Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Resumo

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Resumo

embriões de peixe-zebra oferecer um sistema experimental ideal para estudar processos morfogenéticos complexas devido à sua facilidade de acessibilidade e transparência óptica. Em particular, o alongamento do corpo posterior é um processo essencial do desenvolvimento embrionário, através da qual múltiplos deformações tecido agir em conjunto para dirigir a formação de uma grande parte do eixo do corpo. A fim de observar esse processo por meio de imagens de lapso de tempo de longo prazo, é necessário utilizar uma técnica de montagem que permite um apoio suficiente para manter amostras na orientação correta durante a transferência para o microscópio e aquisição. Além disso, a montagem também deve proporcionar liberdade suficiente de movimento para a excrescência da região do corpo posterior, sem afectar o seu desenvolvimento normal. Finalmente, deve haver um certo grau de versatilidade do método de montagem para permitir a imagiologia em diversas imagem set-ups. Aqui, apresentamos uma técnica de montagem para a imagiologia do desenvolvimento de posterior elongatio corpon no peixe-zebra D. rerio. Esta técnica envolve a montagem de embriões de tal forma que as regiões da cabeça e do saco vitelino são quase inteiramente incluídas no agarose, deixando de fora região do corpo posterior para alongar e desenvolver normalmente. Vamos mostrar como isso pode ser adaptado para microscopia de luz folhas na vertical, invertida e vertical set-ups. Embora este protocolo centra-se na montagem de embriões para a imagem latente para o corpo posterior, poderia ser facilmente adaptado para a imagem ao vivo de vários aspectos do desenvolvimento do peixe-zebra.

Introdução

Posterior alongamento corpo é um processo essencial do desenvolvimento embrionário em que o embrião se estende de modo a formar uma grande parte do eixo do corpo. É um exemplo de um processo morfogenético complexo, através da qual vários comportamentos de células agir coordenadamente para gerar a morfogénese no nível de tecidos individuais. Estas deformações tecido diferencial, em seguida, actuar em conjunto para gerar o alongamento do corpo posterior em todo o nível da estrutura. Para entender como esses processos são controlados e coordenados durante o desenvolvimento, que deve ser capaz de seguir esses processos em múltiplas escalas (ou seja, no nível de moléculas, células, populações de células e tecidos) e relacionar esta diretamente para a morfogênese de toda a estrutura .

embriões de peixe-zebra são ideais para imagiologia alongamento posterior do corpo como a sua transparência óptica e pequeno tamanho permite a aplicação de luz de imagens minimamente invasiva abordagens bem adequado para live imagiologia. ¹ Isto foi evidenciado por uma série de publicações recentes que lançaram luz sobre o desenvolvimento corporal posterior ao nível de moléculas, ² células individuais, ³ e inter-tecidos comportamentos, ^4, bem como ao nível da população celular e órgão inteiro. ⁵

técnicas de imagem avançadas, como confocal, microscopia multi-fotão e microscopia de iluminação avião seletiva (SPIM) estão permitindo que a imagem a longo prazo dos processos de desenvolvimento, com efeitos de toxicidade luz e foto-branqueamento diminuiu. técnicas robustas para a montagem de amostras vivas são necessárias para atingir três objectivos: 1) um apoio suficiente para manter as amostras na orientação correcta, durante a transferência para o microscópio e durante a aquisição, 2) liberdade de movimento suficiente da amostra para permitir a excrescência de a região do corpo posterior sem afectar a sua devel normaisvolvimento, e, finalmente, 3) um certo grau de versatilidade do método de montagem para permitir a imagiologia em diversas imagem set-ups.

Este protocolo apresenta uma técnica de montagem para a imagiologia do desenvolvimento do peixe-zebra D. rerio. Esta técnica envolve a montagem de embriões de tal forma que as regiões da cabeça e do saco vitelino são quase inteiramente incluídas na agarose, deixando região do corpo posterior para alongar e desenvolver normalmente. Como tal, também é um método adequado para a imagiologia de longo prazo de outras regiões do corpo em desenvolvimento como a agarose permite imagiologia por meio de técnicas de imagiologia de luz padrão. Este protocolo demonstra a montagem de embriões em uma orientação lateral, embora também seja possível a montagem em orientações embriões alternativos. Ela vai mostrar ainda mais como adaptar o método para configurações de microscopia na vertical, invertida e verticais de luz folhas.

Protocolo

1. Preparação de Soluções e puxou vidro Needle

1. Adicione uma solução de estoque de 25x tricaina (3-amino éster de etilo do ácido benzóico, também chamado de acetato de 3-aminobenzoato de metilo) a 4 mg / mL em Tris 20 mM, pH 8,8 e trazer esta solução é a pH 7. alíquota, de 4 ml e armazenar a -20 ° C.
   NOTA: O tricaina anestésico actua preferencialmente nos canais de sódio dependentes da voltagem neurais bloqueando assim espasmos musculares e movimento ^6.
2. Adicione uma solução de trabalho de tricaina a uma concentração final de 0,17 mg / mL em meio de embrião E3. ⁷
   NOTA: Faça o tricaina solução de trabalho de improviso como o pH desta solução deriva.
3. Dissolve-se o de agarose de baixo ponto de fusão até uma concentração final de 1,5% em meio de embrião E3, em um tubo de 50 ml por aquecimento da solução em um forno de microondas. Deixe que esta solução se equilibrar a 42 - 45 ° C em qualquer um banho de água ou de bancada incubadora. Se preparando grandes pratos para verticaisluz folhas de imagem (passo 4), faça um adicional de 25 mL de 1% de fusão padrão de agarose em meio embrião E3.
4. Use o vidro de borosilicato com capilares de filamentos com dimensões de OD 1,20 mm, 0,69 mm ID, comprimento 10 mm.
5. Se capilares são puxados sobre o tipo de aquecimento-filamento extrator de agulhas descrito na Tabela de equipamentos e reagentes, use as seguintes configurações: Calor 600, Pull 120, Velocity 50, Tempo 225, Pressão 500. Com um par de fórceps afiadas, ruptura a agulha apenas após o ponto em que se flexiona para criar uma agulha limpa e nítida para orientar os embriões e removendo o excesso de agarose. Um micro-bisturi também pode ser utilizado para remover o excesso de agarose.

2. Incorporação de embriões para Invertido ou Microscopia Vertical

1. Levantar os embriões até o estágio adequado em meio embrião E3. ⁷
2. Na fase necessária, embriões dechorionate com um par de fórceps afiadas debaixo de uma dissecção binocularmicroscópio ting.
3. Incubar os embriões dechorionated para, pelo menos, 5 minutos na solução de trabalho tricaina.
4. Uma vez que a solução de agarose fundida foi arrefecida até 45 ° C, utilizar uma pipeta de Pasteur de vidro para transferir o embrião dechorionated directamente para o tubo de 50 ml com transferência mínima de meio E3.
5. Remover embrião em conjunto com cerca de 1 ml de meio de montagem e adicionar aprox. 100 ul de meio de montagem em conjunto com o embrião ao círculo central de uma placa de Petri com fundo de vidro com 35 milímetros de micropoços de 10 mm.
6. À medida que o meio de montagem é a criação, mover o embrião para a borda do círculo de agarose com a cauda virada para fora (Figura 1A). Usar a agulha capilar para manter o embrião na orientação lateral desejada até que o gel é completamente definido. Para a imagem desenvolvimento corporal posterior, ter o cuidado de orientar o embrião de uma orientação que de lateral possível. Assim, manter o embrião nesta posição por adjustmen cuidadosasst com a agulha capilar.
   NOTA: Múltiplos embriões podem ser adicionados ao prato de montagem neste ponto, se necessário. Se este for o caso, a transferência da agarose de baixa fusão no primeiro prato e adicionar os embriões para o centro da gota de agarose. Em seguida, empurrar os embriões para as extremidades do anel de vidro e orientação para a posição desejada. Até seis embriões pode ser montado desta maneira antes da agarose torna-se solidificou.

3. remoção do excesso de agarose em torno do corpo Posterior

NOTA: Esta seção descreve o procedimento pelo qual agarose é removido da região em torno do corpo posterior. No caso do alongamento do corpo posterior, é importante para garantir que a cauda podem crescer-out normalmente. Ao remover a agarose após o embrião tenha sido completamente incluídos por agarose, o embrião é deixado fechado pela região da cabeça e aproximadamente metade do saco vitelino.

1. Uma vez que a queda de agarose definiu, inundar o petri dish com a solução de trabalho tricaina.
2. Sob um microscópio de dissecação binocular com uma base de luz de transmissão, ajustar a posição do espelho e o ângulo de luz incidente de tal forma que o contraste forte permite que os cortes na agarose para ser visto claramente por meio da operação.
3. Para executar corte 1 (Figura 1), utilizar a agulha capilar ou o micro-bisturi para cortar a meio caminho de agarose ao longo da gema, a partir de uma posição imediatamente posterior ao campo do coração formando para a posição de somito 5 (a 5 ^th somite anterior).
4. Inicie o corte inicial adjacente ao coração formando como mostrado, e a forma total através da agarose ao vidro.
5. Mantenha o capilar ou micro-escalpelo nas profundezas da agarose, e, lentamente, viu cima e para baixo, enquanto começando a fazer um longo corte sobre o embrião como mostra a Figura 1. Cortar o mais perto do embrião quanto possível, sem perfurar o embrião ou gema.
6. Em seguida, fazer cortes 2 e 3 (Figura 1 ), A partir da posição contra o embrião e com o corte indo todo o caminho até o fundo de vidro prato. Adicione corte 2, de modo que é tangencial aos primeiros 5 somitos, permitindo dorsalward desdobramento completo do corpo posterior. Adicione cortar 3 a um ângulo de 90 ° com a superfície da gema e a partir da HEARTFIELD.
   NOTA: o corte de agarose até que a extremidade do círculo de vidro (como se mostra na Figura 1) auxiliares na remoção da agarose como um bloco completo (passo 3.6). No entanto, isso não é necessário.
7. Começando na intersecção dos cortes 1 e 3, fazer um corte diagonal lento no final do corte 2 enquanto levanta-se lentamente para cima, a fim de desalojar o quadrado de agarose em torno do corpo posterior.
   Notas: Em alguns casos, este será lançado em um bloco e a conclusão da operação de uma só vez. Em outros, pode levar várias tentativas para dis-lodge toda a agarose em torno do embrião.
8. Com um par de pinças cortantes, remover o b desalojadomechas de agarose a partir do meio do embrião. Para ajudar neste processo, movimentar as peças de agarose para o lado do prato e usar a parede da placa de Petri como suporte de elevação enquanto os pedaços de agarose.

Figura 1: Diagrama de montagem set-ups. (A) O diagrama mostra a posição do embrião montado no interior do anel central de vidro numa placa de Petri. À direita é um zumbido do embrião com cada corte sucessivo através do circunda agarose mostrado com linhas vermelhas dottted. (B) Os embriões montados é diagramado em vista lateral exibindo a facilidade de acesso para ambos os objetivos invertidos e verticais. (C) A digram semelhante mostrando como os embriões podem ser montado para imagiologia folha de luz vertical set-ups. Por favor click aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. Se espasmos musculares não está completamente bloqueada nesse ponto, adicionar gotas de tricaina a partir da solução stock de 4 mg / ml, pH 7.

4. Montagem de embriões para Luz folhas Vertical Microscopia

NOTA: Esta é uma variação do método descrito acima, que permite o acesso de múltiplos objetivos para geração de imagens de amostras por SPIM verticalmente orientada. A ideia subjacente a esta variação é a de elevar a amostra ligeiramente maior do que o fundo do recipiente, para permitir o fácil acesso de dois objectivos de imagem.

1. Antes da amostra de montagem, um revestimento 100 milímetros placa de petri de plástico com 1% de agarose em forma E3 a uma altura de 5 mm e deixar solidificar.
2. Colocar uma gota de 1 ml de agarose de baixo ponto de fusão para o centro do prato e deixar solidificar.
3. embriões incorporar em agarose de baixo ponto de fusão como no ponto 2. No entanto, este tempo, retire o embrião a partir do tubo de 50 mlde agarose com uma queda menor de solução (0,5 ml) e colocar esta pequena gota no topo de 1 ml a cair no centro do prato.
4. Usar a agulha capilar para colocar o embrião no centro da pequena gota e manter a sua orientação correcta até gel é definido.
5. Inundar o prato com solução de trabalho tricaina e remover o excesso de agarose, como na seção 3, mas sem cortar a almofada de 1% de agarose padrão.

Resultados

O protocolo descrito acima detalha uma técnica versátil para a montagem de embriões de peixes-zebra para imagiologia de lapso de tempo de longa duração. Um exemplo disto é mostrado na Figura 2A e na animação / vídeo Figura 1. Os embriões foram injectados no estádio de uma célula com o ARNm que codifica a proteína fluorescente photoconvertible kikumeGR. Na fase de 15 somito eles foram montados como descrito acima e trabalhada durante 12 horas...

Discussão

Esta técnica de montagem permite que embriões que permanecer estática durante a transferência para o microscópio e mais experimentos com imagens de lapso de tempo de longo prazo destinadas a seguinte alongamento do corpo posterior em várias escalas de comprimento. Além disso, é versátil na medida em que permite a imagem em microscopia invertida na vertical e fixados-ups, e uma sugestão é feita para como isto pode ser ainda adaptado para SPIM orientada verticalmente.

Um passo essen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo