Одновременное пред-и пост-синаптические Электрофизиологические Запись с<em&gt; Xenopus</em&gt; Нервно-мышечного Co-культуры

Резюме

Это видео демонстрирует процедуры используются для выращивания первичных культур эмбриональных Xenopus Нервных и мышечных клеток и полезности этого препарата для изготовления одновременным пре-и пост-синаптические записи патч зажим.

Аннотация

Много информации о связи пресинаптических ионные токи с выделением нейромедиатора, была получена из беспозвоночных препаратов, в первую очередь гигантского кальмара синапса ^1. Однако, за исключением подготовки описано здесь, несколько препаратов позвоночных существуют в котором можно сделать одновременные измерения высвобождение нейротрансмиттеров и пресинаптических ионные токи. Эмбриональные Xenopus мотонейронов и мышечных клеток можно выращивать вместе в простой питательной среде при комнатной температуре, они будут образовывать функциональные синапсы в течение двенадцати до двадцати четырех часов, и может быть использовано для изучения нервных и мышечных клеток и развитие синаптических взаимодействий в течение нескольких дней (до разрастание происходит). Некоторые преимущества этих совместных культур по сравнению с другими препаратами позвоночных включает простоту подготовки, способность поддерживать культуру и работы при комнатной температуре, и готово доступности синапсов сформированы ²-4. Препарат широко используется для изучения биофизических свойств ионных каналов пресинаптической и регулирования медиатора ^5-8. Кроме того, препарат поддается других применений, включая изучение роста аксонов и синаптогенез ^9-12, молекулярные механизмы нейротрансмиттеров ^13-15, роль диффузии послов в нейромодуляции ^16,17, а в пробирке синаптической пластичности ^{18 - 19.}

протокол

1. Предварительная подготовка экспериментальных

1. Подготовьте следующие решения (см. Таблицу 1 для композиции): (а) 1 литр NFR (Нормальный Ringer Frog), (б) 100 мл 10% раствора, (в) 100 мл CMF (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-бесплатное} решение ), (D) 1 мл ИТС (инсулин-трансферрин-селен, Sigma I1884), (д) ​​100 мл L-15 культуральной среде (F) 10 мл ХГЧ (хорионический гонадотропин человека Sigma CG-10), (г) 100 мл K ^{+-внутреннее} решение (ч) 100 мл K ^{+-внутреннее} решение для амфотерицина B. осмотической силе решение 1 должны быть проверены, чтобы гарантировать, что это около 260 мосм использованием осмометра давление паров (например, Wescor модель № 5100C) .
2. Фильтр стерилизации растворов (б) и (в). Решения (а) (б) и (в) могут храниться до трех месяцев при 4 ° C. Подготовка раствора (г), добавляя 1 мл деионизованной H ₂ O на флакон, содержащий лиофилизированный порошок через 25 иглы шприцев и шприц фильтр. Это окончательное решение схраниться при температуре 4 ° С в течение 30 дней.
3. Подготовка раствора (е) в ламинарном боксе, объединяя все компоненты в стакане или колбе. Фильтр стерилизации окончательное решение и передать 10 мл аликвоты в стерильные пробирки. Хранить при -20 ° C.
4. Подготовка HCG (раствор (F)), добавив 10 мл деионизированной Н ₂ 0 в флакон, содержащий лиофилизированный порошок через 25 иглы шприцев и шприц фильтр. Это окончательное решение можно хранить при температуре 4 ° С в течение 30 дней.
5. Изготовление по крайней мере два инструмента микродиссекции склеивания контактный Minutien (26002-10, Fine Инструменты наук) до конца стеклянной пипетки Пастера с цианакрилатного клея. Разрешить острым концом булавку, чтобы выходить за конец пипетки около 0,5 см.
6. Два дня перед приготовлением культур, вызывают размножение со следующей процедурой. Определить разведение готово пара Xenopus, наблюдая видный, красновато клоаки на женский и темной пигментации на плоской суrface из передней лапы самца. По одному, чистая каждой лягушки и удерживать ее вентральной стороной вниз на раковину с чистой, чтобы она никуда не деться. Вводят 1 мл раствора (F) через сеть и подкожно в одну из спинных мешочков лимфы.
7. Поместите размножения пара вместе в закрытом десять галлонов резервуар с водой. Для того, чтобы животные не попрешь вновь проложены и оплодотворенных яиц, установить экранированный этажа с размерами ячеек около ½ "установлен примерно на 1-2 см выше дна бака (рис. 1А).
8. Оставьте в покое на лягушках 12-48 часов, пока животные находятся в Amplexus и оплодотворенных яиц наблюдается на полу под экраном (рис. 1б).
9. Снимите животных из бака, но оставьте в покое на яйца по крайней мере, 24 часа в сутки дольше. Эта пара лягушек может быть повторно выведены через шесть недель.
10. Ослабьте эмбрионы из нижней части бака и перенести их на четыре или пять 60x15 мм культаЮр блюда, содержащие 10% солевого раствора (раствор Б). Сортировка эмбрионов этапе в соответствии со схемой Niewkoop и Фабера (см. 20). Полезные эмбрионы будут те, на стадии 22-24. Рисунок 2А показывает эмбрион на стадии примерно 22, а рис. 2В показывает эмбрион, который находится слишком далеко вперед в развитии, чтобы быть полезным (около этап 28). Это важно выбрать эмбрионы, которые являются здоровыми: те, которые являются гладкие на вид со светло-коричневыми и белыми пятнами являются идеальным выбором. Эмбрионы, которые имеют большие черные или белые пятна, как правило, нездоровой и непригодной для использования.

2. Microdissection эмбрионов Xenopus

1. Внутри ламинарном потоке, этикетки и заполнить примерно на полпути три 60x15 мм стерильные чашки культуры с 10% солевым раствором, и один с CMF.
2. Используя стерильный, стекло пипетки Пастера передачу 9:55 этап 22-24 эмбрионов в одном из блюд, содержащих 10% солевого раствора. С помощью стерео масштаба рассекатьING микроскопом внутри капюшона (0,6-5x с 10-х окулярами), удалите слой желе и желточной мембраны из каждого эмбриона с помощью двух пар стерильных № 5 щипцы (11251-30, Fine Инструменты наук). (См. рисунки 3A и 3B.)
3. Мыть голых эмбрионов путем передачи их по одному за раз, через оставшиеся два блюда 10% солевым раствором и, наконец, в блюдо с CMF. Используйте новую, стерильную пипетку для каждой передачи и свести к минимуму объем раствора передается от блюдо в блюде.
4. В свою очередь, держат друг эмбриона мягко, но решительно с парой щипцов и, используя инструмент микродиссекции стиле в пункте 1.5, удалить нервной трубки и связанной миотомов, которые расположены в самых спинной части животного. Сделайте это, сделав три куска, по одному на концах расположение нервной трубки и третий раз вентральной к ней (рис. 4а). Перемещение каждого расчлененный нервной трубки / миотома на чистую часть блюда от желтка ГранулES и другой мусор (рис. 4В). Дорсо-вентральной оси и расположение нервной трубки и миотомов указаны на рисунке 4.
5. Через пятнадцать минут в этом растворе (CMF) использование щипцов, чтобы поднять пигментированной кожи свободные от расчлененного ткани и выбросить. После дополнительных 30-60 минут, клетки образуют "кучи песка", как они становятся диссоциированных друг от друга (рис. 4в).

3. Подготовка нервно-мышечного Co-культуры

1. Оттепель 10 мл трубки культуральной среды и асептически добавить 70 мкл ЕЕ и 35 нг / мл BDNF (Sigma B3795).
2. Этикетка и заполнить стерильные 35 мм культуру блюд (FD35-100 Instruments Всемирного Precision) примерно на полпути с L-15 культуральной среде (раствор (е)), по одному для каждого эмбриона расчленены.
3. Изготовление покрытия пипетки, держа каждый конец стеклянной пипетки Пастера, удерживая конической части над пламенем. Потяните за концы друг от друга примерно 10 см, а затем разорвать конца, чтобы дать чаевые приблизительно 0,2 мм.
4. С помощью пипетки покрытия сосать "кучи песка" из одного эмбриона минимизации количества раствора вничью. Выгнать клеток на дно культуры блюдо. Пластина клеток в несколько строк. Соблюдайте покрытием недифференцированные клетки (рис. 5А и 5Б).
5. Оставьте блюда покрытием клетки нетронутыми в течение по крайней мере пятнадцать минут, чтобы дать клеткам время, чтобы приложить к блюду.

4. Патч зажима нервно-мышечных синапсов

1. После 12-24 часов в культуре, покрытая клетками взять на себя различные морфологические характеристики: мышечные клетки становятся веретенообразных нейронов спинного мозга и расширить длительных процессов (рис. 6). Функциональные синаптических контактов между нейритов варикоз и мышечных клеток может быть подтверждена с одновременным парных электрофизиологических записей. "M", "S" и "В" относятся соответственно к мышечных клеток, нейроновсомы и пресинаптических варикозное расширение вен.
2. Приготовьте два патча электроды для записи: одна для пресинаптической варикозное расширение вен и один для мышечных клеток.
3. Для пресинаптических электрода, подготовить амфотерицин раствор, содержащий следующим образом: 100 мкл ДМСО до 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 5 мг амфотерицина В (Sigma A4888). Vortex это решение в течение 10 сек. Затем добавьте 10 мкл этого раствора до второй трубы микроцентрифужных, который содержит 625 мкл K ^{+-внутреннее} решение для Амфотерицин (решение (H)). Vortex, как указано выше.
4. Заполните пресинаптических электрод с амфотерицином содержащих K ^{+-внутренние} решения, полученного на стадии 4.3 и пост-синаптические электрод с K ^{+-внутреннее} решение (решение (г)).
5. Заменить СМИ в культуре блюдо с НПО и переместить его на инвертированный микроскоп снабжен оптикой фазового контраста.
6. Расположите оба электрода чуть выше их соответствующих целей. Получить цельноклеточной сотрудничестваnfiguration с электродом мышечные клетки до перфорированной конфигурации патч с варикозным расширением вен электрода.
7. Для подтверждения функциональных синапсов, деполяризовать варикозное расширение вен с усилителем зажима патч (например, Axopatch 200B, Molecular Devices) под управлением программного обеспечения (например, pCLAMP 9, Molecular Devices) и наблюдать одновременное пресинаптических и постсинаптических токов. Рисунке 7 показана токи видел В ответ на деполяризующих шаги напряжения, подаваемого к пресинаптической варикозное расширение вен в 10 мВ шагом от -30 мВ до +40 мВ. Внутренний ток видел в пресинаптической клетки разносятся Na ⁺ и Ca ^{2 +} и внешние токи ⁺ K. Токи, записанные в постсинаптической клетки являются ответами на нейромедиатора освобожден от варикозного расширения вен и осуществляется главным образом путем Na ⁺ через никотиновые рецепторы ацетилхолина каналов.

Результаты

Рисунок 4б показывает вид сверху из изолированного спинного мозга / миотома сразу же после его удаления из стадии 22 Xenopus эмбриона. Рисунок 4C показывает, что после того, как решение проблемы с кожей и инкубации в Ca ^{2 +-Mg 2 +-бесплатное} решение (CMF ( с)), клетки распадаются на "кучи песка" и готовы для нанесения покрытий. Сразу после посева клеток в культуральной среде, проявляют мало морфологической изменчивости (рис. 5Б), но взять на себя различные формы через двадцать четыре часа в культуре. Мышечные клетки стали веретенообразных нейронов, в то время как остаются сферическими то время как расширение невриты, что сложные varicosites в синапсах с мышечными клетками (рис. 6). Одновременное парных патча записи с пресинаптической варикозное расширение вен и постсинаптической клетки мышц (рис. 7) показывает, пресинаптические внутренних и внешних токов, связанных с выделением нейромедиатора и resultaNT возбуждающих постсинаптических токов.

Рисунок 1:.. Разведение пара лягушек в брачный ведро поверх экрана B: Лягушки в Amplexus с оплодотворенного яйца.

Рисунок 2. ». Подходящего" стадии 22 эмбрионов B: "неугодных" этап 28 эмбрионов. Шкала бар составляет 1 мм.

Рисунок 3. Этап 22 эмбрионов перед удалением желточной мембраны и желе пальто. Стрелка указывает на внешней границе слоя желе. Желточной оболочки придерживается близко к EMBRлет и является практически невидимой B:. Bare эмбриона. Шкала бар составляет 1 мм.

Рисунок 4: Stage 22 эмбрионов с пунктирной линией, указывающей чтобы быть расчлененные части B:.. Остро изолированы спинной части эмбриона, "г" и "в" относятся к спинной и брюшной аспекты эмбрионов, в то время как "м" и "N" указывает приблизительные места mytomes и нервной трубки C:. "кучи песка" клеток после 60 мин в CMF. Шкала бар составляет 1 мм и 0,5 мм для B и C.

Рисунок 5. 5x зрения власти клеток в культуре сразу же после посева. В: То же культуры на 40x. Шкалабар составляет 40 мкм и 5 мкм для B.

Рисунок 6. Нервно-мышечного соединения в культуре с определением сомы нейронов (S), пресинаптические варикозное расширение вен (V), и постсинаптической клетки мышц (M). Шкала бар: 5 мкм.

Рисунок 7. Пресинаптическая (вверху) и постсинаптические (внизу) токи видел в ответ на применение 10 мВ дополнительных ступеней напряжения представлены на пресинаптические варикозное расширение вен от -30 мВ до +40 мВ. Напряжение шага, указанных рядом с некоторыми из пресинаптических следы. Проведение потенциал как для клеток было -70 мВ.

Обсуждение

Основные этапы успешного сотрудничества культивирования мотонейронов и мышечных клеток является использование надлежащего поставил эмбрионов, полученных от наведенного разведение лягушек Xenopus, и тщательный асептический рассечение недифференцированные нейроны спинного и миобластов. Оплодотворенные яйца должны быть оставлены нетронутыми, пока они не достигают примерно стадии 10 или около того, как перемещение их раньше часто останавливает их развитие. Здоровый эмбрионов, определенных гладкий внешний вид и коричневый и белый пестрая окраска. Этап 22-24 эмбрионы являются наиболее полезными, потому что это точка в процессе разработки сразу же после закрытия нервной трубки и перед миоцитов были дифференцированы значительно. Кроме того, клетки из эмбрионов старше не в состоянии отделить и в СЦМ. Следует проявлять осторожность при снятии желточной оболочки, как он придерживается сильно эмбриона. Мембрана должна быть раздираемой острыми щипцами, так что зародыш возникает нетронутыми. Другим важным precautioп тщательно поместить клетки на дно культуры блюдо (а не позволив им поселиться там). Этот метод является предпочтительным, так как это увеличивает вероятность того, что клетки будут придерживаться культуры блюдо.

Функциональные нейротрансмиссии между нервной и мышечной может быть определена только с постсинаптической записи и часто может быть установлено путем наблюдения спонтанного сокращения мышц после иннервации. Un-иннервируемых клеток не дергаться в культуре. Постсинаптические запись сама по себе полезна для записи миниатюрных токов концевой пластинки или потенциалы, но измерении вызвало освобождение требует стимуляции пресинаптического, и соотношение пре-и постсинаптических токов требует двойной патч-зажим.

Кроме того, парные патч записи метод, описанный здесь, этот препарат дает возможность ввести третий пипетки на сомы нейронов ⁵ Это позволяет генерировать потенциал действия, тхат может распространиться на пресинаптические варикозной болезни и привести к выбросу нейромедиатора. Кроме того, предполагаемые агенты, которые, как полагают, посредником или модулировать синаптическую передачу могут быть введены в обе стороны синапса: с помощью пипетки мышечных клеток путем диффузии или от третьего пипетки помещают на сомы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Оборудование / инвентарь	Продавец	Каталог / номер модели
Инсулин-трансферрин-Селен	Сигма	I1884
Хорионического гонадотропина человека	Сигма	CG-10
Давление пара Осмометр	Wescor	5100C
Minutien Pins	Средства изобразительных наук	26002-10
Амфотерицин	Сигма	A4888
Щипцы	Средства изобразительных наук	11251-30
			Имя решения Рецепт (А) NFR (Нормальный Ringer Frog (в мМ) 116 NaCl, 2 KCl, CaCl 1,8 2, 5 Na +-HEPES, рН 7,35. (Б) 10% солевой раствор NFR 10 мл +90 мл деионизованной H 2 O (С) CMF (Ca 2 + / Mg 2 +-бесплатное решение) 125 NaCl, 2 KCl, 1,2 EDTA, 5 Na +-HEPES, рН 7,35. (Е) L-15 Культура СМИ 50 мл L-15 средств массовой информации (Sigma L1518) + 50 мл NFR. (Г) K +-внутреннее решение (в мМ) 116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl 2, 10 EGTA, 5 HEPES, рН 7,3 (H) K +-внутреннее решение для Амфотерицин (в мМ) 52 K 2 SO 4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, рН 7,3