Simultanea di pre-e post-sinaptica registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Xenopus</em&gt; Nervo-muscolo Co-colture

Riepilogo

Questo video mostra le procedure utilizzate per coltivare colture primarie di embrionale Xenopus Cellule nervose e muscolari e l'utilità di questo preparato per la realizzazione simultanea di pre-e post-sinaptica registrazioni patch clamp.

Abstract

Molte informazioni circa l'accoppiamento di presinaptici correnti ioniche, con il rilascio di neurotrasmettitore è stato ottenuto da preparati invertebrati, in particolare il calamaro gigante sinapsi ^1. Tuttavia, fatta eccezione per la preparazione descritto qui, preparazioni vertebrati esistono pochi in cui è possibile effettuare misure simultanee di rilascio di neurotrasmettitore e presinaptici correnti ioniche. Embrionali motoneuroni Xenopus e cellule muscolari possono essere coltivate insieme in mezzo di coltura semplice a temperatura ambiente; formeranno sinapsi funzionali entro 12-24 ore, e può essere usato per studiare nervo e lo sviluppo delle cellule muscolari e interazioni sinaptiche per diversi giorni (fino crescita eccessiva si verifica). Alcuni vantaggi di questi co-colture oltre preparazioni vertebrati comprendono la semplicità di preparazione, la capacità di mantenere le culture e lavorare a temperatura ambiente, e la pronta accessibilità delle sinapsi formate ²-4. Il preparato è stato ampiamente utilizzato per studiare le proprietà biofisiche dei canali ionici presinaptici e la regolamentazione di rilascio del trasmettitore ^5-8. Inoltre, la preparazione si è prestata ad altri usi compresi lo studio dei neuriti e sinaptogenesi ^9-12, meccanismi molecolari di neurotrasmettitore rilascio ^13-15, il ruolo di messaggeri diffusibili in neuromodulazione ^16,17, e nella plasticità sinaptica vitro ^{18 - 19.}

Protocollo

1. Pre-sperimentale Preparazione

1. Preparare le seguenti soluzioni (cfr. tabella 1 per le composizioni): (a) 1 NFR litro (Ringer Rana normale), (b) soluzione fisiologica 100 ml al 10%, (c) 100 ml di CMF (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} soluzione senza ), (d) 1 ml ITS (Insulin-transferrina-selenio, Sigma I1884), (e) 100 ml di mezzo L-15 cultura, (f) 10 ml HCG (gonadotropina corionica umana Sigma CG-10), (g) 100 ml K ^+-soluzione interna, (h) 100 ml K ^+-interna soluzione Amfotericina B. La forza osmotica della soluzione 1 dovrebbe essere controllata per assicurarsi che esso è di circa 260 mOsm osmometro utilizzando una pressione di vapore (ad esempio modello Wescor # 5100C) .
2. Filtrare sterilizzare soluzioni (b) e (c). Soluzioni (a) (b) e (c) possono essere memorizzati fino a tre mesi a 4 ° C. Preparare la soluzione (d) aggiungendo 1 ml H ₂ O deionizzata al flaconcino contenente la polvere liofilizzata attraverso un ago calibro 25 e filtro siringa siringa. Questa soluzione finale cun essere conservato a 4 ° C per 30 giorni.
3. Preparare la soluzione (e) in una cappa a flusso laminare combinando tutti i componenti in un becher o beuta. Filtrare sterilizzare la soluzione finale e trasferire aliquote da 10 ml in provette per centrifuga sterili. Conservare a -20 ° C.
4. Preparare la HCG (soluzione (f)) aggiungendo 10 ml H ₂ 0 deionizzata al flaconcino contenente la polvere liofilizzata attraverso un ago calibro 25 e filtro siringa siringa. Questa soluzione finale può essere conservato a 4 ° C per 30 giorni.
5. Realizzare almeno due utensili microdissezione incollando un perno Minutien (26.002-10, Science Tools Belle) alla fine di una pipetta Pasteur di vetro con colla di cianoacrilato. Consentire la punta del perno di estendere oltre la fine della pipetta circa 0,5 cm.
6. Due giorni prima la preparazione culture, indurre l'allevamento con la seguente procedura. Identificare un allevamento-ready paio di Xenopus osservando un importante, cloaca rossastro sulla pigmentazione scura femminile e sul do planarerfaccia delle zampe anteriori del maschio. Uno alla, tempo netto ogni rana e tenerlo lato ventrale verso il basso su un lavandino con la rete in modo che non può sfuggire. Iniettare 1 ml di soluzione di (f) attraverso la rete e per via sottocutanea in una delle sacche linfatici dorsali.
7. Posizionare la coppia di riproduttori insieme in una coperta dieci galloni di acqua. Per garantire che gli animali non possano calpestare le uova di recente e di cui fecondato, installare un pavimento schermato con maglie di dimensioni pari a circa ½ "montati circa 1-2 centimetri sopra il fondo del serbatoio (Figura 1A).
8. Lasciare inalterate le rane per 12-48 ore fino a quando gli animali sono in amplexus e uova fecondate si osservano al piano di sotto dello schermo (Figura 1B).
9. Rimuovere gli animali dal serbatoio, ma lasciare le uova indisturbati per almeno 24 ore più a lungo. Questa coppia di rane possono essere fatte fecondare dopo sei settimane.
10. Allentare gli embrioni dal fondo del serbatoio e trasferirli a quattro o cinque millimetri culto 60x15piatti ure contenenti 10% salina (soluzione B). Ordina gli embrioni per fase secondo lo schema di Niewkoop e Faber (rif. 20). Embrioni utili saranno quelli in fase di 22-24. Figura 2A mostra un embrione allo stadio di circa 22 mentre 2B figura mostra un embrione che è troppo avanti in fase di sviluppo per essere utile (circa fase 28). E 'importante scegliere gli embrioni che sono sani: quelli che sono lisce in apparenza con chiazze marrone chiaro e bianco sono l'ideale. Gli embrioni che hanno grandi macchie nere o bianche sono generalmente malsana e inutilizzabile.

2. Microdissezione di embrioni di Xenopus

1. All'interno di una cappa a flusso laminare, etichetta e riempire a metà strada circa tre piastre di coltura sterile 60x15 mm con 10% di soluzione salina, e uno con CMF.
2. Utilizzando una sterile, vetro trasferimento pipetta Pasteur 5-10 22-24 embrioni in stadio uno dei piatti contenenti 10% di soluzione salina. Con l'aiuto di uno zoom stereo sezionaremicroscopio zione all'interno della cappa (0,6-5x con oculari 10 x), rimuovere lo strato di gelatina e la membrana vitellina da ciascun embrione con due coppie di pinze sterili N ° 5 (11251-30, strumenti per le scienze Arti). (Vedi Figure 3A e 3B).
3. Lavare gli embrioni nudi facendoli passare, uno alla volta, attraverso i rimanenti due piatti di 10% soluzione salina ed infine nel piatto contenente CMF. Utilizza una nuova pipetta sterile per ogni trasferimento e ridurre al minimo il volume della soluzione è trasferito da piatto a piatto.
4. A sua volta, ciascun embrione tenere saldamente ma delicatamente con una pinza e, utilizzando lo strumento microdissezione modellato nel passo 1,5, rimuovere il tubo neurale e myotomes associati che si trovano al aspetto più dorsale dell'animale. Farlo facendo tre sezioni, una a ciascuna estremità del percorso del tubo neurale e un terzo solo ventrale ad esso (Figura 4A). Spostare ogni tubo neurale sezionato / myotome ad una parte pulita del piatto dal Granul tuorloES e altri detriti (Figura 4B). Il dorso-ventrale asse, e le posizioni del tubo neurale e myotomes sono indicati in figura 4.
5. Dopo circa quindici minuti in questa soluzione (CMF) pinze uso per sollevare la pelle pigmentata libera del tessuto sezionato e scartare. Dopo un ulteriore 30-60 min, le cellule formano un "mucchio di sabbia" come si dissociano uno dall'altro (Figura 4C).

3. Preparazione del nervo-muscolo co-colture

1. Scongelare una provetta da 10 ml di terreno di coltura e in asepsi aggiungere 70 microlitri ITS e 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795).
2. Etichetta e riempire 35 capsule di Petri sterili mm (FD35-100 Strumenti di precisione del mondo) circa a metà strada con L-15 terreno di coltura (soluzione (e)), uno per ogni embrione sezionato.
3. Fabbricare una pipetta placcatura afferrando ciascuna estremità di una pipetta Pasteur di vetro mentre si tiene la porzione rastremata sulla fiamma. Tirare le estremità a parte per circa 10 centimetri e poi si staccano alla fine per ottenere una punta di circa 0,2 mm.
4. Utilizzare la pipetta placcatura per aspirare la "pila sabbia" da un embrione minimizzare la quantità di soluzione disegnata. Espellere le cellule sul fondo di un piatto di coltura. Piastra le cellule in diverse righe. Osservare placcati cellule indifferenziate (Figura 5A e 5B).
5. Lasciare i piatti a base di cellule placcati indisturbati per almeno quindici minuti per lasciare il tempo alle cellule di attaccarsi al piatto.

4. Patch di serraggio nervo-muscolo Sinapsi

1. Dopo 12-24 ore di coltura, le cellule placcati assumono distinte caratteristiche morfologiche: cellule muscolari diventano fusiforme e neuroni spinali estendere i processi lunghi (Figura 6). Funzionale contatto sinaptico tra varicosità dei neuriti e le cellule muscolari possono essere confermate con registrazioni simultanee coppie elettrofisiologiche. "M", "S" e "V" si riferiscono rispettivamente alla cellula muscolare, neuronalesoma e varici presinaptica.
2. Preparare due elettrodi di patch per la registrazione: uno per il varici presinaptica e uno per la cellula muscolare.
3. Per l'elettrodo presinaptica, preparare una soluzione contenente amfotericina come segue: Aggiungere 100 microlitri di DMSO in una provetta da 1,5 ml contiene 5 mg di amfotericina B (Sigma A4888). Vortex questa soluzione per 10 sec. Successivamente, aggiungere 10 ml di questa soluzione in una provetta da microcentrifuga seconda contiene 625 K ⁺ ul-interno soluzione per Amfotericina B (soluzione di (h)). Vortice come sopra.
4. Riempire il pre-sinaptica elettrodo con l'amfotericina contenente K ^+-interna soluzione preparata nella fase 4.3 e il post-sinaptica elettrodo con K ^+-interna soluzione (soluzione (g)).
5. Sostituire i media nel piatto cultura con NFR e si stabilisce in un microscopio invertito dotato di ottica di contrasto di fase.
6. Posizionare entrambi gli elettrodi appena sopra i rispettivi obiettivi. Ottenere l'intera co-cellnfiguration con l'elettrodo cellula muscolare prima configurazione di patch perforato con l'elettrodo varici.
7. Per confermare la funzionalità della sinapsi, depolarizzare il varici con un amplificatore patch clamp (es Axopatch 200B, Molecular Devices) sotto controllo software (ad esempio pClamp 9, Molecular Devices) sia per la corrente simultanee presinaptici e postsinaptici. Figura 7 mostra le correnti viste in risposta a depolarizzante fasi di tensione dati al varici presinaptico con incrementi di 10 mV da -30 mV a +40 mV. Le correnti attivo visti nella cellula presinaptica sono portati da Na ⁺ e Ca ^{2 +} e le correnti esteriori di K ^+. Le correnti registrate nella cellula postsinaptica sono risposte a neurotrasmettitore rilasciato dal varici e si svolgono per lo più da Na ⁺ attraverso i canali recettore nicotinico dell'acetilcolina.

Risultati

Figura 4B mostra la vista dorsale di un isolato midollo spinale / myotome immediatamente dopo la sua rimozione da uno stadio embrionale di Xenopus 22. Figura 4C mostra che, dopo la soluzione per la rimozione della pelle e incubazione in Ca ^{2 +-Mg 2 +} senza soluzione (CMF, ( c)), le cellule si dissociano in un "mucchio di sabbia" e sono pronti per la placcatura. Subito dopo la placcatura in cellule terreno di coltura mostrano poca variabilità morfologica (Figura 5B), ma assumono forme distinte dopo ventiquattro ore di cultura. Cellule muscolari diventano fusiforme mentre neuroni rimangono sferica mentre neuriti che si estendono varicosites elaborati in sinapsi con cellule muscolari (Figura 6). Registrazione simultanea di patch accoppiato dal varici presinaptica e postsinaptica delle cellule muscolari (Figura 7) rivela le correnti presinaptici entrata e di uscita associati con il rilascio di neurotrasmettitore e il resultant eccitatori correnti postsinaptiche.

Figura 1 A:.. Paio Allevamento di rane nel secchio di accoppiamento in cima schermo B: Frogs in amplexus con le uova fecondate.

Figura 2:.. Fase di "adatto" 22 embrione B: fase di "non idoneo" 28 embrioni. Barra della scala corrisponde a 1 mm.

Figura 3:. Tappa 22 embrione prima della rimozione della membrana vitellina e cappotto gelatina. La freccia indica il bordo esterno del mantello gelatina. La membrana vitellina aderisce strettamente alla Embranni ed è praticamente invisibile B:. embrione Bare. Barra della scala corrisponde a 1 mm.

Figura 4 A: Fase 22 embrione con una linea tratteggiata che indica a essere sezionato parte B:.. Acuto isolato porzione dorsale dell'embrione, "d" e "v" si riferiscono agli aspetti dorsale e ventrale degli embrioni, mentre "m" e "n" indica la posizione approssimativa dei mytomes e il tubo neurale C:. "mucchio di sabbia" di cellule dopo 60 min in CMF. Barra della scala rappresenta 1 mm per A, e 0,5 mm per B e C.

Figura 5 A:. Vista potenza 5x di cellule in coltura immediatamente dopo fasciame. B: la cultura stessa a 40x. Scalabarra rappresenta 40 pm per A, e 5 micron per la B.

Figura 6. Giunzione neuromuscolare in coltura con identificazione del soma neuronale (S), varici presinaptico (V), e la cellula muscolare postsinaptica (M). Scala bar: 5 micron.

Figura 7. Presinaptici (in alto) e postsinaptici (basso) correnti osservate in risposta all'applicazione di tensione 10 mV incrementale passaggi presentati al varici presinaptica da -30 mV a +40 mV. Gradini di tensione sono indicati accanto ad alcune delle tracce presinaptici. Il potenziale di mantenimento per entrambe le celle era -70 mV.

Discussione

Passaggi chiave nel successo di co-coltura dei motoneuroni e le cellule muscolari sono l'uso di embrioni prodotti opportunamente messo in scena dalla riproduzione indotta delle rane Xenopus, e la dissezione attenta asettica dei neuroni spinali e mioblasti indifferenziati. Uova fecondate deve essere lasciato indisturbato fino a raggiungere circa il 10 o in scena in modo da farli muovere prima spesso si ferma il loro sviluppo. Embrioni sani sono identificati da un aspetto liscio e una colorazione marrone e bianco screziato. Fase 22-24 embrioni sono i più utili, perché questo è il punto durante lo sviluppo solo dopo la chiusura del tubo neurale e prima che i miociti sono differenziate in modo significativo. Inoltre, le cellule di embrioni anziani non dissociare bene in CMF. Si deve prestare attenzione durante la rimozione della membrana vitellina quanto aderisce fortemente l'embrione. La membrana deve essere lacerato usando pinze taglienti modo che l'embrione emerge intatto. Un altro importante precaution è quello di posizionare con cura le cellule sul fondo del piatto cultura (piuttosto che lasciare a sistemarsi lì). Questo metodo è preferito poiché ciò aumenta la probabilità che le cellule aderiscono al piatto di coltura.

Neurotrasmissione funzionale tra nervo e muscolo può essere determinato con la registrazione solo postsinaptico e spesso può essere accertata con l'osservazione di contrazione muscolare spontanea dopo innervazione. Un-cellule muscolari innervate non contorcersi nella cultura. Registrazione postsinaptico solo è utile per registrare correnti endplate in miniatura o potenziali, ma le misure di rilascio evocato richiede la stimolazione presinaptica, e la correlazione delle correnti pre-e postsinaptici richiede il doppio del patch-clamp.

Oltre al paired-cerotto metodo di registrazione descritto qui, questa preparazione offre la possibilità di introdurre una pipetta terzo al neuronale soma ⁵ Questo consente la generazione di un potenziale d'azione that può propagare al varici presinaptica e portare al rilascio di neurotrasmettitore. Inoltre, agenti putativi che si pensa di mediare o modulare la trasmissione sinaptica può essere introdotto per entrambi i lati della sinapsi: tramite la pipetta cellula muscolare o per diffusione da una pipetta terzo posto al soma.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attrezzature / Forniture	Venditore	Catalogo / Numero di modello
Insulina-transferrina-selenio	Sigma	I1884
Gonadotropina corionica umana	Sigma	CG-10
Pressione di vapore osmometro	Wescor	5100C
Minutien Pins	Strumenti Scienza Belle	26002-10
Amfotericina B	Sigma	A4888
Forcipe	Strumenti Scienza Belle	11251-30
			Soluzione Nome Ricetta (A) NFR (Ringer rana normale (in mM) 116 NaCl, KCl 2, CaCl 2 1,8, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. (B) soluzione salina al 10% 10 ml NFR 90 ml di H 2 O deionizzata (C) CMF (Ca 2 + / Mg 2 + senza soluzione) 125 NaCl, 2 KCl, 1.2 EDTA, 5 Na +-HEPES, pH 7.35. (E) Media L-15 Cultura 50 ml L-15 supporti (Sigma L1518) + 50 NFR ml. (G) + K-soluzione interna (in mM) 116 KCl, NaCl 1, 1 MgCl 2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 (H) K +-interna soluzione Amfotericina B (in mM) 52 K 2 SO 4, 38 KCl, EGTA 1, 5 HEPES, pH 7,3