Geração de mutantes sem marcadores marcados e no modelo de cianobactérias da espécie

Resumo

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Resumo

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introdução

As cianobactérias são um filo antiga e diversificada evolutivamente de bactérias encontradas em quase todos ambiente natural na Terra. Em ecossistemas marinhos são particularmente abundantes e desempenham um papel fundamental em muitos ciclos de nutrientes, sendo responsável por cerca de metade da fixação de carbono ^1, a maioria da fixação de nitrogênio ² e centenas de milhões de toneladas de produção de hidrocarbonetos ³ nos oceanos anualmente. Cloroplastos, a organela responsável pela fotossíntese em algas e plantas eucariótica, são susceptíveis de ter evoluído de uma cianobactéria que foi engolida por um organismo hospedeiro ^4. As cianobactérias provaram organismos modelo útil para o estudo da fotossíntese, transporte de electrões ⁵ e vias bioquímicas, muitos dos quais são conservados em plantas. Em adição cianobactérias são cada vez mais utilizados para a produção de alimentos, biocombustíveis ^{6, 7} e electricidade industriais compostos ^8, devido à sua oiconversão ghly eficiente de água e CO ₂ a biomassa usando a energia solar ^9. Muitas espécies podem ser cultivadas em terras não-aráveis ​​com nutrientes mínimos e água do mar, o que sugere que as cianobactérias potencialmente poderiam ser cultivadas em grande escala, sem afetar a produção agrícola. Certas espécies também são fontes de produtos naturais, incluindo antifúngicos, antibacterianos e anti-câncer compostos ^10,11.

A capacidade de gerar mutantes é a chave para a compreensão de cianobactérias fotossíntese, bioquímica e fisiologia, e essencial para o desenvolvimento de cepas para fins industriais. A maioria dos trabalhos publicados produzir estirpes geneticamente modificados por inserção de uma cassete de resistência a antibiótico no local de interesse. Isto limita o número de mutações que podem ser introduzidas numa estirpe, como apenas algumas cassetes de resistência aos antibióticos estão disponíveis para uso em cianobactérias. Estirpes que contêm genes que conferem re antibióticosistance não pode ser usado para a produção industrial em lagoas abertas, o que é susceptível de ser o único meio de baixo custo para a produção de biocombustíveis e outros produtos de baixo valor ^12. A geração de mutantes sem marcação supera essas limitações. mutantes não marcadas não contêm DNA estranho, a não ser intencionalmente incluídos, e pode ser manipulado diversas vezes. Por isso, é possível gerar o maior número de alterações em uma cepa como desejado. Além disso, os efeitos polares de genes a jusante do local de modificação pode ser minimizado, permitindo a modificação mais preciso do organismo ^13.

Para gerar estirpes mutantes, plasmídeos suicidas contendo dois fragmentos de ADN idênticos às regiões no cromossoma de cianobactérias que flanqueiam o gene a ser suprimido (denominado a 5 'e 3' que flanqueiam regiões) são construídos em primeiro lugar. Dois genes são então inserida entre estas regiões flanqueadoras. Uma delas codifica uma proteína de resistência a antibiótico; o segundo codifica SacB, que produces levanossacarase, um composto que confere sensibilidade à sacarose. Na primeira fase do processo, os mutantes marcadas, as estirpes ou seja, contendo algum ADN estranho, são gerados. A construção de plasmídeo é misturado com as células de cianobactérias e o ADN é tomado naturalmente pelo organismo. Os transformantes são seleccionados por crescimento em placas de agar contendo os antibióticos apropriados e o genótipo mutante verificada por PCR. plasmídeos suicidas não pode replicar dentro da estirpe de interesse. Portanto, quaisquer colónias resistentes ao antibiótico irá resultar a partir de um evento de recombinação em que o gene de interesse é inserida no cromossoma. Para gerar mutantes não marcados, o mutante marcada é, em seguida, misturado com um segundo plasmídeo suicida contendo apenas as regiões f lanqueadoras 5 'e 3'. No entanto, se for necessária a inserção de ADN estranho, num plasmídeo que consiste em 5 'e 3' com regiões de uma cassete que contém os genes de interesse inserido entre estes fragmentos de ADN de flanqueamento, pode ser utilizado. Selecção é através de crescimento em placas de agar contendo sucrose. Como a sacarose é letal para as células quando o produto do gene sacB é expresso, as únicas células que sobrevivem são aquelas nas quais ocorreu um segundo evento de recombinação, em que o gene de sensibilidade de sacarose, em adição ao gene de resistência aos antibióticos, foi recombinado para fora do cromossoma e para o plasmídeo. Como consequência da permuta de recombinação, as regiões f lanqueadoras e qualquer ADN entre eles são inseridos no cromossoma.

Temos utilizado com sucesso destes métodos para gerar múltiplas mutações cromossómicas na mesma estirpe de Synechocystis sp. PCC6803 (doravante referida como Synechocystis) ^13,14, para introduzir mutações pontuais em um gene de interesse ¹³ e para a expressão de cassetes de genes. Enquanto a geração de nocautes não marcado foi demonstrada antes de nosso trabalho em Synechocystis ^15,16, um método detalhado, auxiliado poruma apresentação visual dos passos críticos, não está disponível publicamente. Nós também aplicaram o mesmo método para geração de nocautes marcados em outro cianobactéria modelo, Synechococcus sp. PCC7002 (doravante referida como Synechococcus). Este protocolo fornece um método claro, simples para a geração de mutantes e um protocolo rápido para validar e armazenar estas estirpes.

Protocolo

1. Preparação de Meios de Cultura

1. Preparar o meio de acordo com a BG11 Castenholz, 1988 ^17.
   1. Preparar soluções estoque de BG11 100x, oligoelementos e estoque de ferro (Tabela 1).
   2. Prepare soluções separadas de partida de fosfato, Na ₂ CO ₃ estoque, N - [Tris (hidroximetil) metil] -2-aminoetanossulfónico (TES) e tampão de NaHCO ₃ (Tabela 1).
   3. Autoclave o fosfato e Na ₂ CO ₃ stocks. Filtrar-esterilizar tampão TES e _NaHCO3 com 0,2 mm filtros.
   4. Prepare BG11 através da combinação de 976 ml de água, 10 ml de 100x BG11, 1 ml de elementos vestigiais e 1 ml de estoque de ferro e autoclave a solução. Após esta solução ter arrefecido até à temperatura ambiente, adiciona-se 1 ml de partida de fosfato, 1 ml de Na ₂ CO ₃ estoque e 10 ml de _NaHCO3.
   5. Para BG11 meio sólido, adicione 15 g de ágar e 700 ml de água a um flask. Para o segundo balão, adicionar 3 g de Na ₂ S ₂ O _3, 226 ml de água, 10 ml de 100x BG11, 1 ml de elementos vestigiais e 1 ml de estoque de ferro. Autoclave ambas as soluções. Após estas soluções têm arrefecida até à temperatura ambiente, combiná-los e adicionar 1 ml de partida de fosfato, 1 ml de Na ₂ CO ₃ estoque, 10 ml de tampão TES, e 10 ml de _NaHCO3.
      NOTA: As soluções são preparadas separadamente para evitar a precipitação de alguns sais.
2. Para a selecção em sacarose, preparar um 50% (w / v) de solução de sacarose. Filtro de esterilizar a solução com 0,2 uM filtros e adicionar ao BG11 (100 ml de sacarose a 50% para 900 mL de BG11) para produzir BG11 / 5% de sacarose placas.
   Nota: Não adicionar NaHCO ₃ a BG11 / 5% placas de agar de sacarose. Adicionar Na ₂ CO ₃ como normal.
3. Para a cultura de Synechococcus adicionam-se 10 ml de 1 M de 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-ácido etanossulf único, N - (2-hidroxietil) piperazina-NR42; - (2-etanossulfónico) (HEPES) e 1 ml de vitamina B ₁₂ (Tabela 1) a 1 L de meio de BG11.
   Nota: Transformação de estirpes cultivadas em meios BG11 disponível comercialmente é significativamente menos eficiente do que nas receitas media BG11 aqui descritos e, portanto, não é recomendado.

2. Crescimento das Estirpes cianobactérias

1. Cultura estirpes em 100 ml garrafas cónicas com um volume máximo de 50 ml e agitar a 120 rpm. Selar as placas com parafilme e BG11 punção três pequenos orifícios no lado da placa para permitir a troca de gás. Incubar todas as estirpes a 30 ° C sob lâmpadas fluorescentes em um fotobiorreactor com uma intensidade de luz entre 20-40 umol fotões ^{m-2 s-1.}
2. Usar as melhores técnicas estéreis. Lidar com todas as linhagens de cianobactérias em uma capela de fluxo laminar.
   Nota: Isto é especialmente importante quando as estirpes são cultivadas com meio contendo sacarose, o qual pode ser facilmente contaminated.

3. Geração do plasmídeo Constructos

1. Desenho conjuntos de iniciadores, incluindo os locais necessários de enzimas de restrição, utilizando software de desenho de iniciadores, tais como Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), para amplificar dois ~ 1 kb regiões 5 'e 3' do gene de interesse. Consulte a sequência do genoma das espécies de cianobactérias via Cyanobase (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase). Ver Tabela 2 para todos os iniciadores utilizados aqui. Ao projetar primers considerar os seguintes fatores:
   1. Certifique-se de que as regiões amplificadas incluir regiões 5 'e 3' do gene que vai ser mutada, por exemplo, Figura 1.
   2. Não se transformar regiões intergênicas para evitar a mutação não intencional de antisense e RNAs não-codificantes. Para a geração dos mutantes em Synechocystis, referem-se a lista de sítios de início da transcrição documentados em Mitschke et al., 2011 ^18, a fim de evitar a mutação de anti-sentidoou RNAs não-codificantes.
   3. Ao escolher as regiões flanqueadoras não incluir a totalidade da grelha de leitura aberta de genes adjacentes como expressão destes genes em Escherichia coli pode interferir com a clonagem.
2. Amplificar produtos por PCR utilizando ADN-polimerase de alta fidelidade de acordo com as instruções do fabricante.
   Nota: Em nossa experiência esta enzima produz alguns erros.
   1. Defina-se reacções de PCR de 50 ul contendo tampão de HF e de 0, 1,5 ou 3 ul de DMSO. Use 100 ng de ADN genómico por reacção. Utilizar um programa que consiste em um passo de desnaturação inicial de 98 ° C durante 30 seg, 35 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 67 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg, seguido por um passo final de extensão de 72 ° C durante 5 min. Isto dá tipicamente produtos consistentes.
3. Os produtos de PCR e verificar amostras digerido com as enzimas de endonuclease para o tamanho correcto através de electroforese em gel. Corra 1% (w / v) de geles de agarose contendo 0,02%(V / v) de brometo de etídio durante 45 min a 100 V.
   CUIDADO: O brometo de etídio é um agente mutagênico potencial e deve ser manuseado com proteção adequada.
4. Purifica-se os produtos de PCR utilizando um kit de purificação de ADN de acordo com as instruções do fabricante. Também usar este kit para a purificação de fragmentos de plasmídeos, incluindo peças cortadas de géis de agarose. Elui-se o ADN purificado em 14 uL de água.
5. Para os passos de clonagem, incubar as misturas reaccionais para endonucleases de restrição a 37 ° C durante> 1 hora num volume total de 30 ul de acordo com as instruções do fabricante.
6. Para passos de ligação, os fragmentos de ADN ligadura à temperatura ambiente durante> 1 hora num volume total de 20 uL, contendo 5 ul de plasmídeo digerido purificado, 12 ul de inserção digerido purificado, 2 ul de tampão e 1 ul de ligase.
7. Preparar células transformantes de Escherichia coli DH5a de acordo com o método seguinte.
   1. Crescer um dia para o outro E. coli Cultura em 10 ml de Luria Bertani (LB) de mídia.
   2. Inocular 400 ml de LB num frasco cónico de 1 L contendo 6 ml de 1 M _{de MgCl2} (Tabela 1) com 1 ml da cultura durante a noite.
   3. Crescer a cultura a 37 ° C a 220 rpm durante cerca de 4 h ou até que OD _{600 nm} alcança 0,4-0,6.
   4. Coloque as células em gelo durante 1 hora.
   5. Centrifugar a 2.800 xg durante 10 min para sedimentar as células a 4 ° C.
   6. Remover o sobrenadante e ressuspender em 160 ml de solução A (Tabela 1) e incubar em gelo durante 20 min.
   7. Centrifugar a 2.800 xg durante 10 min para sedimentar as células a 4 ° C.
   8. Remover o sobrenadante e ressuspender em 4 ml de solução A + glicerol (Tabela 1).
   9. Prepare 50 mL alíquotas, congelar no _N2 líquido, armazenar a -80 ° C.
   10. Misturar 5 ul de mistura de ligação com 50 ul de células competentes e incubar durante 1 hora em gelo.
   11. Choque térmico às células a 42 ° C durante 90 seg, seguinconduzido por incubação em gelo durante 2 min.
   12. Adicionar 950 ul de meio LB (Tabela 1) e incuba-se a 37 ° C durante 1 h.
   13. Alíquota de 50 e 200 ul em placas com o antibiótico adequado, quer de ampicilina (100 ug / ml) e / ou canamicina (30 ug / ml).
       ATENÇÃO: Tanto canamicina e ampicilina são tóxicos e devem ser manuseados com proteção adequada.
   14. Escolha e incubar colónias individuais em 2 ml de meio LB inoculados com o antibiótico apropriado.
8. Purifica-se todos os plasmídeos utilizando um kit de purificação de plasmídeo miniprep de acordo com as instruções do fabricante.
9. Gerar plasmídeos, neste exemplo específico de bater para fora os genes cpcC1C2, de acordo com os seguintes passos.
   1. Amplificar a região flanqueadora 1012 pb 5 '(fragmento esquerdo) utilizando iniciadores cpcC1C2leftfor e cpcC1C2leftrev (Ver passo 3.2, Tabela 2). Retirar uma pequena quantidade da reacção de PCR e confirmar se aproduto tamanho correto foi amplificado através de eletroforese em gel (passo 3.3). Digerir este fragmento e pUC19 com Xba I e Bam Hl (passo 3.5).
   2. Purificar ambas as preparações (passo 3.4), ligadura (passo 3.6), transformar (passo 3.7) e criou quatro 2 ml culturas líquidas LB com ampicilina (100 ug / ml) a partir de colônias separadas para purificação de plasmídeo via minipreps (passo 3.8).
   3. Entrada para a inserção do fragmento em pUC19 através de digestão com Xba I / Bam HI e electroforese em gel (passo 3.3). Bandas de 2.660 pb e 1.012 pb indicam introdução correcta da inserção no plasmídeo.
   4. Amplificar a região adjacente 1.016 bp 3 '(fragmento direita) usando primers cpcC1C2rightfor e cpcC1C2rightrev (Veja o passo 3.2, Tabela 2). Retirar uma pequena quantidade da reacção de PCR e confirmar se o produto de tamanho correcto foi amplificado por meio de electroforese em gel (passo 3.3). Digerir este fragmento e pUC19 com Sac I e Eco RI (step 3.5).
   5. Purificar ambas as preparações (passo 3.4), ligadura (passo 3.6), transformar (passo 3.7) e criou quatro 2 ml culturas líquidas LB com ampicilina (100 ug / ml) a partir de colônias separadas para purificação de plasmídeo via minipreps (passo 3.8).
   6. Entrada para a inserção do fragmento em pUC19 através de digestão com Sac I / Eco RI (passo 3.5) e electroforese em gel (passo 3.3). Bandas de 2.660 pb e 1.016 pb indicam introdução correcta da inserção no plasmídeo.
      Nota: Xba I / Bam HI de locais para a clonagem da região 5 'e Sac I / Eco RI para a clonagem da região 3' em pUC19 são usados ​​sempre que possível. Se possível, sempre incluir um local BamHI no iniciador inverso para "região ou o iniciador directo para a extremidade 3 'da região 5 para garantir que as etapas de clonagem mais tarde são mais fáceis de executar.
   7. Sequência de ambos os insertos para determinar se a sequência estiver correcta utilizando iniciadores que abrangem o sítio de inserção, por exemplo, M13 para a frente e reverso M13 (Tabela 2). A sequência deve ser correta para garantir que não haja erros são introduzidos em regiões de flanqueamento.
   8. Excisar o fragmento esquerdo de pUC19 através de Xba I / Bam HI digestão. Digerir o pUC19 + fragmento incorrectamente com Xba I / Bam HI (passo 3.5).
   9. Purificar o fragmento deixou 1.012 pb e 3.676 pb pUC19 + fragmento de direito a partir de um gel de agarose (passo 3.3) através de excisão do DNA usando uma lâmina de bisturi.
   10. Purificar ambas as preparações (passo 3.4), ligadura (passo 3.6), transformar (passo 3.7) e criou quatro 2 ml culturas líquidas LB com ampicilina (100 ug / ml) a partir de colônias separadas para purificação de plasmídeo via minipreps (passo 3.8).
   11. Entrada para a inserção do fragmento em pUC19 + fragmento direito através de Xba I / Bam Hl de digestão (passo 3.5) e electroforese em gel (passo 3.3). Bandas de 3.676 pb e 1.012 pb indicam a inserção correta da inserção no plasmídeo (referem a isso como plasmídeo B).
   12. Excise o NPT1 / sacB cassete do pUM24cm ¹⁹ via Bam HI digestão. Digest plasmídeo B com BamHI (passo 3.5).
       Nota: A cassete NPT1 / sacB não tem de ser purificada a partir de géis de agarose, uma vez pUM24cm codifica uma proteína que confere resistência ao cloranfenicol. Portanto, se as colónias são cultivados em LB / ampicilina / canamicina placas de agar a única combinação possível que levará a colónias resistentes é a incorporação do NPT1 / cassete sacB no plasmídeo B.
   13. Purifica-se ambas as preparações (passo 3.4), ligadura (passo 3.6), transformar (passo 3.7) e definir-se quatro 2 ml culturas líquidas de LB com ampicilina (100 ug / ml) e canamicina (30 ug / ml) a partir de colónias independentes para a purificação de plasmídeo através de mini-preparações (passo 3.8).
   14. Entrada para a inserção do NPT1 / cassete de sacB no plasmídeo B através da digestão com BamHI (passo 3.5) e electroforese em gel (passo 3.3). Bandas de 4688 pb e 3.894 pb indicam a inserção correta de the inserir no plasmídeo (referem a isso como plasmídeo A).
   15. Em alternativa, a extremidade cega / cassete NPT1 sacB e o clone em um local de endonuclease de restrição diferente entre os fragmentos esquerdo e direito no plasmídeo B. A / cassete de sacB NPT1 deve ser clonado entre os fragmentos esquerdo e direito.
       Nota: Se a expressão de uma cassete externa é necessária, então esta deve ser inserido entre os fragmentos esquerdo e direito do plasmídeo B. Este plasmídeo é então utilizado nos passos knockout não marcados.

4. Geração de Marcadas Mutantes Synechocystis e Synechococcus

1. Configurar uma cultura fresco inoculando um ciclo completo de células em 30-50 ml de meio BG11. Crescer a cultura durante 2-3 dias a _750nm OD = 0,2 a 0,6.
   Nota: Normalmente as colónias individuais são demasiado pequenos para usar-se para a inoculação e a exposição das células individuais, mesmo para níveis baixos de luz irá resultar em fotoinibição e selecçãopara os mutantes resistentes luz.
2. Centrifugar 1-2 ml da cultura a 2.300 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Não centrifugar quaisquer culturas de cianobactérias em> 2.300 xg, pois isso pode danificar as células. Lava-se a pelete uma vez com meio BG11.
   Nota: Não ressuspender as células em vortex como isto pode resultar em perda de pili que são essenciais para a absorção de ADN. Ressuspender as células por pipetagem suave.
3. Adicionar meio BG11 para um volume final de 100 ul. Transferência de células para um tubo de 14 ml de fundo redondo.
4. Adicionar 1 ug de plasmídeo A e para as células Misturar agitando ligeiramente. Adicionar <10 ul de plasmídeo.
   Nota: De um modo preferido o plasmídeo deve estar a uma concentração de> 100 ng / ul, mas concentrações mais baixas do que isso são adequados para a transformação bem sucedida.
5. Colocar os tubos para baixo horizontalmente na incubadora. Incubar as culturas de 4-6 hr.
   Nota: As células podem ser misturada brevemente tocando cada 1-2 horas, mas isto não é essencial. As amostras podem ser colocadas em umagitando incubadora embora este não melhorar significativamente a eficiência.
6. Espalhe-se alíquotas da mistura de ADN de cultura de células / plasmídeo em placas de agar BG11 sem antibióticos. Tipicamente, 20 uL e 80 mL alíquotas são espalhadas em placas separadas.
7. ~ 24 horas mais tarde, adicionar 2,5-3 mL de 0,6% solução de agar em água contendo canamicina (por 20 mL: 0,12 g de agar, 100 uL de 100 mg / ml de canamicina) para a placa de agar. Arrefecer a solução a ~ 42 ° C, e adicionar à borda da placa de agar. Inclinar a placa de modo que a solução forma um mesmo 'ágar de topo' camada na superfície.
8. Incubar as placas de ágar por um novo período de tempo. Colónias deve ser visível após aproximadamente 7 dias.
   Nota: As placas de agar podem ser empilhados 3 elevado em uma incubadora. Tipicamente centenas de colónias são obtidos por transformação.
9. Streak colónias individuais sobre BG11 + canamicina (30 ug / ml) em placas de agar. Divida a placa de agar em 6 setores e use um palito fim brusco à raia foraas colônias mais de cada sector. A obtenção de colónias isoladas não é importante apenas o crescimento dos transformantes.
10. Confirmar nocaute marcada por PCR utilizando polimerase do ADN de Taq de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar 2 mL de _MgCl2 (25 mM) por reacção.
    1. Retirar uma pequena proporção das células e transferir para um tubo contendo 50 ul de água e 20 ~ ^ M 425-600 esferas de vidro. Agitar num vibrador durante 5 min a ~ 2000 rpm. Centrifuga-se a 15700 xg durante 5 min e utilizar 5 ul de sobrenadante por 50 ul de reacção de PCR.
       Nota: Não ressuspender a solução. Os restos celulares precisa de ficar no fundo do tubo.
11. validar mutantes
    1. primers de design que abrangem a região do knockout usando software de desenho de primer (como Primer3). iniciadores de desenho a partir de ~ 200 pb de cada lado da região de nocaute.
       Nota: Os Primers para verificar o mutante cpcC1C2 são apresentadas na Tabela 2e são denominadas cpcC1C2for e cpcC1C2rev.
    2. Amplificar produtos usando um programa que consiste em um passo de desnaturação inicial de 95 ° C durante 2 min, 35 ciclos de 95 ° C durante 1 min, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min por kb de sequência, seguido de um passo de extensão final de 72 ° C durante 5 min. Incluir um controlo de tipo selvagem. Isto dá tipicamente produtos consistentes.
    3. Verificar o genótipo através de electroforese em gel. Knockout transformantes marcados irão mostrar uma banda de ~ 4 kb (0,2 kb a partir de ambos os fragmentos esquerdo e direito, mais o NPT1 / cassete sacB) e a ausência da banda de tipo selvagem (Figura 2).
       Nota: Em certos casos, uma banda de ~ 4 kb não é observada no mutante marcada, devido ao grande tamanho do produto de PCR. No entanto, se uma banda correspondente ao tamanho esperado do tipo selvagem não é observada, em seguida, tipicamente, esta estirpe é um nocaute marcado.
12. Se uma banda de tipo selvagem ainda está presente, em seguida, re-raia a pressão sobre aBG11 fresco + canamicina (30 ug / ml) em placa de ágar e repetir a PCR. Repetir o processo de re-estrias até que o mutante é segregada para que nenhuma banda de tipo selvagem é observado na reacção de PCR.
    Nota: O aumento da quantidade de canamicina para uma concentração de 50 ug / ml, em seguida, 100 ug / ml, por vezes, é essencial, a fim de segregar um mutante marcada totalmente.
13. Se a tensão mostra um perfil mutante marcada via PCR, em seguida, re-raia em um BG11 fresco + canamicina (30 ug / ml) em placa de ágar. Use esta estirpe para gerar o nocaute não marcado.
    Nota: O protocolo pode ser utilizado para gerar mutantes marcadas com apenas uma cassete de resistência a antibióticos ou seja, através da substituição do / cassete sacB NPT1 com apenas a cassete de NPT1 pUC18K ²⁰ entre os fragmentos esquerdo e direito..

5. Geração de Unmarked Synechocystis Mutantes

1. Configurar uma nova cultura da knockout marcado por inoculação de um circuito cheio de cells em 30-50 ml de meio BG11. Crescer a cultura durante 2-3 dias a _750nm OD = 0,2 a 0,6.
2. Centrifugar 10 ml da cultura a 2.300 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Lavar uma vez com meio BG11.
   Nota: Não ressuspender as células em vortex como isto pode resultar em perda de pili que são essenciais para a absorção de ADN. Ressuspender as células por pipetagem suave.
3. Adicionar BG11 para um volume final de 200 ul. Transferência de células para um tubo de 14 ml de fundo redondo.
4. Adicionar 1 mg de DNA do plasmídeo para as células B e misturar agitando ligeiramente.
5. Incubar as amostras durante 4-6 h. Coloque tubos para baixo horizontalmente.
   Nota: As células podem ser misturada brevemente tocando cada 1-2 horas, mas isto não é essencial. As amostras podem ser colocadas em um incubador com agitação, embora isto não melhorar a eficiência.
6. Adicionar 1,8 ml de meio BG11 e incubar as amostras durante um total de 4 dias, com agitação. Este tempo é suficiente para permitir que a recombinação ocorra nas múltiplas cópias cromossómicas.
7. alíquotas de chapa da mistura de transformação em BG11 / 5% placas de agar de sacarose. Placa 50 ul, 10 ul e 1 ul por placa de ágar. Se um relvado colónia aparece em todas estas placas de agar diluir ainda mais a solução e aliquota em placas frescas. Colónias deve ser visível após aproximadamente 7 dias.
8. Remendo 30-50 colónias individuais sobre BG11 + canamicina (30 ug / ml) placas de agar primeiros e BG11 / 5% de placas de agar de sacarose segundo, utilizando um palito de extremidade embotada. Todas as bactérias que crescem em BG11 / 5% de sacarose placas mas as placas não BG11 + canamicina são potenciais nocautes isolado. As bactérias que crescem em ambas as placas são susceptíveis de ser resistente à sacarose devido a uma mutação no gene sacB.
9. Verifique nocautes não marcadas usando os mesmos iniciadores e método que foi utilizado para verificar os furos marcados. Ex cpcC1C2for e cpcC1C2rev (Tabela 2) para verificar o nocaute não marcado cpcC1C2. Um nocaute não marcado irá mostrar uma banda em um gel de agarose correspondente tO tamanho do tipo selvagem menos a região eliminada (Figura 2).
10. Se a estirpe mostra um perfil não marcado mutante por meio de PCR (passo 4.11.2) e electroforese em gel (Figura 2), em seguida, re-raia numa placa de agar BG11 fresco sem antibióticos.

6. armazenamento de longo prazo de cepas

1. Defina-se uma cultura fresca da estirpe através da inoculação de um ciclo completo de células em 30-50 ml de meio BG11. Crescer a cultura durante 3-4 dias a _750nm OD = 0,4 a 0,7.
2. Lave as células uma vez com BG11 e ressuspender em ~ 2 ml de BG11.
3. Adicionar 0,8 ml de células concentradas para um tubo. Em seguida, adicionar 0,2 ml de 80% de glicerol esterilizado por filtração.
4. Opcional: adicionar 0,93 ml de células concentradas para outro tubo. Adicionar 0,07 ml de DMSO a este tubo.
   CUIDADO: DMSO é tóxico e deve ser manuseado com proteção adequada.
5. Armazenar ambos os tubos a -80 ° C. Para reviver tensões remover o tubo e raspar algumas células com um dente sem corteescolher em uma placa de ágar sem antibióticos. Streak como normal usando um loop estéril.

Figura 1: construção do plasmídeo para a geração de orifícios marcadas e não marcadas, por exemplo cpcC1 e cpcC2 em Synechocystis (a) uma região do genoma de Synechocystis em que (B) e cpcC1 cpcC2 e genes adjacentes estão localizados.. Realçada em preto é a região do genoma a ser eliminado no mutante. (C) sítios do genoma que são amplificados por PCR. A "região de flanqueamento (indicada a azul) e 3 '5 região flanqueadora (indicados a vermelho) são amplificados com os locais de endonucleases de restrição para clonagem em pUC19. A 5 '(ou 3') região flanqueadora é excisado de pUC19 e inserido no pUC19 + 3 '(ou 59;) flanqueando plasmídeo região para gerar o plasmídeo B. (D) A NPT1 / cassete sacB de pUM24 é extirpado através de Bam HI digestão e inserido entre 5 'e 3' flanqueando regiões para gerar o plasmídeo A. Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.

Resultados

O plasmídeo concepção é crítica para a geração bem sucedida de ambos os mutantes marcadas e não marcadas. A Figura 1 dá um exemplo do plasmídeo A e B usadas para gerar um mutante de deleção nos genes de Synechocystis cpcC1 e cpcC2 ^13. Em cada caso, as regiões f lanqueadoras 5 'e 3' são aproximadamente 900-1.000 pb. flanqueando reduzidas pode ser utilizado, embora o menor temos testadas com sucesso tem sido aprox...

Discussão

Os passos mais críticos na geração de mutantes não marcados são: 1) um projeto cuidadoso plasmídeo para garantir que apenas a região de destino é alterada; 2) garantir que as amostras permanecem axênico, especialmente quando cultivadas em sacarose; 3) para a geração de células chapeamento mutante marcada inicialmente transformado em placas de agar BG11 falta antibióticos, seguido por adição de ágar antibióticos mais 24 horas mais tarde; 4) cultura marcada mutantes para 4 dias completos antes de plaqueam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaNO3	Sigma	S5506
MgSO4.7H2O	Sigma	230391
CaCl2	Sigma	C1016
citric acid	Sigma	C0759
Na2EDTA	Fisher	EDT002
H3BO3	Sigma	339067
MnCl2.4H2O	Sigma	M3634
ZnSO4.7H2O	Sigma	Z4750
Na2MoO4.2H2O	Sigma	331058
CuSO4.5H2O	Sigma	209198
Co(NO3)2.6H2O	Sigma	239267
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
K2HPO4	Sigma	P3786
Na2CO3	Fisher	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO3	Fisher	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
cyanocobalamin	Sigma	47869
Na2S2O3	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Sucrose	Fisher	SUC001
Petri dish 90 mm triple vented	Greiner	633185
0.2 µm filters	Sartorius	16534
100 ml conical flasks	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
Phusion high fidelity DNA polymerase	Phusion	F-530
Agarose	Melford	MB1200
DNA purification kit	MoBio	12100-300
Restriction endonucleases	NEB
T4 ligase	Thermo Scientific	EL0011
Luria Bertani broth	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Kanamycin sulfate	Sigma	60615
Ampicillin	Sigma	A9518
GeneJET plasmid miniprep kit	Thermo Scientific	K0503
14 ml round-bottom tube	BD falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
425-600 µm glass beads	Sigma	G8772
Glycerol	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Fluorescent bulbs	Gro-Lux	69
HT multitron photobioreactor	Infors