Propriedades de transporte de Ibuprofeno encapsulados em ciclodextrina nanoesponja hidrogéis: A Proton HR-MAS NMR Estudo Spectroscopy

Resumo

Os regimes de movimento de ibuprofeno encapsulado em nanoesponjas P-ciclodextrina rede de polímero são investigados usando spin echo-técnica de campo pulsado gradiente (PGSE) RMN. Síntese, purificação, a carga de droga, a execução da sequência de pulso de NMR e análise de dados para calcular o deslocamento quadrado médio da droga a vários tempos de observação são descritos em detalhe.

Resumo

A reticulação química de β-ciclodextrina (β-CD) com o dianidrido etilenodiaminotetraacético (EDTA), levou-se a polímeros ramificados referidos como nanoesponjas ciclodextrina (CDNSEDTA). Duas preparações diferentes são descritas com 1: 4 e 1: 8 proporções molares de CD-EDTA. Os polímeros reticulados correspondentes foram contactadas com uma solução aquosa 0,27 M de sal de sódio de ibuprofeno (IP) levando a hidrogéis homogéneos, incolores, carregadas com droga.

Os sistemas foram caracterizados por alta resolução ângulo mágico girando (HR-MAS) espectroscopia de RMN. Campo Pulsado de spin eco de gradiente (PGSE) espectroscopia de RMN foi utilizado para determinar o deslocamento do quadrado da média (DPM) de IP no interior do gel polimérico em diferentes momentos de observação t _d. Os dados foram submetidos a transformações, a fim de estudar a dependência do tempo de DME: MSD = f (T _d). A metodologia proposta é útil para caracterizar os diferentes regimes de difusão que,Em princípio, o soluto pode experimentar dentro do hidrogel, difusão ou seja normal ou anómala. Os protocolos completos, incluindo a preparação do polímero e a purificação, a obtenção de hidrogeles carregados com o fármaco, a preparação da amostra de RMN, a medição de MSD por espectroscopia de HR-MAS NMR e o processamento de dados final para atingir a dependência do tempo de MSD são aqui relatados e discutidos . Os experimentos apresentados representam um caso paradigmático e os dados são discutidos em termos de abordagem inovadora para a caracterização das propriedades de transporte de um convidado encapsulado dentro de um hospedeiro polimérico de aplicação potencial para a entrega da droga.

Introdução

Há um interesse crescente na concepção e formulação de sistemas poliméricos capazes de aprisionar, através de interacções não covalentes, pequenas moléculas com potencial atividade bioquímica. Tais materiais são esperados para encontrar aplicações no transporte do princípio activo ao alvo seletivo e de fabrico, após a acção de estímulos externos, tais como variações de pH, temperatura, etc. Neste contexto, hidrogéis acabou por ser materiais versáteis e poderosas para a nanomedicina em vista da libertação controlada de medicamentos ^1. A formação de hidrogéis poliméricos pode ser conseguido através da interligação das cadeias macromoleculares por i) interacções físicas, não covalentes, tais como ligações de hidrogénio, ii) covalente a reticulação das cadeias principais para uma rede tridimensional capaz de inchar na presença de uma solução aquosa ou iii) uma combinação dos dois métodos mencionados ^2-4.

Uma classe particularmente versátil de três dimensional, polímeros dilatáveis ​​para o encapsulamento de espécies orgânicas e inorgânicas podem ser obtidas a partir de β-ciclodextrina naturais (β-CD) por meio de condensação com derivados adequados, activados de um ácido tetracarboxílico ^5-8 dando origem a nanoesponjas ciclodextrina (CDN). A síntese, caracterização e aplicação de CDNS é um tema de pesquisa consolidada do nosso grupo. Resultados dos últimos dos anos indicam que CDNS mostrar as propriedades intrigantes do inchaço, a absorção / inclusão de produtos químicos, e liberação de moléculas de drogas pequenas, com aplicações em liberação controlada de ingredientes ativos farmacêuticos ^{9 - 11} e química ambiental ^12-14.

Tendo em conta estas premissas, dois problemas principais a serem abordados preocupação o carregamento eficiente do composto activo no gel polimérico e uma melhor compreensão da mobilidade solutos nas matrizes de gel ¹⁵ . A literatura fornece ambos os estudos experimentais e teorias relacionadas com mecanismos de difusão de pequenas moléculas em redes macromoleculares ^16,17. Pulsada spin-eco (PGSE) espectroscopia de RMN de campo de gradiente é um método bem estabelecido estrutural amplamente utilizado para estudar a difusão de translação de moléculas pequenas em solventes ¹⁸ ou o auto-difusão de líquidos puros. Os recentes desenvolvimentos de alta resolução ângulo mágico girando tecnologia NMR (HR-MAS), foi possível recolher dados de RMN de alta resolução de moléculas celulares em suspensões heterogéneas ^19, géis e polímeros expansíveis ^20,21. Na verdade, a configuração experimental que combina espectroscopia HR-MAS RMN e a sequência de pulso PGSE proporciona uma oportunidade única para observar as moléculas de soluto no ambiente molecular do hospedeiro. Os dados importantes sobre as propriedades de transporte da molécula de droga encapsulada dentro de uma matriz de gel podem, assim, ser obtida. dados experimentais de alta qualidade podem, assim, ser obtiNED permitindo um design mais racional dos nanoestruturados sistemas hospedeiro-hóspede.

No presente trabalho, descrevemos os protocolos detalhados para as seguintes etapas: i) síntese e purificação de dois formulação diferente do CDNS reticulado com polímeros EDTA (Figura 1), referido como CDNSEDTA, e caracterizada por CD diferente / molar agente de reticulação relação: 1: 4 (CDNSEDTA 1: 4) e 1: 8 (CDNSEDTA 1: 8); ii) a preparação de hidrogéis carregado com a droga, tanto para CDNSEDTA 1: 4 e CDNSEDTA 1: 8. Neste passo, foram utilizados, como molécula modelo droga, o popular sal de ibuprofeno de sódio não-esteróides anti-inflamatórios (IP); iii) a investigação completa das propriedades de transporte de IP dentro da CDNSEDTA hidrogéis via espectroscopia PGSE-HRMAS RMN. O método aqui proposto baseia-se na medição do deslocamento do quadrado da média (DPM) do fármaco encapsulado dentro do hidrogel seguida pela análise da dependência do tempo do MSD.

Nós Wish de salientar que a metodologia descrita acima -, que é focado sobre a dependência temporal da SMD do fármaco na matriz - fornece um espectro mais amplo de informação em comparação com a metodologia de síntese com base na determinação de apenas coeficiente de difusão do fármaco. Nós recentemente demonstrado ²¹ que esta abordagem permitiu a discriminação dos regimes normais e anormais de difusão experimentados por IP confinados em hidrogéis CDNs.

Acreditamos, assim, que a descrição passo-a-passo da síntese de polímeros / purificação, a formação dos hidrogéis carregado com a droga, HR-MAS NMR caracterização e processamento de dados dos dados MDS, é uma ferramenta poderosa para cientistas interessados ​​na caracterização de sistemas nanoestruturados para o confinamento e liberação de moléculas pequenas.

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Protocolo

1. Síntese de Polímeros CDNSEDTA

1. Seco β-ciclodextrina (β-CD) em forno a 80 ° C durante 4 horas antes da utilização. Secas 500 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) e 100 ml de trietilamina _(Et3N) sobre crivos moleculares (4 Â) durante 24 h antes de usá-los no protocolo.
2. Introduzir 25 ml de DMSO num frasco de 50 ml de um gargalo de fundo redondo. Sob agitação magnética, adicionar 5,675 g de β-CD (5 mmol). A fim de reduzir a formação de grumos, adicionar o pó β-CD em pequenas porções a DMSO.
3. Após cerca de 30 min, adicionar 6 mL de Et ₃ N à solução homogénea usando uma pipeta graduada 10 ml. Manter-se a mistura sob agitação durante 15 min à temperatura ambiente. Mergulhar o balão em um banho de água à TA.
   NOTA: A reacção entre β-CD e EDTA é exotérmica. Portanto, mergulhando o frasco no banho de água favorece a troca de calor evitando o sobreaquecimento da mistura de reacção.
4. Adicionar 5,124 g (20 mmol, preparação de CDNSEDTA 1: 4) ou 10,248 g (40 mmol, preparação de CDNSEDTA 1: 8) de EDTA-dianidrido sob agitação intensa.
5. Após 3 h, remover o material sólido (CDNSEDTA 1: 4 ou CDNSEDTA 1: 8) a partir do balão com uma espátula e triturá-la grosseiramente com um almofariz e pilão.
6. Lavar o material sólido sobre papel de filtro com acetona à temperatura ambiente (100 ml x 5 vezes), com HCl 0,1 M (200 ml x 5 vezes), e água desionizada (200 mL x 3 vezes).
7. Finalmente, todo o material sólido seco ao ar à temperatura ambiente durante 48 h, triturá-la finamente num almofariz e pilão e depois mantê-lo sob vácuo (<15 mbar) durante 2 h a 45 ° C.

Figura 1:. Representação esquemática dos polímeros CDNSEDTA via sintética esquemática. Esquerda: Estrutura molecular do monómero β-ciclodextrina (β-CD) e agente de EDTA-dianidrido de reticulação. Na seta as condições gerais de reação. Certo:. Esboço do polímero reticulado Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Medidas de RMN HR-MAS

1. HR-MAS RMN Preparação de Amostras
   1. Prepara-se uma solução de 0,27 M de sal de sódio de ibuprofeno (IP) em água deuterada (99,8%).
   2. Adicionar 20 mg de CDNSEDTA 1: 4 e 2 mg de carbonato de sódio anidro (Na ₂ CO ₃₎ a 150 ul de solução preparada no ponto 2.1.1) para um frasco de vidro de 2 ml. Misturar o conteúdo do frasco com uma pequena espátula de modo a homogeneizar. Espera 2 horas antes de utilizar o gel formado com este procedimento. Repita este ponto para a CDNSEDTA 1: polímero 8.
   3. Inserir o gel num rotor RMN 5 milímetros adequados para experiências HR-MAS RMN usando uma pequena espátula. A quantidade total de gel para utilizar depende do volume interno do rotor (12 ul recomendado).
2. HR-MAS Experiências ¹ H RMN
   1. Defina os seguintes parâmetros instrumentais: rotor velocidade de rotação de 4 KHz na unidade de controle pneumático MAS, temperatura da amostra a 305 K na unidade de temperatura variável.
   2. Adquirir a ¹ H HR-MAS RMN Os espectros de ibuprofeno em CDNSEDTA (1: 4) e CDNSEDTA (1: 8) sistemas de polímero utilizando uma sequência de um pulso convencional na ressonância de protões.
      1. Criar um novo conjunto de dados. Clique na aba "AcquPars". Selecione o PULPROG: zg.
      2. Selecione o número de scans (NS = 4) e o tempo de atraso entre eles (D1 = 5 seg) .Set a largura espectral (SW = 8 ppm), o domínio do tempo (DT = 16K) eo ganho do receptor (RG = 32 ).
      3. Digite "zg" no console e haverá um decaimento livre (FID) na tela. Para processar o clique de dados na guia "ProcPars". Defina o tamanho espectral (SI = 32K), uma função de janela multiplicação exponencial (WDW = EM) e ampliação de linha (LB = 1).Digite "ft" para realizar a transformação Fourier. Fase do espectro utilizando o separador de fase na tela. Obter uma alta resolução espectro bem resolvida.

Figura 2: Os pares de pulso bipolar Longitudinal Eddy Delay atual (BPPLED) Sequência de impulsos Representação esquemática da sequência de pulso usado para executar os experimentos PFGSE.. O ciclo de fase para os 90 ° pulsos é: P1: (0) _16, P2: (0022) _4, P3: _{(0) 4 (2) 4} (1) 4 (3) 4 , P4: (0202 2020 1313 3131 ), P5: (0) ₄ (2) ₄ (1) ₄ (3) _4. Os 180 ° pulsos são + x. (modificado de ref.18) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. HR-MAS ¹ H RMN Experimentos PGSE
   NOTA: As experiências são realizadas usando PGSE a sequência de impulsos BPPLED ¹⁸ apresentados na Figura 2. Este é um pseudo experimento bidimensional com uma rampa gradiente aumentando linearmente a partir de 2% a 100% na dimensão indirecta. A intensidade do sinal é atenuado de acordo com o tempo de difusão Δ eo δ gradiente de pulso. A optimização destes parâmetros é necessária antes de executar correctamente uma experiência PGSE. A optimização é feito rodando algumas medições 1D em que Δ é mantido constante, enquanto δ é variada.
   1. parâmetros Optimization
      1. Criar um novo conjunto de dados - número de experimento 1. Clique na aba "AcquPars". Selecione o PULPROG: ledbpgp2s1d a seqüência de pulso 1D para a otimização de difusão.
      2. Selecione o número de scans (NS = 16) e o tempo de atraso entre eles (D1 = 10 sec). Definir a largura espectral (SW = 8 ppm), tele domínio do tempo (TD = 16K) eo ganho do receptor (RG = 32).
      3. Definir Δ (D20 na sequência) igual a um valor constante e δ (P30) a um valor experimental. Comece valor Δ = 50 ms, δ = 3 ms (valor máximo permitido para instrumentos de alta resolução).
      4. Leia o valor de frequência espectral (SFO1) a partir do experimento ¹ H e usar agora este valor. Definir a intensidade gradiente GPZ6 a 2%. Repita o passo 2.2.2.3. Utilize este espectro de referência para a otimização.
      5. No mesmo conjunto de dados criar o número de experimento 2. Observe todos os parâmetros experimentais. Aumentar a resistência gradiente GPZ6 a 95%. Repita o passo 2.2.2.3. Compare esse espectro com o espectro de referência usando o ícone de dois monitores e observar a mudança na intensidade do sinal.
         NOTA: Um espectro bem atenuada deve ter cerca de 5% da intensidade de sinal residual em comparação com o espectro de referência. Se a intensidade do sinal se perde, reduzir o valor de δ e restart o procedimento ponto 2.3.1 do ponto 2.3.1.3 até que o valor certo para δ é encontrado.
      6. Repita o procedimento de parâmetros de otimização no ponto 2.3.1 para todos os cinco Δ valores.
         NOTA: Escolha cinco valor para Δ = 50, 80, 110, 140 e 170 ms e otimizado a δ correspondente a 3, 2,7, 2,4, 2,1, 1,8 ms (por IP em CDNSEDTA 1: 8) e a ô a 2,7, 2,4 , 2, 1,7, 1,4 (para IP em CDNSEDTA em 1: 4).
   2. Aquisição do 2D Difusão conjunto de dados
      1. No mesmo conjunto de dados criar o número experimento 3, todos os parâmetros experimentais 1D será carregado. Digite "eda". Selecione o PULPROG: ledbpgp2s a seqüência de pulso 2D e alterar a parmode para 2D.
      2. Definir FnMODE = QF. Definir o DT no domínio do tempo em dimensão F2 igual a 32, o número de passos de gradiente. Todos os outros parâmetros estão definidos corretamente. Tipo "DOSY" e a rampa de inclinação será gerado e armazenado num ficheiro. o starte e os valores finais da rampa (2-95) são dados como parâmetros de entrada. A aquisição está agora começou.
4. Processamento de dados
   1. Tipo "XF2" para executar a transformação de Fourier na dimensão F2. Tipo "Abs2" para realizar a correcção da linha de base na dimensão F2. Tipo "setdiffparm" recordar os parâmetros experimentais (ô, ​​δ, e lista de gradiente) para a próxima etapa de processamento.
   2. Clique em "módulo de relaxamento T1 / T2" na aba análise e definir os picos a ser montados usando o primeiro espectro da experiência 2D. Definir os intervalos de pico e executar a instalação. As intensidades de sinal de cada passo do gradiente aplicado são obtidos.
      NOTA: As intensidades de sinal I (Q, T _d), para cada valor Δ, depende das variáveis ​​experimentais: pulso arquivado gradiente aplicado (g), variável de tempo (δ), proporção magnetogyric (γ) Q = (γgδ) de acordo com a o foequação llowing:
      
      com a MSD molecular = Z ^2.
   3. Exportar as intensidades de sinal de uma folha de cálculo e executar um ajuste linear dos dados para obter o valor de z ² para cada observado tempo de difusão t _d.
      NOTA: O valor MSD está relacionado com o tempo de observação de acordo com a t _d:
   4. Execute o gráfico log-log de ​​z ² versus t _d para cada valor experimental t _d. O valor de expoente α é o declive da regressão linear. Uma discussão mais exaustiva dos aspectos físicos das equações acima mencionados pode ser encontrado na ref. 21 e nas referências nele contidas.
      NOTA: Dependendo do valor dos α expoente, o regime de difusão é definida como: i) isotrópica difusão livre para α = 1, ii) subdiffusiv anómalaregime e para 0 <α <1, iii) regime superdiffusive anômala para α> 1.

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Resultados

Em primeiro lugar, aplicou esta metodologia a molécula do fármaco IP dissolvido em solução de água, a fim de verificar a viabilidade desta abordagem. A descrição completa dos resultados representativos podem ser encontrados em ref. 21. Em vez disso, vamos nos concentrar aqui sobre os aspectos metodológicos e a abordagem de porcas e parafusos para coleta e análise de dados de dados. A Figura 3 mostra, numa escala semi-logarítmica, o sinal experimental normalizad...

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Discussão

Nós apresentamos uma metodologia experimental para determinar o regime de difusão de uma molécula pequena fármaco encapsulado dentro de duas formulações representativas de hidrogéis CDNSEDTA. HR-MAS RMN PGSE permite a determinação do deslocamento quadrático médio de moléculas pequenas num determinado tempo de difusão (no intervalo de alguns milissegundos até segundos), seguida de monitorização distâncias nas escalas micrómetros. No intervalo observado (50 - 170 ms) é observado apenas um tipo de movime...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HR-MAS probe	BRUKER	N/A	Probe for NMR measurements on semi-solid samples
NMR Spectrometer	BRUKER	DRX 500	FT NMR spectrometer for liquid ans semi-solis state
β-cyclodextrin (β-CD)	Alfa-Aesar	J63161	Reagent
Ethylenediaminetetracetic (EDTA) dianhydride	Sigma-Aldrich	332046	Reagent
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Alfa-Aesar	D0798	Solvent
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283	Base (reagent)
Ibuprofen (IP) sadium salt	Sigma-Aldrich	I1892	Antinflammatory drug
Excel 2010	Microsoft	N/A	speadsheet for data analysis
Origin 8 SR0	OriginLab Co.		speadsheet for data analysis