Exposição do SNC porco para análise histológica: A manual por decapitação, crânio de abertura, e Cérebro Remoção

Resumo

O objectivo deste trabalho e vídeo de instruções é descrever como a expor e remover o cérebro de porco e glândula pituitária pós-morte num estado intacto, adequado para análise macroscópica e histológica subsequente.

Resumo

Os porcos têm se tornado cada vez mais popular em grande animal investigação translacional neurociência como um substituto economicamente e eticamente viável para primatas não-humanos. O tamanho grande do cérebro do porco permite o uso de geradores de imagens cerebrais clínica convencionais e a utilização directa e testes de procedimentos e equipamentos neurocirúrgicos de clínica humana. Uma análise mais aprofundada macroscópico e histológico, no entanto, requer exposição post-mortem do sistema de porco nervoso central (SNC) e subsequente remoção do cérebro. Esta não é uma tarefa fácil, como o porco SNC é encapsulado por uma cabeça dura, ósseo e da coluna vertebral. O objectivo deste trabalho e vídeo de instruções é descrever como a expor e remover o cérebro de porco post-mortem e a glândula pituitária num estado intacto, adequado para análise macroscópica e histológica subsequente.

Introdução

estudos de neurociência de translação em suínos têm se tornado cada vez mais popular durante as últimas duas décadas. O grande tamanho do cérebro de porco permite o uso de geradores de imagens cerebrais clínica convencionais e a utilização directa e os ensaios de procedimentos neurocirúrgicos e equipamento de clínica humana ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.} Nos últimos 20 anos, porcos, especialmente porcos chineses (por exemplo, Gottingen minipig), foram usadas para examinar as modalidades de tratamento neuromoduladores, tais como transplante de células estaminais; transfecção de vector viral; e estimulação cerebral profunda dirigida para a doença de Parkinson, obesidade, depressão, doença de Alzheimer e ^{2, 6,}= "refex"> ^{9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Esta foi seguida pelo desenvolvimento de abordagens cirúrgicas estereotáxicas e para manipular o minipig SNC ^{3, 18, 19, 20, 21.} As alterações do sistema nervoso central instituídos foram avaliadas em animais vivos utilizando imagiologia cerebral (PET ^{10, 13, 22, 24} e ²³ MR), cistometria ^{11, 12, 25,} a análise da marcha^17, a avaliação neurológica ^{9, 17,} e exame pós-morte com base na histologia e análise estereologia ^{14, 15, 17, 26, 27, 31.} No entanto, a análise post-mortem requer a exposição e a remoção do cérebro de porco, que não é uma tarefa fácil, como uma cabeça dura, ósseo e uma dura-máter fibrosa que cobre rodeiam o cérebro de porco.

O objectivo deste trabalho e vídeo de instruções é descrever como o cérebro de porco post-mortem e na pituitária podem ser expostos e removido em estado intacto em 15-20 min, utilizando instrumentos cirúrgicos não motorizados. O vídeo de instruções e ilustrações fotográficas mostram miniporcos do sexo masculino (idade: 6 meses, peso corporal: 20-25 kg) utilizados para um estudo anatômico na glândula pituitária minipig.

Protocolo

A anestesia dos animais e euthanesia foi realizada em conformidade com o "Princípios de cuidados de animais de laboratório" (publicação NIH No. 86-23, revista 1985) e aprovado pelo Conselho dinamarquês para animal de Ética.

1. Instrumentos

1. Recolher os instrumentos apresentados no vídeo e listadas na Tabela de Materiais.

2. decapitação

NOTA: A anestesia foi induzida através de uma injecção intramuscular de 5 ml de midazolam (5 mg / ml) e 5 ml de cetamina (25 mg / mL). 5-10 minutos mais tarde, quando o animal foi profundamente sedados, uma veia da orelha foi canulada e uma sobredosagem letal (100 mg / kg de peso corporal) com pentobarbital de sódio (200 mg / mL) foi administrada por via intravenosa. Para assegurar que o animal estava completamente sacrificados, o reflexo dor interdigital foi testado como mostrado por Ettrup et al. (2011) ^20. eutanásia completa foi assegurada, conforme descrito noa instrução ética acima e seguido por uma perfusão transcardial com 5 L de solução salina isotónica, tal como demonstrado por Ettrup et al. (2011) ^20. Todos os procedimentos são realizados demonstraram post-mortem, excluindo a necessidade das precauções necessárias para o bem-estar anestesia longo prazo e sobrevivência pós-procedimento.

1. Decapitar o porco por um elevado incisão cervical circular, usando um bisturi cirúrgico, um pouco abaixo do ângulo de mandíbula (Figura 1A).
2. Ainda com o bisturi cirúrgico, continuar a incisão anterior através do tecido mole do pescoço, incluindo a laringe e o esago, até que a coluna vertebral óssea é atingido, aproximadamente ao nível da junção crânio-cervical.
3. Avançar o corte com um bisturi cirúrgico a partir do lado anterior da junção crânio-cervical, acima do arco anterior do atlas, e através da membrana atlanto anterior, expondo desse modo o canal vertebral e da medula espinhal (A Figura 1B). Simultaneamente pedir um assistente para puxar o corpo de porco longe da cabeça de porco para facilitar o acesso entre a base do crânio ea primeira vértebra cervical.
4. Continue a incisão cirúrgica através do saco durai e a medula espinal (Figura 1B). Tomar cuidado especial para assegurar que o corte transversal completo da medula espinal é conseguido.
   NOTA: A incapacidade de realizar a etapa anterior pode resultar em tração indesejada sobre a medula espinhal e do cérebro durante as seguintes etapas do processo de decapitação.
5. Vigorosamente estender a junção cranocervical ao nível da secção (Figura 1C). Ao mesmo tempo, utilizar o bisturi cirúrgico para os restantes secção ligamentos atlanto para soltar a articulação entre os côndilos occipitais e o processo articular superior do atlas. Separar a cabeça do porco do corpo.

Figura 1: Minipig decapitação. Incisão (A) Pescoço (seta, o ângulo da mandíbula). (B) A incisão através dos ligamentos atlanto e da medula espinhal rodeado-dura (SC) na junção craniocervical (C1, arco anterior do atlas; OC, côndilo occipital). (C) A parte posterior da articulação atlanto é libertado por uma extensão vigorosa (setas) ao nível de secção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Crânio Abertura

1. Posicionar a cabeça de porco em uma mesa.
2. Faça uma incisão longitudinal dorsal com um bisturi cirúrgico através da pele e dos tecidos moles subjacente da parte de trás do focinho, sobre o vértice da cabeça, e para baixo através da parte posterior doa região occipital.
3. Expor a parte dorsal e posterior do crânio, removendo o tecido macio localizado lateral à incisão inicial com um bisturi cirúrgico.
4. Libertar o músculo temporal bilateral a partir do crânio (Figura 2A) com um bisturi cirúrgico. Certifique-se de que o osso occipital posterior é limpo de tecidos moles.
5. Utilizar a entrada posterior do forâmen magno para remover o osso occipital com um Kerrison perfurador e osso rongeurs osso e expor o cerebelo coberto-dura (Figura 2B).
6. Retornar para o lado anterior exposta do crânio e selecione um ponto de entrada no osso frontal, mesmo em frente dos olhos. Neste ponto, usar um cinzel osso com um martelo para penetrar o crânio e entrar no seio frontal (Figura 2C).
7. Utilizar a extensão do seio frontal para promover a remoção da lâmina dorsoposterior crânio exterior com um rongeur óssea ou soco e expor o interior, finalâmina crânio ósseo cobrindo o cérebro (Figura 2D).
8. Suavemente abrir o interior lâmina crânio ósseo anteriormente com um martelo e um cinzel osso para expor o cérebro coberto-dura (Figura 2E).
9. Continuar a remoção de osso lateralmente utilizando um cinzel osso e um rongeur osso através do osso temporal e parietal, a fim de libertar a parte dorsoposterior final do crânio, localizada entre as partes já expostas do cérebro e cerebelo coberto-dura (Figura 2F).
   NOTA: Muitas vezes, é possível, durante a etapa final deste processo, para usar o cinzel de abrir o restante do osso do crânio posterior de um lado, como se abre uma porta.

Figura 2: Minipig abertura crânio. (A) Exposição da dorsoposteriosuperfície do crânio r, incluindo a remoção do occipital e temporal do músculo. (B) A remoção do osso occipital (CB, cerebelo coberto-dura; OB, osso occipital; OC, côndilo occipital; e SC, medula espinal). (C) Um martelo e um cinzel osso são utilizadas para penetrar o crânio anteriormente e para introduzir o seio frontal ao nível dos olhos. (D) A extensão do seio frontal (FS) é utilizado para remover o osso do crânio espessa exterior (1), expondo uma lâmina óssea fina interior (2), cobrindo o cérebro. (E) Remoção da lâmina óssea fina, expondo o cérebro coberto-dura (seta). (F) Por fim, um martelo e um cinzel osso são utilizadas para ligar lateralmente o anterior e as aberturas posterior do crânio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. REMOV Cérebroai

1. Use uma pinça cirúrgica para levantar a dura e criar uma incisão perto suave para o seio sagital superior venosa utilizando um bisturi cirúrgico fina (Figura 3A).
2. Use micro-tesoura ou uma dura-faca para abrir ainda mais a dura-máter que cobre a superfície dorsal do cérebro.
   NOTA: cuidado especial deve ser feita quando a remoção da dura-máter correspondente ao tentorium cerebelo (Figura 3B), com a preservação deste folha dural irá impedir a remoção do cérebro posterior.
3. Posicionar a cabeça de porco verticalmente (Figura 3C).
4. Utilizar o cinzel osso ou um dissecador para libertar o cérebro ventroanterior por dissecção romba do bolbo olfactivo do piso coberto de dura-máter da cavidade craniana (Figura 3D).
5. Use um bisturi cirúrgico multa a seção do quiasma exposta (Figura 3E). Expor e secção da haste hipofisária e os nervos oculomotores.
6. Solte o tronco cerebral ventral pela secção do lonervos cranianos WER (Figura 3F), com um bisturi cirúrgico fina. Certifique-se de que o tentorium cerebelar durai foi completamente incisão (Figura 3B), como esta folha da dura-máter, de outro modo atravessam o tronco cerebral durante o processo de libertação.

Figura 3: Remoção do cérebro Minipig. Abertura (A) dural com pinça cirúrgica e uma faca de dura-máter. (B) Cuidados devem ser tomados para inciso completamente a folha de dural (seta), localizado entre o cérebro e cerebelo. (C) A cabeça de porco é posicionado verticalmente para melhor visualização das estruturas da base do crânio e em ordem para a gravidade para ajudar no deslocamento pretendida do cérebro. (D) Um de dissecção ou um cinzel osso é usado para aliviar o bolbo olfactivo por secção romba da dura-covered da base do crânio. (E) A dissecção é continuada numa direcção posterior ao longo da base do crânio para exposição e seccionamento do quiasma óptico (seta), haste infundibular, e nervos oculomotores. (F) A libertação do cérebro é completado com a secção dos nervos cranianos inferiores tal como estas se afastem da superfície ventral do tronco cerebral (III, nervo oculomotor; IV, nervo troclear; V, nervo trigeminal; e VI, abducens nervo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. pituitária Remoção

1. Identificar o talo pituitária e a sua folha dural circundante (da sela diapragma) no andar crânio (Figura 4A).
2. Incisão lateral da folha da dura-máter com a haste hipofisária usando um bisturi cirúrgico fino (Figura 4B).
3. Use um dissector para liberar o poçouitary e levantá-lo para fora da fossa pituitária (Figura 4C).

Figura 4: Minipig remoção da pituitária. (A) A fossa pituitária (*) é identificado no chão crânio (1, bolbo olfactivo; 2, quiasma; e PF, fossa posterior). (B) A cobertura dural (diagphragm selar, (seta)) é incisado lateralmente. (C) A pituitária (seta) é libertado com um dissecador e elevado para fora da fossa pituitária. Escala da barra (AC) = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Para evitar que o material tecido de secar, recomenda-se a armazenar o cérebro removido e pituitária em um frasco cheio com o fixador ou solução salina isotónica imediatamente após análise macroscópica foi realizada. O material de tecido pode ser armazenado no fixador por ano, ao passo que o armazenamento em solução salina isotónica, mesmo no frigorífico, irá conduzir à deterioração do tecido com o tempo.

A pit...

Discussão

A maior parte dos estudos experimentais neuroscience são realizados em espécies animais pequenos, tais como ratinhos e ratos, em que o acesso ao SNC é facilitado por um de espessura da dura-máter e o crânio fina. No entanto, em animais experimentais maiores, como porcos ^{1, 4, 8,} ovinos ^32, e primatas não-humanos, a espessura considerável destas estruturas que requer a utilização de instrumentos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heavy Scalpel Handle #4	FST (Fine Science Tools)	10008-13	Good for skin incision and soft tissue removal
Non-Sterile Scalpel Blades #23	FST	10023-00
Scalpel Handle #7	FST	10007-12	Optimal for dural incision and precision work
Non-Sterile Scalpel Blades #11	FST	10011-00
Surgical Forceps	FST	11024-18	The tip of the surgical forceps ensure a firm grip
Kerrison Bone Punch	Aesculap Neurosurgery	FF713R	Must be robust, bite size 3-5 mm
Bone Rongeur	Aesculap Neurosurgery	MD615	Must be robust, bite size 15 x 5 mm
Bone Rongeur	Aesculap Neurosurgery	FO551R	Must be robust, bite size 25 x 15 mm
Bone Chisel	Lawton	67-0335	The size of the chisel head should not exceed 20 mm
Mallet (Hammer)	Millarco	5624108	Weigth 300 g, length 30 cm, head hit area size 2 x 2 cm
Micro-Scissor	FST	14002-14
Dissector	Aesculap Neurosurgery	OL165R
Göttingen minipigs	Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denmark
Euthanimal			pentobarbital
Ketamine	Pfizer
Midazolam	Hameln Pharmaceuticals