Eşzamanlı Öncesi ve Sonrası-sinaptik Elektrofizyolojik Recording<em&gt; Xenopus</em&gt; Sinir-kas Co-kültürlerin

Özet

Bu video embriyonik primer kültürlerinde büyümek için kullanılan prosedürleri gösterir Xenopus Sinir ve kas hücreleri ve eşzamanlı öncesi ve post-sinaptik yama kelepçe kayıt yapmak için bu hazırlık kullanışlılığı.

Özet

Nörotransmitter serbest bırakılması ile presinaptik iyonik akımların kaplin hakkında çok bilgi en önemlisi omurgasız hazırlıkları, kalamar dev sinaps ¹ elde edilmiştir. Bununla birlikte, hazırlama hariç burada açıklandığı gibi, az omurgalı preparatlar bu nörotransmitter serbest ve presinaptik iyonik akımlarının eşzamanlı ölçümler yapmak mümkündür ki içinde bulunmaktadır. (Dek 12-24 saat içinde işlevsel sinaps oluşturacak ve birkaç gün boyunca sinir ve kas hücre gelişimi ve sinaptik etkileşimleri çalışmak için de kullanılabilir; Embriyonik Xenopus motor nöronlar ve kas hücreleri oda sıcaklığında basit bir kültür ortamı içinde yetiştirilen bir arada büyümesi) oluşur. Diğer omurgalı preparatlar içinde bu ko-kültürler bazı avantajları hazırlama kolaylığı, oda sıcaklığında kültürleri ve çalışma muhafaza etme özelliğine sahiptir, ve ² oluşturduğu sinaps hazır erişilebilirlik-4. Hazırlık presinaptik iyon kanalları ve verici sürümü ^5-8 yönetmeliğin biyofiziksel özelliklerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, hazırlık ^9-12 akson uzantısı ve sinaptogenez çalışma, nörotransmitter salınımını ^13-15, nöromodülasyon ^16,17 içinde difüze haberciler rolünü moleküler mekanizmaları ve in vitro sinaptik plastisite ¹⁸ de dahil olmak üzere diğer kullanımlar için kendini vermiştir ^{- 19.}

Protokol

1. Ön-deneysel Hazırlama

1. Aşağıdaki çözeltiler (kompozisyonlar için bakınız Tablo 1) hazırlanması: (a) 1 litre NFR (Normal Kurbağa Ringer), (b) ve 100 ml% 10 salin, (c) ve 100 ml CMF ^{(Ca2 +} / ^{Mg2 +-serbest} çözelti ), (d) 1 ml ITS (insülin transferin selenyum-, Sigma I1884), (e) ve 100 ml L-15 kültür ortamı, (f) 10 ml HCG (insan koryonik gonadotropin Sigma CG-10), (g) 100 ml K ^+-iç çözüm, çözüm 1 osmotik gücü bir buhar basıncı Osmometer (örn. Wescor model # 5100C) kullanarak yaklaşık 260 mOsm olduğundan emin olmak için kontrol edilmelidir Amfoterisin B (h) 100 ml K ^+-iç çözüm .
2. (B) çözümleri sterilize filtreleyin ve (c). Solutions (a) (b) ve (c) 4 ° C'de üç aya kadar saklanabilir Bir 25 gauge iğne şırınga ve şırınga filtresi üzerinden liyofilize toz içeren şişe 1 ml deiyonize _H2O ilave edilerek çözelti (d) hazırlayın. Bu nihai çözüm cBir 30 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
3. Bir kabı veya şişesi tüm bileşenleri bir araya getirerek bir laminer akış kaputu çözeltisi (e) hazırlayın. Nihai çözüm sterilize ve steril santrifüj tüpleri içine 10 ml alikotları aktarmak filtreleyin. -20 ° C'de saklayın
4. 25 gauge şırınga, iğne ve şırınga filtresi ile liyofilize toz içeren flakon H ₂ 0 deiyonize 10 ml ekleyerek HCG (çözüm (f)) hazırlayın. Bu, nihai çözelti 30 gün boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
5. Tutkallama siyanoakrilat yapıştırıcı ile cam bir Pasteur pipeti ucuna bir Minutien pim (26002-10, İnce Science araçları) ile en az iki mikrodisseksiyon araç imal. Pipet yaklaşık 0.5 cm sonunun uzatmak piminin sivri ucunu ver.
6. Hazırlama kültürleri İki gün önce, aşağıdaki prosedür ile üreme neden. Düzlemsel su üzerinde kadın ve koyu pigmentasyon göze çarpan, kırmızımsı kloaka gözlemleyerek Xenopus bir üreme hazır çifti tanımlayınerkek ön pençeleri rface. Kaçamayacağım böylece bir zaman, net her kurbağa Tek ve net bir lavabo üzerine ventral tarafında basılı tutun. Dorsal lenf keseler net ve deri altından içine biri ile çözeltinin 1 mL'si (f) enjekte edilir.
7. Su ve bir kapalı on galon tank içinde bir arada üreme çifti yerleştirin. Hayvanların yeni koydu ve döllenmiş yumurta trample olmayacak emin olmak için, yaklaşık bir örgü boyutu ½ tankın alt (Şekil 1A) Yukarıdaki "takılı yaklaşık 1-2 inç ekranlı bir zemin yüklemek.
8. Hayvanlar amplexus olan ve döllenmiş yumurta ekranının altındaki kat (Şekil 1B) gözlemlendi kadar 12-48 saat boyunca bozulmadan kurbağaları bırakın.
9. Tankından hayvanlar çıkarın, ama daha uzun en azından 24 saat için yumurta rahatsız bırakın. Kurbağa bu çifti altı hafta sonra yeniden yetiştirilen olabilir.
10. Tankın dibinden embriyolar gevşetin ve dört ya da beş 60X15 mm kült aktarabilirsiniz% 10 tuzlu su (çözüm b) içeren ure yemekleri. Niewkoop ve Faber (ref. 20) şemasına göre evre tarafından embriyolar sıralayın. Faydalı embriyo aşamasında 22-24 az olanlar olacaktır. Şekil 2B (yaklaşık aşamada 28) yararlı olduğu gelişme boyunca çok uzak bir embriyo gösterirken Şekil 2A yaklaşık aşamada 22 embriyo gösterir. Bu sağlıklı embriyolar seçmek önemlidir: açık kahverengi ve beyaz beneklenme ile görünüşte düzgün olanları idealdir. Büyük siyah ya da beyaz lekeler var Embriyolar genellikle sağlıksız ve kullanışsız.

2. Xenopus Embryolarının Mikrodisseksiyon

1. Bir laminer akış kaputu, etiket içinde ve yaklaşık yarım üç 60X15 mm steril kültür% 10 tuzlu yemekleri ile doldurun ve CMF ile bir.
2. % 10 tuzlu su içeren yemekler birine steril, cam Pasteur pipeti transferi 09:55 aşamada 22-24 embriyo kullanma. Bir stereo zoom yardımıyla teşrih ilekaput içinde ing mikroskobu (10 x oküler ile 0.6-5x), steril # 5 forseps (11251-30, Güzel Bilim Araçları) iki çift kullanarak her embriyodan jöle ceket ve vitellin membran kaldırmak. (Şekil 3A ve 3B, bakınız.)
3. % 10 salin kalan iki yemekleri ile ve nihayet CMF içeren yemeğin içine, bir defada bir ileterek çıplak embriyolar yıkayın. Her transfer için yeni bir steril pipet kullanın ve çanak çanak transfer çözeltisinin hacmi en aza indirmek.
4. Buna karşılık, adım 1.5 sitemliyiz mikrodiseksiyon aracını kullanarak, forseps bir çift ile nazikçe ama sıkıca her embriyonun tutun ve nöral tüp ve hayvanın en dorsalinde yer almaktadır ilişkili Miyotom kaldırın. Üç dilim, nöral tüp konumu ve (Şekil 4A) için üçüncü sadece ventral iki ucundan birini yaparak bunu yapın. Uzaklıkta sarısı granül gelen çanak temiz bir parçası her disseke nöral tüp / myotome Taşıes ve diğer enkaz (Şekil 4B). Dorsal-ventral eksen, ve nöral tüp ve miyotomlarında ve konumları Şekil 4 içinde gösterilmektedir.
5. Bu çözüm yaklaşık on beş dakika sonra (CMF) kullanımı forseps disseke doku serbest pigmente deri kaldırın ve atmak. Birbirlerine (Şekil 4C) ayrışmış hale olarak bir ilave 30-60 dakika sonra, hücreler, bir "kum yığını" oluşturacak.

3. Sinir-kas Co-kültürlerin hazırlanması

1. Kültür ortamı bir 10 ml tüp çözülme ve aseptik 70 ul ekleyin ITS ve 35 ng / ml 'BDNF (Sigma B3795).
2. Etiket ve steril 35 mm kültür kaplarına (FD35-100 Dünya Hassas Aletler) yaklaşık yarım L-15 kültür ortamı (çözüm (e)), disseke her bir embriyo için biri ile doldurun.
3. Bir alev üzerinde şevli kısım tutulurken, bir cam Pasteur pipeti her iki ucunda tutarak bir kaplama pipet imal. Yaklaşık 1 ila uçlarında ayrı çek0 cm ve daha sonra yaklaşık 0.2 'lik bir uç elde etmek için son kopar.
4. Çizilmiş çözüm miktarını minimize tek embriyo "kum yığını" yalakalık kaplama pipet kullanın. Bir kültür çanağı alt üzerine hücreleri Expel. Birkaç satır içine Levha hücreleri. Kaplama farklılaşmamış hücreler (Şekil 5A ve 5B) uyun.
5. Hücreler zaman çanak takmak için izin vermek için en az on beş dakika boyunca rahatsız edilmeden kaplı hücreler bulaşık bırakın.

4. Patch Sıkma Sinir-kas Sinapslar

1. Kas hücreleri iğ şeklinde olur ve spinal nöronlar uzun süreçler (Şekil 6) uzatmak: kültüründe 12-24 saat sonra, kaplama hücreleri belirgin morfolojik özellikleri üzerine alır. Nörit varisler ve kas hücreleri arasındaki fonksiyonel sinaptik iletişim simultane eşleştirilmiş elektrofizyolojik kayıtlar ile teyit edilebilir. "M", "S" ve "V" nöronal, kas hücresi sırasıyla bakınsoma ve presinaptik varisler.
2. Presinaptik varisler için ve kas hücresi için bir: Kayıt için iki yama elektrot hazırlayın.
3. Presinaptik elektrot için, aşağıdaki gibi bir amfoterisin B içeren çözeltinin hazırlanması: 5 mg amfoterisin B (Sigma A4888) ihtiva eden 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne 100 ul DMSO ekleyin. 10 sn vorteksleyin bu çözüm. Sonraki, Amfoterisin B (çözüm (h)) için ^+-iç çözüm 625 ul K içeren ikinci bir mikrosantrifüj tüpüne bu çözeltinin 10 ul ekleyin. Yukarıdaki gibi Vortex.
4. Amfoterisin B ihtiva eden K basamak 4.3 'de hazırlanmış ^+-iç çözelti ile K ^+-iç çözeltisi (çözeltisi (g)) ile birlikte post-sinaptik elektrot ile pre-sinaptik elektrot doldurun.
5. NFR ile kültür çanak medya değiştirin ve faz kontrast optik ile donatılmış bir inverted mikroskop gittiğinizde.
6. Sadece kendi hedeflerinin üzerinde her iki elektrot yerleştirin. Tüm-hücre eş edininvarisler elektrot ile delikli yama yapılandırma önce kas hücresi elektrot ile nfiguration.
7. Sinaps işlevselliğini doğrulamak için, yazılım denetimi altında (örn. Axopatch 200B, Moleküler Cihazlar) bir yama kelepçe amplifikatör ile varisler depolarize (pCLAMP 9, Molecular Devices örneğin) ve eşzamanlı presinaptik ve postsinaptik akımları gözlemlemek. Şekil 7 görülen akımlar gösterilir +40 mV'ye -30 mV 10 mV artışlarla presinaptik varis verilen gerilimi adımlar depolarize yanıt olarak. Presinaptik hücre görülen içe akımları Na ⁺ ve Ca ^{2 +} ve K ⁺ ile dış akımlar tarafından yürütülmektedir. Postsinaptik akımlar hücre içinde kaydedilmiş varis serbest nörotransmitter yanıtları vardır ve nikotinik asetilkolin reseptörü kanallar vasıtasıyla Na ⁺ tarafından çoğunlukla taşınmaktadır.

Sonuçlar

Şekil 4B hemen 22 Xenopus embriyosunun. Şekil 4C olduğunu, Ca ^{2 +-Mg 2 +} ücretsiz bir çözüm cilt kaldırma ve inkübasyon (CMF, çözümden sonra (gösteren bir sahne alanından çıkarılmasını sonrası kordon / myotome izole spinal dorsal görünümü gösterir c)), hücreleri bir "kum yığını" içine ayrışır ve kaplama için hazır. Kültür ortamı hücreleri içine kaplama biraz morfolojik değişkenliği (Şekil 5B) gösterirler ancak kültür yirmi dört saat sonra farklı şekiller almaktadırlar hemen sonra. Nöronlar uzanan neurites iken küresel kalırken kas hücreleri iğ şeklinde haline kas hücreleri ile sinaps (Şekil 6) de ayrıntılı variköz. Varis presinaptik ve postsinaptik kas hücresi (Şekil 7) aynı anda eşleştirilmiş yama kayıt nörotransmiterin salınışı ve resulta ile ilişkili presinaptik içe ve dışa doğru akımlar ortaya koymaktadırnt postsinaptik akımlar eksitatör.

Şekil 1 A:.. Ekranda tepesinde çiftleşme kova kurbağa Damızlık çifti B: döllenmiş yumurta ile amplexus kurbağalar.

Şekil 2 A:.. "Uygun" aşaması 22 embriyo B: "uygunsuz" aşaması 28 embriyo. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder.

Şekil 3 A:. Aşama 22 embriyo vitellin membran ve jöle kat temizlenmeden önce. Ok jöle kat dış kenarına işaret. Vitellin membran embr yakından yapışıryo ve neredeyse görünmez B:. Bare embriyo. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder.

Şekil 4 A: to-be disseke B kısmı gösteren kesikli çizgi ile Sahne 22 embriyo:.. Embriyonun Akut izole dorsal kısmı; "d" ve "v" embriyoların dorsal ve ventral yönlerini bakın, ise "m" ve "n" mytomes ve nöral tüp yaklaşık konumları belirtin C:. CMF 60 dk sonra hücrelerin "Kum yığını". Ölçek çubuğu A için 1 mm ve B ve C için 0.5 mm temsil eder.

Şekil 5 A:. Hemen sonra kaplama kültürdeki hücre 5x güç görünümü. B: 40x de aynı kültür. Ölçekçubuğu A için 40 mikron ve B için 5 mikron temsil

Şekil 6. Nöronal soma (S), presinaptik varisler (V) ve postsinaptik kas hücresi (M) kimlik ile kültür Nöromusküler kavşak. Ölçek çubuğu: 5 mm.

10 mV artan voltaj uygulaması yanıt olarak görüldü Şekil 7. Presinaptik (üst) ve postsinaptik (alt) akımları -30 mV dan +40 mV presinaptik varisler sunulan adımları. Gerilim adımlar presinaptik izleri bazı yanında gösterilir. Hem hücreler için tutma potansiyeli -70 mV idi.

Tartışmalar

Motonöronlar ve kas hücrelerinin Başarılı co-kültür Key adımları uygun Xenopus kurbağaların indüklenen üreme üretilen embriyolar sahnelenen kullanımı ve farklılaşmamış spinal nöronlar ve iskelet hücreleri dikkatli aseptik diseksiyonu vardır. Er sık ​​onların gelişimi onları durdurur hareket gibi onlar yaklaşık 10 ya da öylesine aşamasına ulaşıncaya kadar Döllenen yumurtalar, bozulmamış bırakılmalıdır. Sağlıklı embriyoların pürüzsüz bir görünüm ve kahverengi ve beyaz benekli boyama ile tanımlanır. Bu miyositlerin önemli ölçüde farklılaştığını sadece nöral tüp kapanır sonra ve öncesinde geliştirme sırasında noktasıdır, çünkü Evre 22-24 embriyoların çok yararlıdır. Buna ek olarak, daha yaşlı edilen hücrelerden CMF iyi ayrıştırmak için başarısız. Bu embriyo kuvvetle yapışır gibi vitellin membran sökerken dikkat edilmelidir. Embriyonun bozulmadan ortaya böylece membran keskin forseps kullanarak parçalandı edilmelidir. Bir başka önemli precaution kültür çanak (yerine onları oraya yerleşmek icar fazla) alt üzerine hücreler dikkatle yerleştirmektir. Bu hücrelerin kültür çanak uyulması yönündeki olasılığını artırır gibi bu yöntem tercih edilir.

Sinir ve kas arasındaki Fonksiyonel nörotransmisyonu sadece postsinaptik kaydı ile tespit edilebilir ve sık sık innervasyon sonra spontan kas kasılması gözlem tarafından tespit edilebilir. Un-innerve kas hücreleri kültür içinde seğirme yoktur. Yalnız postsinaptik kayıt minyatür son plak akımları ya da potansiyelleri ancak uyarılmış boşalma ölçümleri öncesi ve postsinaptik akımların presinaptik uyarımı ve korelasyon patch-klemp çift gerektirir gerektirir kayıt için yararlıdır.

Burada açıklanan paired-yama kayıt yöntemi yanısıra, bu hazırlık Bu sayede nöronal soma ⁵ üçüncü bir pipet tanıtma fırsatı sunan bir aksiyon potansiyeli tha nesilt presinaptik varisler yaymak ve nörotransmitter salınımına yol açabilir. Buna ek olarak, arabuluculuk düşünce veya sinaptik iletimi modüle edilir olası ajanlar sinaps iki tarafına da tanıttı olabilir: kas hücresi pipet aracılığıyla veya soma yerleştirilmiş üçüncü bir pipetle difüzyon yoluyla.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ekipman / Malzemeleri	Satıcı	Katalog / Model Numarası
İnsülin-Transferrin-Selenyum	Sigma	I1884
İnsan koryonik gonadotropin	Sigma	CG-10
Buhar Basıncı Ozmometre	Wescor	5100C
Minutien Pins	Güzel Bilim Araçları	26002-10
Amfoterisin B	Sigma	A4888
Forseps	Güzel Bilim Araçları	11251-30
			Çözüm Adı Yemek tarifi (A) NFR (Normal Kurbağa Ringer (mM) 116 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl2, 5 Na-HEPES, pH 7.35. (B)% 10 salin 10 ml NFR +90 ml H2O deiyonize (C) CMF (Ca2 + / Mg2 +-serbest çözelti) 125 NaCl, 2 KCl, 1.2 EDTA, 5 Na +-HEPES, pH 7.35. (E) L-15 Kültür ortamı 50 ml L-15 ortamı (Sigma L1518) + 50 ml NFR. (G) K +-iç solüsyonu (mM cinsinden) 116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7.3 Amfoterisin B (h) K +-iç solüsyonu (mM cinsinden) 52 K 2 SO 4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7.3