Serum sostituzione	Gibco, Invitrogen	10828-028
Aminoacidi non essenziali	Gibco, Invitrogen	11140-035
beta-mercaptoetanolo	Sigma	M7522
PBS	Gibco, Invitrogen	14190-169
DNasi I	Sigma	D4527
Mitomicina C	Roche	10107409001
Base Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B
Biotinilato Anti-human/mouse/rat Activin Un anticorpo	R & D Systems	BAM3381
Gelatina	Sigma	G9391
Umano / Mouse /Rat Activin A MAb	R & D Systems	MAB3381
0,05% tripsina-EDTA	Gibco, Invitrogen	25300-054
Extra Scissors Iris sottili	FST	14088-10
Extra Pinza Graefe Belle	FST	11150-10
Pinza di fissaggio Pierse	FST	18155-13