Simultânea de pré e pós-sináptica gravação eletrofisiológico de<em&gt; Xenopus</em&gt; Nervo músculo-Co-culturas

Resumo

Este vídeo demonstra os procedimentos usados ​​para crescer culturas primárias de embrião Xenopus Células nervosas e musculares ea utilidade desta preparação para fazer gravações simultâneas de fixação pré-e pós-sináptica patch.

Resumo

Muita informação sobre o acoplamento de pré-sinápticas correntes iônicas com a liberação do neurotransmissor foi obtida a partir de preparações de invertebrados, principalmente a lula gigante sinapse ^1. No entanto, excepto para a preparação aqui descritos, as preparações de vertebrados existem poucos em que é possível fazer medições simultâneas de libertação de neurotransmissores e pré-sinápticos correntes iónicas. Motoneurónios embrionários de Xenopus e células musculares podem ser cultivadas juntas no meio de cultura simples à temperatura ambiente, eles vão formar sinapses funcionais dentro de 12-24 horas, e pode ser utilizado para estudar o desenvolvimento do nervo e células de músculo e as interações sinápticas durante vários dias (até supercrescimento ocorre). Algumas vantagens de estas co-culturas mais preparações vertebrados outros incluem a simplicidade da preparação, a capacidade de manter as culturas e de trabalho à temperatura ambiente, e a pronta acessibilidade das sinapses formadas ^duas-4. A preparação tem sido amplamente utilizada para estudar as propriedades biofísicas de canais de íons pré-sinápticas e à regulação da liberação do transmissor ^5-8. Além disso, a preparação prestou-se a outras utilizações, incluindo o estudo de crescimento de neurites e sinaptogênese ^9-12, os mecanismos moleculares da libertação do neurotransmissor ^13-15, o papel de mensageiros difusíveis em neuromodulação ^16,17, in vitro e plasticidade sináptica ^{18 - 19.}

Protocolo

1. Pré-experimental Preparação

1. Preparar as seguintes soluções (ver Tabela 1 para as composições): (a) 1 NFR litro (Ringer-rã normal), (b) 100 ml de solução salina a 10%, (c) 100 ml CMF (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} solução livre ), (d) 1 ml ITS (insulina-transferrina-selênio, Sigma I1884), (e) 100 ml de meio L-15 de cultura, (f) 10 mL de HCG (gonadotropina coriónica humana Sigma CG-10), (g) 100 ml de K ^+-solução interna, (h) 100 ml de K ^+-solução interna para a anfotericina B. A força osmótica de uma solução deve ser verificado para assegurar que é de aproximadamente 260 mOsM utilizando um osmómetro de pressão de vapor (por exemplo, modelo Wescor # 5100C) .
2. Filtrar esterilizar soluções (b) e (c). Soluções (a) (b) e (c) pode ser armazenado até três meses, a 4 ° C. Preparar a solução de (d) por adição de 1 ml _de H2O desionizada ao frasco que contém o pó liofilizado por meio de uma agulha de seringa de calibre 25 e seringa de filtro. Esta solução final cum ser armazenado a 4 ° C durante 30 dias.
3. Preparar a solução de (e) numa câmara de fluxo laminar através da combinação de todos os componentes num recipiente ou frasco. Filtrar esterilizar a solução final e transferir alíquotas de 10 ml para tubos de centrífuga estéreis. Armazenar a -20 ° C.
4. Prepare o (solução (f)) HCG pela adição de 10 ml de H ₂ 0 desionizada ao frasco que contém o pó liofilizado por meio de uma agulha de seringa de calibre 25 e seringa de filtro. Esta solução final pode ser armazenado a 4 ° C durante 30 dias.
5. Fabricar, pelo menos, duas ferramentas de microdissecção colando um pino Minutien (26002-10, Science Tools finas) à extremidade de uma pipeta de Pasteur de vidro com cola de cianoacrilato. Permitir que a extremidade afiada do pino para estender para além da extremidade da pipeta de aproximadamente 0,5 cm.
6. Dois dias antes de preparar culturas, induzir procriação com o seguinte procedimento. Identificar um par de reprodução-pronto de Xenopus, observando uma cloaca, proeminente avermelhada na pigmentação feminino e escuro no su planarrface das patas dianteiras do sexo masculino. Um de um sapo tempo, cada rede e mantê-lo lado ventral para baixo em uma pia com a rede de modo a que não pode fugir. Injectar 1 mL de uma solução de (f) por meio da um líquido e por via subcutânea em dos sacos linfáticos dorsal.
7. Coloque o par reprodutor em conjunto num tanque de galão de água coberta 10. Para assegurar que os animais não pisar os ovos fertilizados e recém-estabelecidas, instalar um piso blindado com um tamanho de malha de cerca de ½ "montados aproximadamente 1-2 polegadas acima do fundo do tanque (Figura 1A).
8. Deixe rãs não perturbadas por 12-48 horas até que os animais estão em amplexo e ovos fertilizados são observados no andar de baixo da tela (Figura 1B).
9. Retire os animais do tanque, mas deixar os ovos em repouso por pelo menos 24 horas por mais tempo. Este par de rãs pode ser re-produzido após seis semanas.
10. Soltar os embriões a partir do fundo do tanque, e transferi-los para quatro ou cinco cult 60x15 milímetrosure pratos contendo solução salina a 10% (solução b). Classificar os embriões por estágio de acordo com o esquema de Niewkoop e Faber (ref. 20). Embriões úteis serão as que estão em fase de 22-24. Figura 2A mostra um embrião em fase de cerca de 22, enquanto a Figura 2B mostra um embrião que está demasiado longe ao longo do desenvolvimento para ser útil (cerca de fase 28). É importante escolher os embriões que são saudáveis: aqueles que são suaves na aparência com manchas castanho claro e branco são ideais. Embriões que têm grandes manchas pretas ou brancas são geralmente insalubre e inutilizável.

2. Microdissecação de embriões de Xenopus

1. Dentro de um fluxo laminar etiqueta capuz, e encher até meio aproximadamente três 60x15 milímetros placas de cultura estéreis com solução salina a 10%, e um com CMF.
2. Usando uma solução estéril, de vidro Pasteur pipeta de transferência de fase 5-10 22-24 embriões em uma das placas contendo solução salina a 10%. Com o auxílio de um zoom estéreo dissecaring microscópio dentro do capô (0,6-5x com 10 x oculares), remova a camada de geléia e membrana vitelina de cada embrião usando dois pares de estéreis # 5 fórceps (11251-30, ferramentas Ciência Belas). (Veja Figuras 3A e 3B).
3. Lavar os embriões nus, passando-os, um de cada vez, através dos restantes dois pratos de solução salina a 10% e, finalmente, para o prato contendo CMF. Usar uma pipeta nova estéril para cada transferência e minimizar o volume de solução transferida de prato para prato.
4. Por sua vez, cada embrião segurar suave mas firmemente, com um par de pinças e, utilizando-se a ferramenta de microdissecção formado no passo 1.5, remover o tubo neural e myotomes associados que estão localizados na parte mais dorsal do animal. Fazer isso através de três fatias, uma em cada extremidade da localização do tubo neural e um terceiro apenas ventral a ele (Figura 4A). Mover cada tubo neural dissecado / myotome a uma parte limpa do prato para longe da granul gemaes e outros detritos (Figura 4B). O eixo dorsal-ventral, e os locais do tubo neural e myotomes são indicados na Figura 4.
5. Após cerca de 15 minutos nesta solução (CMF) fórceps usar para levantar a pele pigmentada livre do tecido dissecado e descartar. Após um adicional de 30-60 minutos, as células formarão uma "pilha de areia", como eles estão dissociados um do outro (Figura 4C).

3. Preparação do nervo músculo-Co-culturas

1. Descongelar um tubo de 10 ml de meio de cultura e adicionar assepticamente 70 uL ITS e 35 ng / ml de BDNF (Sigma B3795).
2. Rótulo e preencher estéreis 35 pratos de cultura (milímetros FD35-100 Precision Instruments Mundo) aproximadamente a meio L-15 com meio de cultura (solução (e)), um para cada embrião dissecados.
3. Fabricar uma pipeta de chapeamento, segurando cada ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro, mantendo a porção afunilada mais de uma chama. Puxe as pontas para além de cerca de 10 cm e, em seguida, se separam ao fim de produzir uma ponta de cerca de 0,2 mm.
4. Utilizar a pipeta de chapeamento para sugar a "pilha de areia" a partir de um embrião de minimizar a quantidade de solução desenhada. Expulsar as células na parte inferior de um prato de cultura. Placa de células em várias linhas. Observar banhados células indiferenciadas (Figura 5A e 5B).
5. Deixe os pratos de células plaqueadas não perturbadas por pelo menos quinze minutos para permitir que o tempo de células para anexar ao prato.

4. Patch clamping nervo-músculo Sinapses

1. Após 12-24 h em cultura, as células banhados a assumir características morfológicas distintas: as células musculares se tornam fusiforme e neurônios espinhais ampliar os processos longos (Figura 6). Contato sináptico funcional entre varicosidades neurite e células musculares pode ser confirmado com simultâneas emparelhados registros eletrofisiológicos. "M", "S" e "V" referem-se, respectivamente, à célula muscular, neuronalsoma e varicosidades pré-sináptica.
2. Preparar dois eléctrodos de patch para gravação: uma para o varicosidade pré-sináptica e um para as células musculares.
3. Para o eléctrodo de pré-sináptica, preparar uma solução de anfotericina contendo o seguinte: Adicionam-se 100 ul de DMSO para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, contendo 5 mg de anfotericina B (Sigma A4888). Vortex esta solução durante 10 seg. Em seguida, adicionam-se 10 ul desta solução para um tubo de microcentrífuga de segundo que contém 625 ul de K ^+-interno solução de anfotericina B (solução (h)). Vortex como acima.
4. Encher o eléctrodo de pré-sináptica com o K ⁺ contendo anfotericina-interno solução preparada no passo 4.3 e o eléctrodo de pós-sináptica com K ^+-interno solução (solução de (g)).
5. Substituir a mídia na placa de cultura com NFR e realocá-lo em um microscópio invertido equipado com óptica de contraste de fase.
6. Posicione os dois eléctrodos apenas acima de suas respectivas metas. Obter o co de células inteirasnfiguration com o eletrodo de célula muscular antes da configuração de patch perfurada com o eletrodo varicosidades.
7. Para confirmar a funcionalidade da sinapse, despolarizar a varicosidade com um amplificador de patch clamp (Axopatch 200B, por exemplo, Molecular Devices), sob o controlo de software (por exemplo, por pCLAMP 9, Molecular Devices) e observar as correntes simultâneas pré-sinápticos e pós-sinápticos. Figura 7 mostra as correntes vistos em resposta aos passos de despolarização de tensão dadas ao varicosidade pré-sináptica em incrementos de 10 mV a partir de -30 mV a +40 mV. As correntes para dentro visto na célula pré-sináptica são transportados por Na ⁺ e Ca ^{2 +} e as correntes exteriores por K ^+. Correntes gravados na célula pós-sináptica são respostas a neurotransmissor libertado do varicosidades e são realizados principalmente por meio de canais de Na ⁺ dos receptores nicotínicos da acetilcolina.

Resultados

A Figura 4B mostra a vista dorsal de um espinal medula isolado / myotome imediatamente após a sua remoção a partir de uma fase de 22 embriões de Xenopus 4C. Figura mostra que, após a solução de remoção da pele e incubação em ^{+-Mg 2 +} solução livre de Ca ² (CMF, ( c)), as células de dissociar-se em um "monte de areia" e está pronto para revestimento. Imediatamente após o plaqueamento em meio de cultura de células apresentam pouca variabilidade morfológica (Figura 5B), mas assumem formas distintas, depois de vinte e quatro horas de cultura. As células musculares se fusiforme enquanto os neurônios permanecem esférico enquanto neurites estendendo que varicosites elaborados em sinapses com as células musculares (Figura 6). Gravação simultânea remendo emparelhado na varicosidade pré-sináptica e pós-sináptica da célula muscular (Figura 7) mostra as correntes de entrada e de saída pré-sinápticos associadas com a libertação de neurotransmissores e o resultant excitatórios correntes pós-sinápticos.

Figura 1 A:.. Par Criação de rãs em balde de acasalamento sobre tela B: Rãs em amplexo com ovos fertilizados.

Figura 2 A:. Fase B "adequado" 22 embrião:. Palco "inadequado" 28 embrião. Barra de escala representa 1 mm.

Figura 3 A:. Stage 22 embrião antes da remoção da membrana vitelina e casaco geléia. A seta aponta para o bordo exterior do revestimento de gelatina. A membrana vitelina adere estreitamente à embryo e é praticamente invisível B:. embrião Bare. Barra de escala representa 1 mm.

Figura 4 A: embrião Stage 22 com uma linha a tracejado indica a-ser dissecado porção B:.. Agudamente isolado porção dorsal de embriões, "d" e "v" referem-se aos aspectos dorsal e ventral dos embriões, enquanto que "m" e "n" indica as localizações aproximadas dos mytomes e tubo neural C:. "pilha de areia" de células após 60 min em CMF. Barra de escala representa 1 mm para uma e 0,5 mm para B e C.

Figura 5 A:. Vista poder 5x de células em cultura, imediatamente após o plaqueamento. B: mesma cultura em 40x. Escalabarra representa 40 mm para A e 5 mm para B.

Figura 6. Junção neuromuscular em cultura com identificação de soma neuronal (S), varicosidade pré-sináptico (V), e células do músculo pós-sináptico (M). Barra de escala: 5 m.

Figura 7. Pré-sináptica (em cima) e pós-sináptico (inferior) correntes observados em resposta à aplicação de voltagem 10 mV passos incrementais apresentado ao varicosidade pré-sináptica de -30 mV a +40 mV. Degraus de tensão são indicados junto a alguns dos vestígios pré-sinápticos. O potencial de retenção para ambas as células foi de -70 mV.

Discussão

Principais passos para o sucesso co-culturas de neurónios motores e as células musculares são a utilização de forma adequada encenado embriões produzidos a partir da reprodução induzida de rãs Xenopus, e a dissecção cuidadosa asséptico dos neurónios espinais indiferenciadas e mioblastos. Ovos fertilizados deve ser deixado em repouso até alcançarem aproximadamente estágio 10 ou assim como movê-los mais cedo, muitas vezes interrompe o seu desenvolvimento. Embriões saudáveis ​​são identificados por uma aparência suave e uma coloração marrom e branco manchado. Fase 22-24 embriões são os mais úteis porque este é o momento durante o desenvolvimento apenas após o encerramento do tubo neural e antes que os miócitos foram diferenciadas de forma significativa. Além disso, as células de embriões mais velhos deixam de dissociar bem em CMF. Devem ser tomados cuidados durante a remoção da membrana vitelina em que adere fortemente ao embrião. A membrana deve ser rasgada com pinças cortantes, para que o embrião emerge intacta. Outra importante precaution é cuidadosamente colocar as células na parte inferior da placa de cultura (em vez de deixá-los resolver lá). Este método é preferível, pois isso aumenta a probabilidade de que as células aderem à placa de cultura.

Neurotransmissão funcional entre nervo e músculo pode ser determinada com a gravação, pós-sináptica e muitas vezes pode ser determinado pela observação da contração muscular espontânea após inervação. Células não-musculares inervados não se contorcer na cultura. Gravação pós-sináptica só é útil para gravar correntes de placa terminal em miniatura ou potenciais, mas as medidas de liberação evocado exige estimulação pré-sináptica, e correlação de correntes de pré e pós-sináptica requer o dobro de patch-clamp.

Para além do método de gravação de patch-emparelhado aqui descrito, esta preparação oferece a oportunidade de introduzir uma pipeta terceiro na soma neuronal ⁵ Isto permite a geração de um potencial de acção that pode propagar para o varicosidades pré-sináptico e levar à liberação do neurotransmissor. Além disso, os agentes putativos que se pensa mediar ou modular a transmissão sináptica pode ser introduzido a um ou outro lado da sinapse: via pipeta de células musculares ou por meio de difusão a partir de uma pipeta de terceiro colocado na soma.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipamentos / Suprimentos	Vendedor	Catálogo / Número modelo
A insulina-transferrina-selênio	Sigma	I1884
Gonadotrofina Coriônica Humana	Sigma	CG-10
Vapor Pressure Osmometer	Wescor	5100C
Pinos Minutien	Belas Science Tools	26002-10
A anfotericina B	Sigma	A4888
Fórceps	Belas Science Tools	11251-30
			Nome da solução Receita (A) NFR (Ringer-rã normal (em mM) 116 NaCl, KCl 2, 1,8 de CaCl2, 5 de Na +-HEPES, pH 7.35. (B) 10% de solução salina 10 ml NFR 90 ml de H2O desionizada (C) CMF (Ca 2 + / Mg 2 + solução gratuita) 125 NaCl, KCl 2, 1,2 de EDTA, 5 de Na + HEPES, pH 7.35. (E) Media L-15 Cultura 50 ml de L-15 mídia (Sigma L1518) + 50 ml NFR. (G) K +-solução interna (em mM) 116 KCl, 1 de NaCl, 1 de MgCl2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 (H) K +-interno solução de anfotericina B (em mM) 52 K 2 SO 4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3