Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas

Resumo

Este manuscrito apresenta métodos para a Análise morfométrica e as mudanças celulares dentro do côndilo mandibular de roedores.

Resumo

Articulação temporomandibular (ATM) tem a capacidade de adaptação a estímulos externos, e carregar as alterações pode afetar a posição dos côndilos, bem como os componentes estruturais e celulares da cartilagem condilar mandibular (MCC). Este manuscrito descreve métodos para analisar estas mudanças e um método para alterar o carregamento da TMJ em camundongos (i.e., à compressão estática TMJ carregando). A avaliação estrutural ilustrada aqui é uma abordagem simples morfométricos que usa o software Digimizer e é executada em radiografias de ossos pequenos. Além disso, a análise de celulares muda levando a alterações na expressão do colágeno, a remodelação óssea, a divisão celular, e proteoglycan distribuição no MCC é descrita. A quantificação dessas mudanças em cortes histológicos - contando os pixels fluorescentes positivos usando imagem de software e o mapeamento de distância de medição e manchado área com Digimizer - também é demonstrado. Os métodos mostrados aqui não são limitados a TMJ murino, mas podem ser usados em ossos adicionais de pequenos animais experimentais e em outras regiões de ossificação endocondral.

Introdução

A TMJ é uma articulação de carga exclusiva localizada na região craniofacial e é formada de fibrocartilagem. O MCC da TMJ é essencial para a função da articulação, incluindo o movimento da mandíbula sem impedimentos ao falar e mastigar, mas geralmente é afetado por doenças degenerativas, incluindo osteoartrite¹. A TMJ tem a capacidade de adaptação a estímulos externos e alterações de carga, levando a alterações estruturais e celulares para os componentes do MCC^2,3,4,5. As propriedades de carga do MCC podem ser explicadas pelas interações entre seus componentes, incluindo a água, a rede de colágeno e densamente proteoglicanos. O MCC tem quatro zonas distintas de celulares que expressam diferentes tipos de proteínas de colágeno e não-colágeno: 1) a zona superficial ou articular; 2) a zona proliferativa, composta de células mesenquimais indiferenciadas e que responde ao carregar as demandas; 3) a zona de prehypertrophic, composto de condrócitos maduros expressando colágeno tipo 2; e 4) a hipertrófica de zona, a região onde os condrócitos hipertróficas expressando colágeno tipo 10 morrer e sofrer calcificação. A região não-mineralizado é rica em proteoglicanos que proporcionam resistência a forças compressivas⁶.

Há contínua mineralização na zona hipertrófica do MCC, onde ocorre a transição da condrogênese a osteogênese, garantindo a robusta estrutura mineral do osso subcondral do côndilo mandibular⁷. As mudanças celulares em regiões não mineralizadas e mineralizadas, finalmente, levam a alterações morfológicas e estruturais no côndilo mandibular e maxilar inferior. Manutenção da homeostase de todas as regiões celulares do MCC e a mineralização da parte subcondral são essenciais para a saúde, capacidade load-bearing e integridade da TMJ.

O modelo de rato transgénico colágeno múltipla (como descrito por Utreja et al) ⁸ é uma ótima ferramenta para usar para entender mudanças na expressão do colágeno, porque todos os transgenes são expressas em MCC. Para uma avaliação aprofundada e histológica, manchas histológicas são utilizadas para estudar a deposição de matriz, mineralização, proliferação celular, apoptose, e expressão de proteínas para as camadas de células diferentes do MCC.

Neste manuscrito, histológico e análises morfométricas são usadas para avaliar as alterações estruturais e celulares no MCC e subcondral osso do côndilo mandibular de ratos. Além disso, um método de quantificação de célula, para a análise de imagens histológicas fluorescentes e para mapear as corrediças do microscópio de luz, é descrito. A TMJ estática à compressão carregando o método, que provoca alterações celulares e morfológicas na MCC e subcondral osso⁹, também é ilustrada para validar nossos métodos.

Os métodos descritos aqui podem ser usados para determinar morfométricos e as alterações histológicas no côndilo mandibular e maxilar inferior de roedores ou para analisar outras regiões de ossificação endocondral e a morfologia dos tecidos mineralizados adicionais.

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Protocolo

Comitê institucional cuidados de animais do centro de saúde da Universidade de Connecticut aprovou todos os procedimentos de animais.

1. compressão estática TMJ carregamento: Boca forçada a abrir

Nota: Ratos transgénicos quatro semanas de idade, abrigando fluorescentes repórteres para colágeno (Col2a1XCol10a1), gentilmente cedidos pelo Dr. David Rowe (Universidade de Connecticut), foram utilizados para os experimentos descritos neste manuscrito (n = 8; 4 machos e 4 fêmeas). O transgene de Col2a1 ciano (azul) é expressa em células na zona prehypertrophic do MCC, enquanto o Col10a1 cereja (vermelhas) células estão presentes na região hipertrófica⁸ (Figura 1). Os ratos foram igualmente divididos em dois grupos: grupo 1) do carregado, onde os ratos foram submetidos a compressiva TMJ estática de carga (descrito no passo 2) e 2) o grupo de controle, onde os ratos não receberam nenhuma intervenção.

Figura 1. Representante sagital do côndilo do mouse duplo-colágeno repórter fluorescentes (Col2a1XCol10a1). Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Fabrica molas usingbeta arcos de liga de titânio (0,017 x 0.025 in)(Figura 2).
2. Anestesia os animais experimentais por uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (90 mg/kg de peso) e xilazina (13 mg/kg de peso corporal).
3. Delicadamente, abra a boca dos ratos e inserir as molas, os loops de engajar-se nos incisivos maxilares e mandibulares (Figura 2B e C).
4. Induzi o carregamento de TMJ estático à compressão, mantendo as molas nos incisivos de ratos anestesiados por 1 h. Repita este procedimento para 5 dias.
5. Injete os ratos com 5-ethnyl-2'-desoxiuridina (EdU; 30 mg/kg de peso corporal) intraperitonealmente para análise de proliferação celular 2 dias e 1 dia antes da eutanásia.

Figura 2. Compressiva carregamento estático de TMJ: forçada de boca aberto modelo. (A) mola fabricada de 0,017 x 0.025 arco de liga de titânio beta. (B) rato carregado com mola. (C) radiografia do carregado e ratos controle, mostrando diferenças no posicionamento da mandíbula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. fixação e dissecação de mandíbula

1. No ponto de extremidade dos procedimentos forçado-abrir boca, eutanásia em animais experimentais por um método aprovado.
2. Disse as mandíbulas cortando a fixação muscular sem raspagem da cartilagem do côndilo.
3. Coloque as mandíbulas limpas em formol a 10% por 24 h para fixação.
   Atenção: O formol é um irritante; Use equipamento de protecção adequado.

3. imagem latente e medidas morfométricas de raio-x

1. Coloque as mandíbulas num recipiente plano (por exemplo, por 55 x 16 mm placa de Petri) e tirar radiografias das amostras usando um sistema de raio-x do armário em um 26 kV para 5 s.
   Nota: Coloque uma barra de escala antes de salvar as imagens.
2. Executar medidas morfométricas as mandíbulas usando um software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais).
   Nota: Antes de realizar qualquer medição, use a barra de escala da radiografia para determinar a unidade. Esta etapa é importante medir adequadamente as estruturas anatômicas. Clique no botão de "Unidade"(Figura 3).
3. Selecione os pontos anatômicos usando o "estilo de marcador 2" no software da imagem latente (Figura 3B). Para seguir o método descrito neste documento, selecione os seguintes pontos (Figura 3B):
   1. Selecione o condylion (ponto 1), o ponto mais posterior do côndilo mandibular;
   2. Selecione o processo incisivo (ponto 2);
   3. Selecione o ponto mais profundo no entalhe sigmoide (ponto 3);
   4. Selecione o ponto mais profundo na concavidade do ramo mandibular (ponto 4);
   5. Selecione o ponto mais anterior da superfície articular condilar (ponto 5); e
   6. Selecione o ponto mais posterior da superfície articular condilar (ponto 6).
4. Depois de selecionar os pontos anatômicos, executar medidas morfométricas, usando a ferramenta de "comprimento", mas para o comprimento da cabeça do côndilo, use a ferramenta "linha perpendicular" de pontos (3) e (4) (Figura 3C).
   1. Medir o comprimento mandibular, desde o condylion (1) para o processo de incisivo (2).
   2. Medir o comprimento da cabeça côndilo - a distância perpendicular da condylion (1) a uma linha traçada a partir do ponto mais profundo no entalhe sigmoide (3) para o ponto mais profundo na concavidade do ramo mandibular (4).
   3. Medir a largura da cabeça de côndilo - a distância entre a maioria anterior o ponto mais posterior da superfície articular condilar (5-6).
   4. Copie as medições da lista"medição" do lado direito da tela (Figura 3C).

Figura 3 . Representação de medidas morfométricas da mandíbula. (A) Use a barra de escala da radiografia para determinar a unidade (circulado em vermelho, barra de escala: 10 mm). (B) selecione os pontos anatômicos usando o "estilo de marcador 2" (circulado em vermelho). 1) Condylion; 2) processo incisivo; 3) ponto mais profundo no entalhe sigmoide; 4) ponto mais profundo na concavidade do ramo mandibular; 5) a maioria dos ponto anterior da superfície articular condilar; 6) ponto mais posterior da superfície articular condilar. Barra de escala: 10 mm.(C) realizar medições com o "comprimento" e "perpendiculares" ferramentas (circuladas em vermelho). Medições do ponto 1 e 2: comprimento mandibular; do ponto 5 e 6: largura condilar; perpendicular do ponto 1 ao 4 - 3: comprimento da cabeça condilar. Salvar as medições na "lista de medição". Barra de escala = 10 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. côndilo incorporação

Nota: Depois de tomar as imagens radiográficas, as mandíbulas podem ser incorporadas e seccionadas para análise histológica.

1. Coloque suas mandíbulas undecalcified (que foram corrigidas no passo 2.3) em 30% de sacarose em PBS durante a noite antes da incorporação.
2. Dissecar qualquer excesso de tecido mole e corte com cuidado o côndilo mandibular.
3. Despeje a resina encastre (suficiente para cobrir a amostra) em moldes de plástico descartável e coloque a face medial do côndilo contra a base do molde, posicionamento da amostra paralela à parte inferior do molde.
4. Fixe a amostra no lugar correto com um pedaço de gelo seco.
5. Encher o molde com incorporação de resina e coloque o molde com amostra fixa no frio 2-metil-butano, que pode ser pre-refrigerados em um congelador-20 ° C ou -80 ° C ou em gelo seco.
6. Armazene as amostras a-20 º C ou a-80 ° C até seccionamento.

5. côndilo corte sagital e preparação de Slide

1. Criar seções sagitais congeladas dos côndilos (5-7 µm) e transferir as amostras para o slide usando o método de transferência do fita^10,11.
2. Aderir os transferiu para a fita usando o método UV-curable¹⁰cortes histológicos.

6. histológica coloração e imagem microscópica

Nota: A maioria da coloração histológica é executada conforme descrito na seção histológica do papel por Dyment et al.¹⁰.

1. Para a digitalização da linha de base, o primeiro passo é a imagem de Col2a1 e Col10a1 transgenes, conforme descrito por Dyment et al.¹⁰ .
   1. Coloque as lamelas em cima dos slides em 30% de glicerol e PBS. Execute o microscópio fluorescente da ofthesectionswitha da linha de base de imagem e filtros adequados.
2. Execute a coloração da fosfatase ácida tartarato-resistente fluorescente (armadilha).
   Nota: A armadilha é expresso pelas células hematopoiéticas, incluindo o osso resorbing células, osteoclastos¹². O propósito desta mancha é analisar o MCC e remodelação de osso subcondral.
   1. Remova a lamela dos slides mergulhando-os em PBS. Lave as lâminas em PBS três vezes por 5 min cada.
   2. Prepare o buffer de armadilha 1 pela dissolução de acetato de sódio anidro (9,2 g) e sódio L-tartarato dibásico dihidratado (11,4 g) em 1 litro de água destilada. Ajustar o pH a 4.2 com ácido acético e armazenar buffer armadilha 1 a 4 ° C.
   3. Prepare o tampão de armadilha 2 dissolvendo-se recentemente de nitrito de sódio (40mg) em 1 mL de água destilada.
   4. Prepare o tampão de substrato de armadilha (antes de coloração) misturando-se 7,5 mL de tampão 1 e 150 µ l de tampão de 2. Aplica esta solução (200 µ l) de cada slide para 10 min à temperatura ambiente.
   5. Preparar o amortecedor da reação armadilha misturando 1,840 mL de tampão de substrato e 23 µ l de substrato fluorescente (ver a Tabela de materiais).
      Nota: O substrategeneratesayellowfluorescentsignal fluorescente para atividade de armadilha.
   6. Retire o tampão de substrato de armadilha excesso pipetando suavemente a solução.
   7. Incube as lâminas com 200 µ l de tampão de reação armadilha para 5 min sob luz negra UV fonte bulbo.
   8. Lave as lâminas em PBS três vezes por 5 min cada.
   9. Coloque as lamelas nos slides em 30% de glicerol em PBS e executar imagens microscópicas¹⁰.
3. Execute a coloracao de proliferação celular.
   Nota: Neste ensaio, a timidina modificados analógico 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) incorporado ao DNA recém sintetizado: Divisão de células são rotuladas com um corante fluorescente.
   1. Depois da imagem latente para a armadilha, remover as lamelas e lavar os slides em PBS, três vezes por 5 min cada. Siga os passos do kit de proliferação celular 5-ethynyl-2'-desoxiuridina manchar os cortes histológicos.
   2. Preparar uma reação cocktail adicionando 430 µ l de 1 X 20 µ l de CuSO₄amortecedor da reação, 1,2 μL de tintura fluorescente e 50 µ l de 1 X buffer aditivo (um volume total de 500 µ l é suficientes para um slide).
      Nota: O fabricante recomenda adicionando os ingredientes na ordem descrita aqui.
   3. Incube os slides com os coquetéis preparados por 30 min à temperatura ambiente, protegida da luz.
   4. Lave as lâminas em PBS três vezes por 5 min cada.
   5. Coloque as lamelas em cima dos slides em 30% de glicerol em PBS com 1:1,000 DAPI.
      Nota: DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) é uma mancha nuclear fluorescente azul que vincula a regiões de AT-rico em DNA.
4. Execute a coloração azul de toluidina (TB).
   Nota: TB coloração revela a distribuição proteoglycan no MCC.
   1. Enxágue o indistilledwater de slides para remover as lamelas.
   2. Depois de retirar as lamelas, lave as lâminas em água destilada três vezes por 5 min cada para remover completamente os sais da PBS.
   3. Preparar o tampão de trabalho TB, tornando a solução (dissolver 28,4 g de fosfato de sódio dibásico em 1 litro de água destilada) e solução B (dissolver 27,6 g de fosfato de sódio monobásico em 1 litro de água destilada). Mix 94,7 mL da solução A com 5,3 mL de solução B. dilua esta solução 1:1 em água destilada para fazer 200 mL de 0,1 M de tampão a trabalhar. Corrigi o pH para 8,0 pela adição de hidróxido de sódio até que o pH é fixo.
   4. Prepare-se 1% das ações TB: misturar 1 g de TB em 100 mL de água destilada.
   5. Prepare a solução de trabalho TB misturando 40 mL de tampão de trabalho 0,1 M em 3 mL de 1% das ações TB.
   6. Incube as lâminas na solução trabalho TB para s 14-17.
      Nota: Esta mancha é tempo muito sensível; o tempo de incubação pode precisar de ser ajustado para evitar a overstaining.
   7. Lave as lâminas em água destilada três vezes por 5 min cada.
   8. Lugar de lamelas em cima dos slides em glicerol 30% em água destilada. Execute o microscópio óptico de imagem¹⁰.
      Nota: Fazer não lamela as lâminas coradas por TB em glicerol + PBS. PBS lava para fora este tipo de mancha.

7. fluorescente quantificação histológica

1. Realizar quantificação histológica de imagens fluorescentes usando um software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais).
   Nota: O princípio básico da quantificação histológica neste método é dividir o número de pixels fluorescentes de interesse pelo número total de pixels da área de interesse e multiplique o número obtido por 100, resultando em um percentual de positivos pixels dentro dessa região.
2. Realize a quantificação da expressão de Col10a1 o MCC de secções sagitais dos côndilos.
   1. Quando quantificar todos os tipos de células e manchas usando esse método, selecione a área a ser quantificada. Abra as imagens histológicas em um software de análise de imagem e selecione a área usando o "Lasso Tool (L)"(Figura 4). Para a análise descrita aqui, selecione a região do MCC Depois de selecionar a área, o número total de pixels será mostrado na caixa "Histograma" na tela do software(Figura 4). Salve o número de pixels na área de interesse.
   2. Selecione os pixels Col10a1 vermelho usando a ferramenta de amostragem. Clique em "Select" no painel superior e em seguida "Gama de cores". Clique na "ferramenta conta-gotas," Selecione a amostra de cor para o pixel de interesse na imagem e clique em "Okey". Todas as áreas de positivas para a cor do pixel escolhido será selecionado (Figura 4B). Copie o número de pixels fluorescentes (mostrado na caixa "Histograma" da tela) e colá-los em uma planilha ou software estatístico para análise.
   3. Dividir o número de pixels fluorescentes sobre o número de pixels da área de interesse e multiplique esse número por 100: pixéis fluorescentes / pixels na área de interesse * 100.
      Nota: Outro tipo de células, tais como Col2a1 azul, pode ser quantificado com esse mesmo método, mas os pixels azuis devem ser selecionados em vez dos pixels Col10a1 vermelho.

Figura 4 . Representação do transgene Col10a1 quantificação. (A) selecione a área de interesse com o "Lasso Tool" (L). Para as células Col10a1-positivo, selecione a cartilagem mandibular todo. Salve o número de pixels na caixa "histograma". (B) selecione o pixel de interesse, neste caso, o vermelho fluorescente Col10a1 pixels. Observe que apenas os pixels vermelhos dentro da área de interesse serão selecionados. Salve o número de pixels vermelhos da caixa "histograma". Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Realize a quantificação da atividade de armadilha no MCC e subcondral osso.
   1. Siga o procedimento descrito no passo 8.2, mas em vez de apenas selecionar a área MCC, selecione as regiões de osso de cartilagem e subcondral (Figura 5A).
   2. Para a análise da atividade de armadilha, selecionar os pixels amarelos gerados pelo substrato ELF97, conforme descrito na etapa 8.2.2 (Figura 5B); Copie o número de pixels positivos; e colá-los em uma planilha ou software estatístico para análise.
   3. Obter a percentagem de pixels armadilha-positivo dividindo o número de pixels amarelos pelo número total de pixels na região do osso subcondral e multiplicando por 100.

Figura 5 . Representação de quantificação de armadilha fluorescente. (A) selecione a área de interesse (osso mandibular de cartilagem e subcondral) e salvar o número de pixels da região. (B) selecione os pixels fluorescentes amarelos, que representa a atividade de armadilha. Observe que somente de armadilha-positivo pixels serão selecionados. Salve o número de pixels selecionados. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Realize a quantificação de células EdU-positivo.
   1. EdU-manchado slides são counterstained com DAPI, então em vez de contar o número total de pixels na região de interesse, selecione pixels DAPI-positivo para calcular a porcentagem de pixels EdU-positivo. Selecione a área de interesse, conforme descrito na etapa 8,2, mas não salva o número total de pixels. Selecione o pixel DAPI azul como a amostra de cor, conforme descrito na etapa 8.2.2; Copie o número de pixels de DAPI-positivo (Figura 6A); e colá-los em uma planilha ou software estatístico para análise.
   2. Em seguida, selecionar os pixels de EdU-positivo (amarelos fluorescentes pixels) e salve o número de pixels na caixa "histograma" (Figura 6B).
   3. Calcule a percentagem de EdU pixels dividindo o número de pixels de EdU-positivo pelo número de pixels de DAPI-positivo e multiplicar o número obtido por 100.

Figura 6 . Representação de quantificação de EdU. (A) selecione a região proliferativa do MCC (a camada externa da cartilagem). Selecionar pixels DAPI-positivo e salvar o número de pixels. (B) selecionar pixels EdU-positivo (amarelo fluorescente) e salvar o número de pixels. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. quantificação da espessura da cartilagem e distribuição Proteoglycan

1. Analise a espessura da cartilagem (mapeamento de distância) e a área manchada de azul de toluidina usando o software de imagem de Digimizer.
   Nota: Utilize a barra de escala da imagem histológica para determinar a unidade (Figura 7A).
2. Realize uma medição de mapeamento de distância.
   Nota: A medida da distância mapeamento irá fornecer a espessura da cartilagem no côndilo mandibular. O método descrito aqui, são selecionadas cinco regiões do MCC, dando uma média da espessura total do MCC. O pesquisador pode optar por medir três regiões diferentes, ou mesmo uma única região no meio do MCC.
   1. Usando a ferramenta de "comprimento", medir o comprimento da cartilagem da superfície exterior à extremidade da toluidina manchadas de azul área (Figura 7-B) em cinco regiões, ou em locais como muitos como preferencial.
   2. Copie as medições de comprimento na "lista de medição".
      Nota: O software também oferece uma média das medições (Figura 7-B).
3. Meça a área manchada de azul de toluidina.
   Nota: Na medição da área manchada de azul de toluidina, área proteoglycan no MCC será obtida.
   1. Selecione a ferramenta "área" e contorne a área manchada de azul de toluidina (Figura 7-C).
   2. Copie as medições de área na "lista de medição".

Figura 7 : Representação de quantificação de distribuição proteoglicano. (A) Use a barra de escala da imagem histológica para determinar a unidade clicando no botão "unidade" (circulado em vermelha, unidade selecionada: 500 µm). (B) medir a espessura da cartilagem em locais diferentes, usando a ferramenta de "comprimento" (circulada em vermelho). Salve as medições da lista"medição" no painel superior direito. O software também oferece "Estatísticas", no painel inferior direito, então a média e o SD das medições podem ser obtidos diretamente. (C) medir a área manchada de azul de toluidina, usando a ferramenta de "área" (circulada em vermelho). Círculo da área de interesse e salvar a medição na "lista de medição". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Estatísticas descritivas foram realizadas para examinar a distribuição de medidas morfométricas (comprimento mandibular, condilar comprimento, largura condilar) e análise histológica. Os resultados foram comparados entre o grupo carregado (ou seja, ratos submetidos a carga compressiva com a mola de titânio beta) e grupo controle (ou seja, ratos de controle que não recebeu qualquer procedimento de correspondência). Diferenças estatisticamente significativas entr...

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Discussão

Este manuscrito descreve métodos para a medição de morfometria e análise celular dos côndilos mandibulares murino e mandíbulas. As medições radiográficas morfométricas também podem ser usadas para analisar outros ossos de pequenos animais experimentais. Além disso, a análise celular (célula quantificação e mapeamento de distância de cartilagem) não estão limitada a do côndilo mandibular roedor, mas pode ser usado para quantificar a cortes histológicos de tecidos diversos.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MX20 Radiography System	Faxitron X-Ray LLC
Digimizer Image software	MedCalc Software
Shandon Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006
Manual microscope Axio Imager Z1	Carl Zeiss	208562
yellow fluorescent protein filter  - EYFP	Chroma Technology Corp	49003
cyan fluorescent protein filter - ECFP	Chroma Technology Corp	49001
red fluoresecent protein filter - Cy5	Chroma Technology Corp	49009
sodium acetate anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889
sodium L-tartrate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	228729
sodium nitrite	Sigma-Aldrich	237213
ELF97 substrate	Thermo Fisher Scientific	E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit	Life Technologies	C10339	includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Scientific	D1306
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71505
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Adobe Photoshop	Adobe Systems Incorporated
Phosphate buffered saline tablets (PBS)	Research Products International	P32080-100T
CNA Beta III Nickel-Free Archwire	Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc.