Whole-body Espectrometria de Massa de imagem por infravermelhos matriz assistida por laser de Dessorção Ionização por Electrospray (IR-MALDESI)

Resumo

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Resumo

fontes de ionização ambiente para a espectrometria de massa (MS) foram objecto de muito interesse nos últimos dez anos. Laser assistida por matriz desorção com ionização por electrospray (MALDESI) é um exemplo de tais métodos, onde as características de laser assistida por matriz dessorção / ionização (MALDI) (por exemplo, a natureza de impulsos de dessorção) e ionização por electrospray (ESI) (por exemplo, macio-ionização ) são combinados. Uma das principais vantagens da MALDESI é a sua versatilidade inerente. Em experiências MALDESI, uma luz ultravioleta (UV) ou um laser de infravermelhos (IR) pode ser usado para excitar um ressonantemente matriz endógena ou exógena. A escolha da matriz não é analito dependente, e depende unicamente do comprimento de onda do laser usado para a excitação. Em experiências de RI-MALDESI, uma fina camada de gelo é depositado na superfície da amostra, tal como uma matriz de absorção de energia. A geometria da fonte de IV-MALDESI foi optimizado utilizando a concepção estatística de experiências (DOE) para análise de amostras líquidas, bem como Biolespécimes de tecidos ogical. Além disso, uma fonte de imagem robusta IR-MALDESI foi desenvolvido, em que um laser sintonizável mid-IV é sincronizado com um estágio de translação XY controlado por computador e um espectrómetro de massa de alta resolução de energia. A interface de usuário personalizada gráfica (GUI) permite ao usuário selecionar a taxa de repetição do laser, número de tiros por voxel, etapa do tamanho do estágio da amostra, e o atraso entre a dessorção e digitalizar eventos para a fonte. IR-MALDESI tem sido utilizado em várias aplicações, tais como a análise forense de fibras e corantes e MSI de secções de tecidos biológicos. Distribuição dos diferentes analitos que variam de metabolitos endógenos aos xenobióticos exógenos dentro de secções de tecido podem ser medidos e quantificados usando esta técnica. O protocolo apresentado neste manuscrito descreve os principais passos necessários para IR-MALDESI MSI de secções de tecido de corpo inteiro.

Introdução

Massa imagiologia espectrometria (MSI) no modo de desorção de microssonda envolve a amostra a partir de uma superfície por um feixe (laser ou iões) em localizações discretas sobre a superfície de uma amostra. Em cada ponto de quadriculação, um espectro de massa é gerado e os espectros adquiridos, juntamente com a localização espacial a partir do qual eles foram recolhidos, pode ser utilizado para mapear simultaneamente vários analitos numa amostra. Esta forma livre de rótulo de imagens acoplado à sensibilidade e especificidade de espectrometria de massa ajudaram a MSI tornou um dos campos mais rápida evolução em espectrometria de massa ^1,2.

assistida por matriz de dessorção / ionização por laser (MALDI) é o método de ionização mais comum utilizado para análises de MSI. No entanto, a necessidade de uma matriz orgânica e os requisitos de vácuo de MALDI representam limitações significativas na reprodutibilidade, o manuseamento das amostras, e os tipos de amostras que podem ser analisadas utilizando o método. Uma série de pressão atmosférica (AP) iométodos nização têm sido desenvolvidos nos últimos anos para contornar essas restrições ^3. Estes métodos de ionização ambiente permitir a análise de amostras biológicas em um ambiente que é muito mais perto de seu estado natural e simplificar amostra etapas de preparação antes da análise. Assistida de laser-dessorção matriz de ionização por electropulverização (MALDESI) é um exemplo de um tal método de ionização ^{de 4,5.}

Em experiências de RI-MALDESI, uma fina camada de gelo é depositado sobre a superfície do tecido como a matriz de absorção de energia. Um pulso de laser meados de IR é absorvida pela matriz de gelo, e facilita a dessorção de materiais neutros a partir da superfície por ressonantemente excitar o modo de OH de água alongamento. A partição neutros dessorvida nas gotículas carregadas de um electrospray ortogonal e são pós-ionizado de forma ESI-like ^4-6. A adição de gelo matriz exógena é preferível a confiar apenas na água endógeno nos tecidos, uma vez que ajuda a ACcontam para variações de teor de água em diferentes compartimentos de tecidos, e tem sido mostrado para melhorar dessorção ⁶ e melhorar a abundância de iões por ~ 15 vezes ^7,8 em experiências de imagiologia de tecidos.

Neste trabalho, nós utilizamos IR-MALDESI MSI para provocar a distribuição de metabólitos em diferentes órgãos de todo o corpo do rato neonatal. Uma visão geral dos parâmetros ajustáveis ​​de fonte IR-MALDESI é dado, e as medidas necessárias para a imagem latente bem sucedida de cortes de tecido são demonstrados.

Protocolo

Nota: O protocolo a seguir descreve todos os passos necessários para a realização de experimentos IR-MALDESI MSI. Em profundidade detalhes sobre a geometria otimizada da fonte de IR-MALDESI e sua sincronização com o laser, palco, e espectrômetro de massa pode ser encontrada em outros lugares ^5,6. amostras de tecido animal utilizados neste protocolo foram obtidos de acordo com a Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e regulamentos North Carolina State University.

1. Preparação do Tecido

1. Prepara-se uma banho de gelo isopentano / seco, colocando ~ 200 ml de isopentano, num copo limpo no interior de um contentor secundário de gelo seco numa hote. Use luvas de protecção e óculos de segurança em todos os momentos ao manusear o banho de gelo isopentano / seco e tecido.
   1. Eutanásia filhote de rato neonatal inteira 2 dias de idade por Avertin overdose (7,5 mg / g de peso corporal), e em seguida, congelar o tecido no banho de gelo isopentano / seco para preservar a estrutura do tecido. Use um pré-limpaed par de fórceps para colocar e retirar o filhote do rato na cryomold do banho de gelo isopentano / seco. Armazenar o tecido congelados rapidamente a -80 ° C até à análise.
2. Usando luvas de proteção, aplique uma camada de temperatura de corte óptima (OCT) meio de montagem para um disco criostato espécime 40 mm. Delicadamente, coloque o rato inteiro congelado no suporte do espécime outubro revestido a aderir mouse para o disco na orientação desejada para o corte.
   Nota: OCT é usada unicamente para aderir o tecido ao disco de amostra para seccionamento. Não tecido completamente incorporar em outubro e evitar o excesso de outubro é conhecido por ter efeitos prejudiciais sobre a análise MSI. Outros meios de comunicação, como a gelatina, pode ser usado para Cryo-incorporar o tecido antes de cortar o ^9.
3. Coloque o disco (com outubro e secção de tecido) no suporte de amostras Peltier no botão de energia Peltier criostato e imprensa. Esperar 10 min para a amostra entrar em equilíbrio térmico.
4. Coloque o disco de amostras (com o tecido montada sobre-la) no interior do suporte do disco, e enfrentar o tecido para baixo para o plano desejado para a análise. Cortar o tecido em secções com a espessura desejada à temperatura de -20 ° C utilizando o micrótomo rotativo alojado no interior do criostato ^10.
   Nota: Para a análise de todo o corpo, a fatia de tecido em secções de 25 um de espessura para manter a integridade do tecido. Para as regiões mais pequenas (por exemplo, fígado, cérebro, rins), a fatia de tecido em secções de 10 um de espessura.
   1. Utilizar a placa de vidro de barras estabilizadoras para evitar que a secção de tecido cortado de rolamento. Use a mangueira de vácuo criostato e escovas para remover restos de tecido indesejado. Uma vez que o tecido é seccionado, use o protetor de lâmina para cobrir a lâmina afiada micrótomo para evitar lesões pessoais.
5. Secção do rato oriental na placa de amostras e descongelar-montagem sobre uma lâmina de microscópio de vidro pré-limpo por trazer a lâmina mais perto possível para a secção de tecido, sem tocá-lo ^10.
   Nota: Para experi quantitativa MSImentos, revestir a lâmina com um padrão interno, utilizando um pulverizador pneumático automatizado antes da montagem do tecido, e descongelar-montagem da secção de tecido na lâmina revestida ^11.
6. Remova a lâmina micrótomo usado para o corte do tecido usando o ejetor de lâmina, e com segurança descartar a lâmina no recipiente apropriado "resíduos sharp".
7. Mantenha a lâmina de vidro no interior do criostato até Passo 3.2 para manter a criopreservação do tecido.

2. Preparação de IV-MALDESI / Calibração

1. Ligue o laser meados de IR e lançar o aplicativo de controle de laser no computador. Escolha do comprimento de onda desejado, utilizando a aplicação do laser de controlo fornecido pelo fabricante. experimentos IR-MALDESI são tipicamente realizada a 2940 nm.
   Nota: As experiências recentes investigaram a dependência de comprimentos de onda de laser meados de IR e da matriz de gelo com diferenças notáveis ​​que parecem ser específicos do analito ^8.
2. Ligue o veadoe controlador, iniciar o programa de controle de usuário personalizada (RASTIR) e calibrar a posição estágio utilizando o botão home.
3. Preparar a solução de electrospray. Tipicamente, usar uma mistura 50:50 (v / v) de metanol / água com ácido fórmico 0,2% para o solvente por electrospray em modo de ião positivo. Seleccionar a composição solvente electropulverização de acordo com a experiência. Por exemplo, usar o hidróxido de amónio 5 mM como modificador electrospray para aplicações de imagem no modo de iões negativos.
   Nota: Para a polaridade de comutação IR-MALDESI MSI, use ácido acético 1 mM como o modificador. Este modificador foi encontrado ideal para a obtenção de sinal estável e reprodutível em ambos os positiva e negativa de iões de modos ^12.
4. Encha uma seringa de 1 ml com solvente electrospray, e lavar o capilar de sílica com novo solvente.
5. Alinhar ESI emissor no eixo com o MS de entrada usando os parâmetros de origem, como a distância ESI-ponto, ponto de entrada de distância, altura da amostra e taxa de fluxo de solvente que foram otimizados utilizando DO estatística E para a análise de secções de tecido ^6. Nota: Consulte a Figura 1 para uma que descreve o esquema desses parâmetros e valores otimizados para MSI de secções de tecido.
6. Inicie a electropulverização e avaliar a sua estabilidade (> 10 min) através da monitorização da corrente iónica total (TIC) que, neste ponto, é constituído unicamente de compostos ambiente. Tipicamente, uma variação de TIC <10% ao longo de 10-15 min é uma boa indicação da estabilidade.

Figura 1. IR-MALDESI esquemática e parâmetros. (A) Esquema de configuração da fonte de IR-MALDESI (sem escala) e os parâmetros ajustáveis. (B) os valores dos parâmetros otimizados para geração de imagens de cortes de tecido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

title "> 3. Deposição de Ice Matrix

1. Atenção: Desligue o electrospray antes de colocar amostra no palco.
2. Coloque o tecido montada-descongelamento sobre a placa de amostra IR-MALDESI dentro da visão da câmera.
3. Certifique-se de mãos são claras do emissor ESI e reiniciar o electrospray.
4. Fechar a porta de acesso de origem e o invólucro de purga IR-MALDESI com azoto seco para evitar a condensação de água na superfície do tecido. Uma vez que a umidade relativa do ar no interior dos alcances de gabinete <3%, ligue a fonte de alimentação DC (~ 12 V) para a placa de Peltier, que irá arrefecer a placa de amostra. Nota: O processo de arrefecimento na fase de Peltier arrefecido é discutido em detalhe noutro local ^13.
5. Arrefece-se a fase de -9 ° C, e permitir que o tecido montado para chegar a um equilíbrio térmico (5-10 ~ minutos).
6. Pare purga de azoto e expor o tecido a uma humidade relativa ambiente ao abrir a porta de acesso de origem. Uma fina camada de gelo irá ser depositado sobre o cold superfície da fase de Peltier e montado secção de tecido devido a dessublimação de água a partir do ar.
   Nota: Se a humidade relativa no laboratório é inferior a 10-15%, colocar num copo de água quente no interior do invólucro para facilitar a formação da camada de matriz de gelo.
7. Depois de a camada de matriz de gelo é formada, fechar a porta de acesso e reiniciar o fluxo de azoto seco para reduzir a humidade relativa a 10 ± 2%. Ajustar o caudal de azoto para manter a humidade relativa a este nível, empiricamente encontrado como sendo o equilíbrio de formação de gelo e de sublimação para manter constante uma camada de gelo por todo o experimento ^6.

4. Espectrometria de Massa Aquisição de Dados de Imagem

1. Usando o RASTIR GUI (Figura 2), mova o palco para a posição de análise clicando no botão "posição do laser". Usar o diodo de ajuste do laser para assegurar uma região fora do tecido vai ser cauterizado. Disparar um tiro de laser em um re off-tecidosgião para calibrar o desvio em relação à visão da câmera laser. Clique no botão "Laser Teste de fogo" para atualizar a posição do laser.
2. Voltar para "posição CAMERA" e atualizar a posição do laser em RASTIR colocando o alinhamento do retículo do laser no local ablação a laser (Figura 2-1).
3. Clique na região do botão de interesse (ROI) e ajustar o tamanho ea posição de ROI para a secção de tecido que está sendo analisado (Figura 2-2). Entrada de parâmetros experimentais apropriados, tais como o tamanho do passo em direções X e Y (em mm) (Figura 2-3), e nomear o arquivo MSI na caixa "Nome do projeto" (Figura 2-4).
   1. Ao desenhar uma ROI, incluem uma parte de fora do tecido que serve como controle. Use esta seção off-tecido para o pico picking (Passo 5.4).
      Nota: O diâmetro dessorção (tamanho do ponto) do laser no tecido é de cerca de 150 um; No entanto, com resoluções espaciais mais elevadas pode ser obtida pela USIng a ^14,15 método oversampling.
4. Seleccione a frequência do laser apropriado na caixa suspensa, número de pulsos de laser por voxel (valores inteiros), e o atraso entre o gatilho laser e aquisição de sinal espectrômetro de massa (Figura 2-5). Normalmente, utilizam dois impulsos de laser por voxel a 20 Hz para desadsorver completamente material num experiências IR-MALDESI MSI, com um tempo de atraso de 10 ms para permitir que os iões gerados para alcançar o analisador de massa para a medição ^5.
   Nota: Escolha a mais alta taxa de repetição que o laser é capaz de operar a. Recentemente, foi demonstrado que o uso de maior taxa de repetição irá melhorar analito detecção ^16.

Figura 2. Interface do usuário para a operação IR-MALDESI MSI. Screenshot do programa RASTIR de Controle de Digitalização é apresentado. Os passos para performing uma experiência MSI são: (1) a localização do ponto de laser, (2) desenhando um ROI (3), escolhendo o tamanho do passo estágio (em mm), (4) dar um nome para o arquivo, (5) escolher o número correto de pulsos por voxel, juntamente com a taxa desejada repetição, e (6) a verificação da lista de imagem e configuração de MS. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Escolha parâmetros do espectrómetro de massa, como o modo de ionização, tensão electropulverização, taxa de fluxo de solvente, temperatura do capilar, e o tempo de injecção no software do espectrómetro de massa. Consulte a Tabela 1 para um exemplo dos parâmetros utilizados em todo o corpo IR-MALDESI MSI.
   Nota: devido à complexidade das amostras biológicas e a falta de métodos de separação em análises MSI, a fonte de IV-MALDESI é acoplado a um elevado poder de resolução e precisão elevada instrumento massa. Um método de aquisição pode ser carregado para analyses tais como monitoramento de reação paralela (PRM) ⁷ ou polaridade de comutação MSI ^12.
6. Uma vez que todos os parâmetros (laser, palco, e espectrômetro de massa) foram escolhidos, coloque o MS no modo de "aperto de mão" para sincronização, e começar a aquisição de MS.
7. Usando o software de imagem RASTIR, verificar todos os passos na lista de controlo (Figura 2-6) são completados por verificar caixas, e carregar o programa. Uma vez que o programa foi carregado, o botão "Run" estará disponível. Pressione Executar para iniciar a aquisição de sinal MSI.
8. Após a conclusão da experiência de imagem, pare aquisição espectrômetro de massa e coloque o instrumento em modo de espera. Desligue purga de azoto para o gabinete, desligue a fonte de alimentação à placa de Peltier, e desligue o controlador de palco e laser.
9. Abra a porta de acesso, retire a ponta emissor electrospray de dentro do gabinete da fonte, e remover o metal aquecido MS entrada estendida usando luvas de protecção. Atenção: O estendida de metal MS de entrada vai estar muito quente.
10. O uso de luvas e óculos de segurança, limpar a entrada de metal capilar extensas por ultra-sons em banho de ácido nítrico a 15% durante 10 min, em seguida, em água de grau HPLC, durante 10 min, e, finalmente, em metanol de grau HPLC, durante 10 min. Seque a entrada de metal capilar sob uma corrente de azoto, e reinsira em MS. Nota: Descarte solvente nas lixeiras apropriadas depois.

Parâmetro	Valor
modo de ionização	Positivo
electrospray Voltage
Solvente Caudal	2 ul / min
Temperatura capilar	275 ° C
Faixa de digitalização	m / z 250-1,000
Tipo de digitalização	Verificação completa
injeção Tempo	110ms
Poder de resolução

R "style =" width: 216px; "> 3,8-4,2 kV width: 216px; "> 140.000

Tabela 1. Parâmetros instrumento utilizado em todo o corpo IR-MALDESI MSI.

Análise 5. Os dados

1. Converter os arquivos de dados brutos gerados pelo instrumento de formatos de dados, tais como mzXML ¹⁷ ou imzML ¹⁸ utilizando software livre como MSConvert ¹⁷ e imzML conversor ^19.
2. Comece MSiReader v1.0, um software de código aberto desenvolvido para a análise de alta-resolução de energia do data MSI ^20, em um computador de processamento dedicado. Carregar o arquivo de imagem para MSiReader. Para a interface do usuário do MSiReader e alguns de seus recursos internos, consulte a Figura 3.
3. Gerar mapas de íon de analitos de interesse introduzindo sua m / z e escolha uma janela de m / z apropriada em partes por milhão (ppm) ou Thomson (Th) (Figura 3-1). Para instrumentos de alta resolução de energia (RP)escolher uma janela na faixa de baixa ppm.
   Nota: A janela m / z apropriada depende da RP e a precisão da medição de massa (MMA) do instrumento que a fonte de IV-MALDESI é acoplado a.
4. Além disso interpretar os dados usando os recursos integrados, como a interpolação (Figura 3-2), a normalização (Figura 3-3), sobreposição de imagem óptico (Figura 3-4), eo pico da colheita (Figura 3-5) ^20.

Figura 3. Interface do usuário de MSiReader; v1.0 ^20. Uma vez que um arquivo é carregado para o software, mapas de íon de analitos de interesse são exibidos por (1) introduzindo o m / z e tolerância em ppm ou Th. Uma análise adicional, tal como (2) ou de interpolação (3) normalização pode também ser realizada. Uma imagem óptica do tecido também podem ser importados e sobrepostos comos mapas de iões (4) para melhor visualização. Para não segmentados analisa o pico função (5) escolhendo pode ser usado para extrair picos de tecidos específicos, escolhendo a área de tecido (linha magenta) e uma área de referência off-tecido (caixa verde). Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

5. Use a função de pico de colheita para gerar uma lista de valores m / z de tecidos específicos, utilizando critérios definidos pelo usuário. Nota: O algoritmo PeakFinder usa as diferenças de espectro de massa média de duas regiões. Estes valores m / z podem então ser comparados com bancos de dados de metabólitos como METLIN ²¹ ou LIPID MAPS ^22.
   1. Consulte a Figura 3 para um exemplo de escolher uma região interrogado tecido (magenta polígono ROI) e na região de referência off-tecido (verde polígono ROI).

Resultados

As imagens apresentadas na Figura 4 mostram a distribuição espacial dos metabolitos em diferentes órgãos na secção de tecido do corpo inteiro. Valores exclusivos m / z para regiões específicas do corpo foram encontrados usando MSiReader PeakFinder, seguido de processamento em lote para a geração de imagem. A ferramenta de imagem de sobreposição (Figura 3-4) foi utilizado para alinhar a imagem óptica tomadas antes de deposição de m...

Discussão

O protocolo acima descreve as principais etapas para a realização de um experimento IR-MALDESI MSI. O processo de aplicação de matriz (secção 3) leva aproximadamente 20 minutos, o que é semelhante a um processo de aplicação de matriz típico para experiências MALDI MSI por sublimação ou de revestimento por pulverização usando um pulverizador robótico. Além disso, IR-MALDESI não depende de particionamento de analitos para os cristais de matriz ^6, e a matriz de gelo pode ser usado universalment...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
IR-MALDESI Source	Custom-made	N/A	Please refer to references 4 and 12 for an in-depth discussion of IR-MALDESI source development.
Q Exactive Plus	Thermo Scientific		Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer
Water, HPLC Grade	Burdick & Jackson	AH365-4
Methanol, HPLC Grade	Burdick & Jackson	AH230-4
Formic Acid	Sigma Aldrich	56302
Tunable mid-IR Laser	Opotek Inc.	IR Opolette	Tunable 2,700-3,100 nm IR OPO laser
Nitrogen Gas	Arc3 Gases	AG S-NI300-5.0	Grade 5.0 high purity nitrogen gas cylinder (300)
Cryostat	Leica Biosystems	CM 1950	Cryomicrotome
High Profile Microtome Blades	Leica Biosystems	3802123	Leica DB80HS
Mounting Medium (OCT)	Leica Biosystems	3801480	Surgipath FSC 22 mounting medium
Cryostat Specimen Disc	Leica Biosystems	14047740045	40 mm diameter
Glass Microscope Slides	VWR	48312-003	Frosted, selected, pre-cleaned